Способ проведения полимеразной цепной реакции с произвольным праймером

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ С ПРОИЗВОЛЬНЫМ ПРАЙМЕРОМ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Гузенко Елена Витальевна Лемеш Валентина Александровна Хотылева Любовь Владимировна Богданова Марина Владимировна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ проведения полимеразной цепной реакции с произвольным праймером, включающий последовательное проведение циклов амплификации и реамплификации, отличающийся тем, что цикл реамплификации проводят в реакционной смеси объемом 25 мкл, содержащей в качестве геномной ДНК 1 мкл продукта амплификации, 2,5 мкл ПЦРбуфера, праймер в концентрации 0,2 мкМ, , ,ив концентрациях по 200 мкМ, 2 в концентрации 2,5 мМ и 1,5 единицы -полимеразы, при этом отжиг праймера в цикле реамплификации проводят при температуре, равной температуре отжига в цикле амплификации. 11362 1 2008.12.30 Изобретение относится к области молекулярной генетики растений, а именно к генетическому картированию. Генетические карты, помимо изучения структуры и организации генома, могут быть также использованы в таких направлениях, как идентификация и мечение селекционно-ценных количественных и качественных признаков, клонирование отдельных генов и сравнительное картирование геномов различных видов. В частности, изобретение относится к главному методологическому подходу в подобного рода исследованиях - применению молекулярных маркеров. Изобретение может использоваться для уточнения картины генетического полиморфизма в случаях неопределенности или неоднозначности интерпретации результатов, полученных после проведения полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами(-). Аналогами данного способа исследования являются методы, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР). В основе ПЦР лежит амплификация отдельных фрагментов ДНК с помощью небольшого числа нуклеотидных последовательностей, называемых праймерами. В зависимости от типа праймеров существует несколько методов использования , а именно,,,(),(-) 1. Прототипом по отношению к заявляемому может считаться способ повышения чувствительностиметодом гнезднойамплификации 2. Суть его заключается в последовательном использовании двух пар праймеров - внешней и внутренней. После использования первой пары праймеров продукт амплификации переносят в другую пробирку с внутренней парой праймеров. Иногда вместо гнездной амплификации используют процесс реамплификации. В этом случае проводят дополнительный раунд амплификации, в котором используют прежнюю пару праймеров, а в качестве ДНК-мишени продукт первой реакции амплификации. Такая схема постановки амплификации более трудоемка и требует особенно тщательного обустройства лабораторных помещений, позволяющих гарантированно избегать контаминации продуктами реакции после использования внешней пары праймеров. Также известен способ повышения эффективностианализа 3, 4. Он заключается в проведении повторной амплификации (реамплификации) при следующих условиях в качестве геномной ДНК используется продукт амплификации первого цикла, используется тот же -праймер, но увеличивается температура отжига с 55 С в первом цикле амплификации до 60 С при реамплификации. Температура 60 С является максимальной в диапазоне оптимальных температур отжига -праймеров. В последнее время широко применяется амплификация ДНК с произвольными праймерами - 5. Используя этот метод, можно достаточно быстро выявить вариабельность большого числа локусов по всему геному. Возможность тестирования большого числа локусов одновременно позволяет сопоставлять значительные участки генома, что повышает точность сравнительного анализа и степень выявляемого с помощью -метода генетического полиморфизма. Наряду с явными достоинствами (анонимность последовательностей, незначительные количества ДНК, быстрота и экономичность технологии) этот метод обладает и недостатками, главный из которых состоит в строгом соблюдении оптимизированных условий реакции амплификации. Такие факторы, как концентрация матричной ДНК, концентрация ионов, нуклеотидный состав, длина праймера, оказывают влияние на ход реакции амплификации и должны тщательно контролироваться для получения воспроизводимых результатов 6, 7, 8. Для стандартного - анализа точно определенная оптимальная температура отжига определяет чувствительность амплификации. Ошибка в температуре отжига существенно сказывается на результате амплификации и выражается в уменьшении выхода основного продукта и появлении неспецифического продукта 9. Даже при соблюдении необходимых условий проведения полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами в некоторых экспериментах не только не удается обна 2 11362 1 2008.12.30 ружить полиморфизм, но иногда при сканировании агарозного геля после проведения электрофоретического разделения фрагментов ДНК получают черный снимок, то есть продукты амплификации не проявляются. В связи с этим задача заявляемого способа состоит в повышении эффективности- анализа ДНК, в том числе и в тех случаях, когда введение процедуры дополнительной очистки ДНК органическими растворителями не улучшает качество амплификации. Заявляемый способ направлен на получение четких и воспроизводимых профилей, а также на изменение продуктивности полимеразной цепной реакции в сторону увеличения количества фрагментов и/или увеличения количества полиморфных фрагментов в -спектрах. Для решения поставленной задачи разработана методика проведения - анализа с добавлением процедуры реамплификации. Сущность заявленного способа состоит в том, что после проведения - стандартным способом (реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 20 нг геномной ДНК, 0,2 мкМ праймера, 200 мкМ каждого и , 2,5 мМ 2 и 1,5 единицы -полимеразы в инкубационном буфере) проводится реамплификация. Для реакции реамплификации используется -реакционный продукт из первого цикла (в качестве геномной ДНК). Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 1 мкл продукта реакции амплификации в качестве матричной ДНК (концентрация ДНК не существенна и не влияет на ход реакции), 2,5 мкл -буфера, 0,2 мкМ праймера, 200 мкМ каждого , ,и , 2,5 мМ 2 и 1,5 единицы -полимеразы в инкубационном буфере. Реамплификация проводится в амплификаторе по стандартному протоколу 5. Температура отжига -праймера не меняется. При разработке данного способа мы использовали праймеры, с которыми не смогли получить четких -профилей при проведении амплификации стандартным способом. Подобная амплификация считается неудачной и многие праймеры могут быть отнесены к неперспективным. Реамплификация позволяет изменить ситуацию. В результате проведенных нами исследований установлено, что после добавления процедуры реамплификации в стандартный - анализ четко прослеживаются следующие реамплификационные эффекты 1) увеличивается интенсивность полос, что проиллюстрировано на фиг. 1. На фиг. 1 а представлены -профили (1-14) ДНК-образцов льна после проведения полимеразной цепной реакции стандартным способом (изображение очень слабое). На фиг. 1 б представлены -профили (1-14) ДНК тех же образцов льна после проведения полимеразной цепной реакции с последующей реамплификацией. М-маркер молекулярной массы (1 ). Четко видны полосы. 2) появляются новые полосы и/или новые полиморфные полосы на гелевом образце при сравнении второго цикла с первым, что отображено на фиг. 2, 3. На фиг. 2 представлены -профили (1-5) ДНК-образцов льна после проведения полимеразной цепной реакции стандартным способом, где продукт амплификации ДНК первого (1) образца льна не проявляется. На этой же фигуре представлены -профили(1-5) ДНК тех же образцов льна после проведения полимеразной цепной реакции с последующей реамплификацией, где продукт реамплификации ДНК первого (1) образца льна проявился. М-маркер молекулярной массы (1 ). На фиг. 3 представлены -профили (1-2) ДНК-образцов льна после проведения полимеразной цепной реакции стандартным способом (продукты амплификации ДНКобразцов льна не проявились). На этой же фигуре представлены -профили (1-2) ДНК тех же образцов льна после проведения полимеразной цепной реакции с последующей реамплификацией. Продукты реамплификации ДНК-образцов льна проявились, а также у образца 2 наблюдаются полиморфные полосы. Предложенный нами способ проведения полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами имеет ряд преимуществ получение четких и воспроизводимых -профилей,3 11362 1 2008.12.30 увеличение продуктивности - (получение новых полос и/или новых полиморфных полос),не требует подбора условий проведения стандартной -,позволяет проводить эффективный отбор высокоинформативных -праймеров. Данный способ расширяет возможности -анализа в изучении генетической изменчивости и идентификации генотипов в случаях неопределенности или неоднозначности интерпретации результатов -анализа. Источники информации 1. Малышев С.В., Картель Н.А. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений // Молекулярная биология. - 1997. - 31. -2. -С. 197-208. 2.,..К.-//. - 2004.86. -11. - . 15301533. 3.// - 1995.20. - . 124125. 4.., .-//. 2003.8. . 743748. 5..,.//. - 1990. 18. -24. - . 7213-7218. 6.//. 1996. 9. - . 252-268. 7.,//. . - 1992. 84. - . 567-572. 8..,,.,.,В.,.,., .,.,.,.,//. - 1997. - 15. - . 625628. 9. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях // Научно-методическое руководство / Под ред. Ю.М.Сиволапа. - Киев Аграрная наука, 1998. - 156 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4