Способ лечения сахарного диабета

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА(71) Заявитель Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет(72) Авторы Игнатович Игорь Николаевич Леонович Сергей Иванович(73) Патентообладатель Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет(56)а 20030138, 2004.а 20000014, 2001.3720 С 1, 2000.39046 А, 2001. Игнатович И.Н. Медицинская панорама. - 2002. -4. - С. 12-14. Игнатович И.Н. и др. Труды молодых ученых Сб. научн. работ. - Мн., 2000. С. 104-106. Леонович С.И. и др. Белорусский медицинский журнал. - 2004. -1. С. 55-57. Шотт А.В. и др.съезд хирургов Республики Беларусь. Материалы съезда. Ч. . - Мн., 2002. - С. 280-281. Прохоров А.В. и др. Хирургия. - 2005.3. - С. 52-55.(57) Способ лечения сахарного диабета путем трансплантации ксеногенной культуры эмбриональных островковых клеток в красный костный мозг реципиента, отличающийся тем, что через год дополнительно осуществляют трансплантацию в мышечную ткань. Изобретение относится к трансплантологии, хирургии, эндокринологии, а именно к лечению инсулинзависимой формы сахарного диабета. Известен способ внедрения инсулина путем инъекций, но постоянные инъекции ухудшают качество жизни больного, опасны гнойными осложнениями. В связи с этим предпринимаются попытки хирургического лечения сахарного диабета. Известен способ пересадки поджелудочной железы 1. Однако эта операция технически сложна, опасна развитием осложнений. Известен способ депортализации венозного оттока от поджелудочной железы путем наложения спленоренального анастомоза 2, но эта операция также технически сложна,опасна и травматична. Наиболее близким по технической сущности решением является способ лечения сахарного диабета путем трансплантации ксеногенных островковых клеток в сосудистое русло 3. Проведение операции технически сложно, связано со вскрытием просвета сосуда, и имеется риск кровотечения, нарушения кровообращения и тромбоза. 11063 1 2008.08.30 Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, заключается в лечении сахарного диабета путем повторных малоинвазивных ксенотрансплантаций эмбриональных островковых клеток без назначения иммунодепрессантов. Поставленная задача решается предлагаемым способом лечения сахарного диабета путем ксенотрансплантаций эмбриональных островковых клеток в красный костный мозг и повторных через 1 год в мышечную ткань. Это обеспечивает развитие в организме реципиента иммунологической толерантности к трансплантату. Ксеногенные островковые клетки функционируют без дополнительной иммунодепрессии. С течением времени (1 год) эффект трансплантации снижается. Тогда возможна повторная ксенотрансплантация через 1 год, но менее травматичным способом в мышечную ткань. Трансплантат в мышечной ткани функционирует в связи с уже ранее развившейся (индуцированной трансплантацией в красный костный мозг) иммунологической толерантностью организма реципиента к ксеногенным островковым клеткам. Способ осуществляют следующим образом. Культуру островковых клеток выделяют из эмбриональной ксеногенной (крысиной,15-21 день) поджелудочной железы с использованием коллагеназы. Сразу после получения ткань поджелудочных желез эмбрионов крыс помещают в среду 1640 (приложение) температуры 8 С. Железы рассекают до фрагментов размером 0,3 мм. В течение 15 мин производят промывание фрагментов средой , температуры 8 С, в которую добавлен гентамицин в количестве 40 мкг/мл. После этого полученные фрагменты обрабатывают коллагеназой (, Туре , С 9407) в концентрации 1 ЕД/мл в течение 35 мин. После отмывки в течение 10 мин средойтемпературы 15 С осадок помещают во флаконы, содержащие 10 -й раствор эмбриональной телячьей сыворотки (серия 11) в средес добавлением гентамицина в количестве 20 мкг/мл. Культивирование проводят при температуре 37 С в контакте с газовой средой, содержащей 95 кислорода. К 7 м суткам вся площадь дна используемой посуды покрыта монослоем клеток, состоящим преимущественно из полигональных элементов с редко встречающимися веретенообразными клетками фибробластоподобного типа. Начиная с 7-х суток культуру островковых клеток подвергают температурной адаптации при медленном снижении температуры культивирования до 24 С в течение 7 суток с дальнейшим постепенным подъемом температуры до 37 С за то же время. Проводят гистологическое исследование с окраской альдегид-фуксином, гематоксилин-эозином, и если выявлено преобладание в культуре клеток, имеющих альдегидфуксинпозитивные гранулы, - это характерно для островковых клеток. Для подтверждения функционирования полученной культуры эмбриональных островковых клеток определяют активность инсулина в культуральной среде. Активность инсулина во всех исследуемых флаконах колебалась в пределах 24,72,7 мкЕД/мл в сутки(после полной смены среды). Стимуляция 8 мМоль глюкозы приводила к увеличению активности инсулина до 150 мкЕД/мл. В экспериментальном исследовании на кроликах массой 3-4 кг. сахарный диабет вызывают внутривенным введением аллоксана в дозе 100 мг/кг массы тела лабораторного животного. Через 10 дней после введения аллоксана производят контроль гликемии и при уровне глюкозы выше 10,0 ммоль/л производят трансплантацию культуры эмбриональных островковых клеток. Перед трансплантацией взвесь островковых клеток сепарируют, используя градиент фикола 1020, 1045, 1075, 1085. Биомассу -клеток отбирают после центрифугирования при 550 в течение 20 мин из среднего слоя. Содержание островковых клеток во взвеси составляет около 3 миллионов. Ксенотрансплантацию культуры островковых клеток осуществляют в красный костный мозг грудины. После обработки операционного поля раствором йодоната пунктируют грудину толстой иглой. К игле присоединяют шприц со взвесью островковых клеток. 2 11063 1 2008.08.30 Взвесь островковых клеток вводят в красный костный мозг грудины. Иглу извлекают. Иммунодепрессанты не назначают. Повторную ксенотрансплантацию культуры островковых клеток осуществляют через 1 год в мышечную ткань бедра, пунктируя ее толстой иглой. Взвесь островковых клеток вводят в мышечную ткань. Иглу извлекают. Иммунодепрессанты не назначают. Методика обладает следующими преимуществами 1) простота и доступность в исполнении 2) отсутствие возможных тяжелых осложнений 3) малая инвазивность и возможность повторных трансплантаций. Проведено экспериментальное исследование на 5 кроликах. Пример 1. За 10 дней до трансплантации кролику массой 4 кг вводят аллоксан внутривенно 100 мг/кг. Трансплантацию ксеногенных островковых клеток крысиных эмбрионов осуществляли в красный костный мозг грудины кролика-реципиента. На 180 и 360 дни после трансплантации исследовали уровень гликемии в венозной крови. На 180 день уровень гликемии составил 5,890,22 ммоль/л, на 360 день - 6,990,28 ммоль/л. Таким образом, ксенотрансплантат в красном костном мозге функционировал, обеспечивал нормализацию гликемии. Но с течением времени эффект трансплантации снижался. В связи с этим через 1 год проводилась повторная ксенотрансплантация в мышечную ткань кроликам с индуцированной толерантностью (предшествующая трансплантация в красный костный мозг). Для оценки эффекта повторной трансплантации проведено сравнение уровня гликемии кроликов с индуцированной толерантностью (трансплантации в красный костный мозг культуры островковых клеток) до и через 180 дней после повторной трансплантации в мышцу (таблица). Уровень гликемии после трансплантации Трансплантация в красный костный мозг Трансплантация в красный костный мозг,затем через 1 год в мышцу. Через 180 дней Через 360 дней Через 180 дней 6,43 7,57 6,21 4,57 6,79 5,11 5,69 7,13 6,78 6,01 6,46 6,07 6,23 7,76 6,35 До трансплантации уровень гликемии составил 6,990,29 ммоль/л, после повторной трансплантации в мышцу - 6,100,28 ммоль/л. Имеются достоверные различия указанных параметров (Р 0,05), т.е. повторная трансплантация в мышцу у кроликов с индуцированной толерантностью является эффективной. Уровень фруктозамина у кроликов с трансплантатом в красном костном мозге через 180 дней составил 165,97,5 нмоль/л. Уровень фруктозамина у кроликов с индуцированной толерантностью и повторной трансплантацией в мышцу через 180 дней составил 182,03,9 нмоль/л. Это говорит о хорошей компенсации моделированного сахарного диабета и об эффективности указанных выше способов трансплантации. Таким образом, предложенный способ лечения сахарного диабета позволяет нормализовать гликемию, не требует дополнительного назначения иммунодепрессантов, технически прост и характеризуется отсутствием тяжелых осложнений. Источники информации 1. А.с. СССР 1147364, МПК А 61 В 17/00. 2. А.с. СССР 1718833, МПК А 1 61 В 17/00. 3. Заявка на патент РБ а 20030138. 4. Справочник-каталог продукции фирмы , 1996. - С. 846. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4