Способ определения каталитических активностей поликлональных антител у больного

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АКТИВНОСТЕЙ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ У БОЛЬНОГО(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Генералов Игорь Иванович Моисеева Алеся Михайловна Семенова Наталья Валерьевна(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(57) Способ определения каталитических активностей поликлональных антител у больного,заключающийся в том, что из сыворотки крови больного получают антитела, адсорбируют их на аффинной матрице и последовательно определяют их каталитические активности с соответствующими субстратами, причем после проведения каждой каталитической реакции матрицу с адсорбированными на ней антителами отмывают. Изобретение относится к иммунологии, медицине, и может быть использовано для определения каталитической активности поликлональных антителбольных аутоиммунными и инфекционными заболеваниями. В настоящее время определение собственной каталитической (абзимной) активности поликлональных антител начинает все шире применяться для иммунологической диагностики аутоиммунных и других болезней. В частности, абзимная активность определяется при ревматоидном артрите, системной красной волчанке (СКВ), аутоиммунном тиреоидите, ВИЧ-инфекции, гнойно-воспалительных инфекциях, включая сепсис 1-4. При этом с целью диагностики разных заболеваний проводится определение отдельных видов абзимной активности РНКазной и ДНКазной, протеолитической, амилазной и других. В частности, в метод оценки поликлональной абзимной активности, предложенном Сучковым С.В. с соавт. 4, после получения сыворотки от больного проводится адсорбция антител из сыворотки на магнитном аффинном носителе с последующим определением одного из видов абзимной активности (ДНКазной) в адсорбированном препарате иммуноглобулинов (ИГ). Недостатком такого подхода является то, что он позволяет оценить лишь один из многих возможных видов абзимной активности полученного препарата поликлональных антител. Для дополнительного определения какого-либо другого вида каталитической ак 11026 1 2008.08.30 тивности ИГ требуется повторная адсорбция препаратаиз нового образца сыворотки от данного больного. Определение нескольких разных видов абзимной активности в одном материале, полученном от больного, до сих пор не проводилось. Очевидно, что такое определение может дать дополнительную, важную в клиническом отношении информацию. Кроме того,последовательное определение нескольких видов абзимов в одном препарате иммуноглобулинов позволяет сократить время реакции и сохранить нативность препарата антител. Задачей изобретения является разработка нового метода, позволяющего в одном и том же препарате ИГ определять несколько видов каталитической (абзимной) активности поликлональных , присутствующих в сыворотке крови больных. Сущность изобретения заключается в том, что из сыворотки крови больного получают антитела, адсорбируют их на аффинной матрице и последовательно определяют их каталитические активности с соответствующими субстратами, причем после проведения каждой каталитической реакции матрицу с адсорбированными на ней антителами отмывают. Способ осуществляется следующим образом материалом для определения абзимной активности поликлональных каталитических антител служат сыворотки больных аутоиммунными болезнями (ревматоидным артритом,системной красной волчанкой, аутоиммунным тиреоидитом или другими), а также инфекционными заболеваниями. Для получения адсорбированного препарата поликлональных, пригодного для оценки абзимной активности, проводят аффинную хроматографию полученной сыворотки на агарозе, конъюгированной со стафилококковым протеином А. При постановке реакции сыворотку больного разводят физиологическим раствором в соотношении 1/5 после этого 1 мл разведенной сыворотки добавляют в микроколонку объемом 2 мл, содержащую 0,5 мл агарозы, конъюгированной с протеином А золотистого стафилококка. Предварительно колонку уравновешивают 0,1 М фосфатным буфером. Смесь инкубируют в течение 1 ч при 37 С с периодическим перемешиванием. По окончании инкубации колонку последовательно промывают 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4 с 1 раствором тритона Х-100 или Х-305 в количестве 3-4 объемов колонки и далее фосфатным буфером без детергента. Отмывку завершают последовательной обработкой колонки 0,3 М и 0,15 М раствором . Промывку ведут до исчезновения белка в элюенте(определяют по методу Бредфорд). Далее адсорбированный препарат антител на агарозе уравновешивают буферным раствором, содержащим субстрат для постановки первой реакции. Ниже приведены результаты определения различных видов каталитической активности адсорбированных препаратов каталитических поликлональных иммуноглобулинов. 1. Определение амилазной и БАПНА-амидазной абзимной активности. В реакциях использовали препарат , полученный от больной СКВ. Адсорбцию на аффинной матрице проводят, как описано выше. Адсорбированный препарат антител на агарозе уравновешивают буферно-субстратной смесью для амилазной реакции. Для этого к 0,5 мл объема гранул агарозы сдобавляют 0,6 мл раствора крахмала в концентрации 20 мг/мл на 0,05-фосфатного буфера,содержащем 0,15 М . В контроле используют 0,5 мл гранул аффинной матрицы без адсорбированных иммуноглобулинов и субстратный раствор крахмала. После инкубации в течение 20 часов при 37 С с периодическим перемешиванием 0,05 мл надосадка реакционной смеси вносят в 2 мл йодного раствора (на 100 мл воды 1 мл 1 н НС 1, 0,2 мл 0,1 М раствора йода). Опытные и контрольные пробы дублируют. После тщательного перемешивания отбирают 0,2 мл содержимого, помещают в планшет для иммуноферментного анализа (ИФА) и фотометрируют на ридере-мультискане АИФ М/340 (методика 7, длина волны - 620 нм). 2 11026 1 2008.08.30 После учета реакции величина оптической плотности опытных проб составила 0,2050,006 контрольных проб - 0,5750,003. Далее проводят тщательную отмывку матрицы от предыдущего буфера первоначально 3-4 объемами 0,05 М -фосфатного буфера, содержащего 0,15 М , и затем 3-4 объемами 0,15 М . Для постановки следующей каталитической реакции (БАПНА-амидазной) к отмытым гранулам матрицы, содержащим , добавляют 0,6 мл новой субстратной смеси, состоящей из раствора БАПНА в концентрации 0,5 мг/мл на 0,05 М трис- буфере рН 7,4. Предварительно требуемую навеску субстрата растворяют в минимальном объеме диметилсульфоксида или диметилформамида. После инкубации в течение 20 ч при 37 С с периодическим перемешиванием 0,2 мл надосадка реакционной смеси отбирают и переносят в стандартный планшет для ИФА. Опытные и контрольные пробы дублируют. Пробы фотометрируют на ридере-мультискане (методика 1, максимум поглощения светофильтра 410 нм). После учета реакции величина оптической плотности опытных проб составила 0,1980,007 контрольных проб - 0,1240,006. 2. Определение ДНКазной и БАПНА-амидазной абзимной активности. В реакциях использовали препарат , полученный от больной СКВ. Адсорбцию на аффинной матрице проводят, как описано выше. Адсорбированный препарат антител на агарозе уравновешивают буферно-субстратной смесью для ДНКазной реакции. Для этого к отмытым гранулам матрицы, содержащим, добавляют 1 мл субстратной смеси, состоящей из раствора ДНК в концентрации 0,350,45 мг/мл на 0,02 М трис- буфера рН 7,4, содержащем 0,01 М 2 и 0,15 М . После инкубации в течение 20 ч при 37 С с периодическим перемешиванием 0,4 мл надосадка реакционной смеси отбирают, переносят в центрифужные пробирки. Опытные и контрольные пробы дублируют. На поверхность проб наслаивают 20 мкл 0,75 раствора риванола и встряхивают до получения сгустка. Экстракцию хромогена риванола из сгустка после его отмывания дистиллированной воде проводят кипячением в 0,5 мл 1 н НС 1. Далее 0,2 мл пробы вносят в стандартный планшет для ИФА и фотометрируют на ридере-мультискане (методика 1, максимум поглощения светофильтра - 410 нм). После учета реакции величина оптической плотности опытных проб составила 0,1820,016 контрольных проб - 0,4030,011. Далее проводят тщательную отмывку матрицы от предыдущего буфера первоначально 3-4 объемами 0,05 М -фосфатного буфера, содержащего 0,15 М , и затем 3-4 объемами 0,15. Для постановки следующей каталитической реакции (БАПНА-амидазной) к отмытым гранулам матрицы, содержащим , добавляют 0,5 мл новой субстратной смеси, состоящей из раствора БАПНА в концентрации 0,5 мг/мл на 0,05 М трис- буфере рН 7,4. Предварительно требуемую навеску субстрата растворяют в минимальном объеме диметилсульфоксида или диметилформамида. После инкубации в течение 20 ч при 37 С с периодическим перемешиванием 0,2 мл надосадка реакционной смеси отбирают и переносят в стандартный планшет для ИФА. Опытные и контрольные пробы дублируют. Пробы фотометрируют на ридере-мультискане (методика 1, максимум поглощения светофильтра - 410 нм). После учета реакции величина оптической плотности опытных проб составила 0,3230,014 контрольных проб - 0,0810,01. 3 11026 1 2008.08.30 Таким образом, вышеприведенные примеры подтверждают эффективность последовательного определения нескольких видов абзимной активности антител, полученных из одного образца сыворотки крови больного. Разработанный способ создает дополнительные возможности для лабораторной диагностики аутоиммунных и иных болезней с помощью методов, основанных на определении каталитической активности поликлопальных антител. Источники информации 1. Сидорская Е.В., Генералов И.И., Окороков А.Н. ДНКазная активность препаратов сывороточныхпри заболеваниях щитовидной железы // Медицинские новости. - 2000.5. - С. 72-74. 2. Хитров А.Н., Ромаданова Н.Б., Огнева Е.А. с соавт. ДНК-абзимы при ревматоидном артрите патогенетическая и клиническая значимость // Тер. архив. - 2005. -11. - С. 7580. 3. - .,., // . . . . - 2005. - . 102. - 3. - . 309312. 4.,,,-// Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4