Способы модулирования функции серин/треонин протеинкиназы соединениями на основе 5-азахиноксалина

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБЫ МОДУЛИРОВАНИЯ ФУНКЦИИ СЕРИН/ТРЕОНИН ПРОТЕИНКИНАЗЫ СОЕДИНЕНИЯМИ НА ОСНОВЕ 5-АЗАХИНОКСАЛИНА(57) 1. Способ модулирования функции серин/треонин протеинкиназы, включающий контактирование клеток, экспрессирующих упомянутую серин/треонин протеинкиназу, с соединением на основе 5-азахиноксалина общей формулы 3 4 где 1, 2, 3, 4 и 6 независимо выбирают из группы, включающей водород С 1-С 6-алкил, возможно замещенный фенилом-(Х 8)- и -(Х 8)Х 9, где Х 8 и Х 9 независимо выбирают из группы, включающей С 1-С 6-алкил и фенил, а 1 фенил и пиридил, возможно замещенные одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей С 1-С 6-алкил, галоген, тригалогенметил,гидрокси, С 1-С 6-алкокси, карбокси и 2 Х 1 - азот или кислород. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутой серин/треонин протеинкиназой является киназа быстро увеличивающейся фибросаркомы. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что 1, 2, 3, 4 и 6 независимо выбирают из группы, включающей фенил, возможно замещенный одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей С 1-С 6-алкил, галоген, тригалогенметил, гидрокси, С 1-С 6-алкокси, карбокси и 2. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что 1 и 2 независимо выбирают из группы,включающей фенил, возможно замещенный заместителем, выбранным из группы, включающей С 1-С 6-алкил, галоген, тригалогенметил, 2, карбокси, гидрокси и С 1-С 6-алкокси. 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что 1 является азотом или кислородом. 6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что 6 и 1 объединены с образованием остатка, который выбирают из группы заместителей , представленных в описании. 7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что упомянутое соединение на основе 5-азахиноксалина выбирают из группы соединений , представленных в таблице описания. 8. Соединение на основе 5-азахиноксалина общей формулы 3 4 где 1, 2, 3, 4 и 6 независимо выбирают из группы, включающей водород С 1-С 6-алкил, возможно замещенный фенилом-(Х 8)- и -(Х 8)Х 9, где Х 8 и Х 9 независимо выбирают из группы, включающей С 1-С 6-алкил и фенил, а 1 фенил и пиридил, возможно замещенные одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей С 1-С 6-алкил, С 1-С 6-алкокси, галоген, тригалогенметил, карбокси и 2 Х 1 - азот или кислород. 9. Соединение по п. 8, отличающееся тем, что 1, 2, 3, 4 и 6 независимо выбирают из группы, включающей фенил, возможно замещенный одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей С 1-С 6-алкил, галоген, тригалогенметил, гидрокси, С 1-С 6-алкокси, карбокси и 2. 10. Соединение по п. 9, отличающееся тем, что 3 и 4 являются водородом. 11. Соединение по п. 10, отличающееся тем, что 1 и 2 независимо выбирают из группы, включающей фенил, возможно замещенный заместителями, выбранными из группы, включающей С 1-С 6-алкил, галоген, гидрокси и С 1-С 6-алкокси. 12. Соединение по п. 10, отличающееся тем, что 1 и 2 независимо выбирают из группы, включающей водород, метил, фенил и 4-гидроксифенил. 13. Соединение по п. 11, отличающееся тем, что Х 1 - азот или кислород. 14. Соединение по п. 13, отличающееся тем, что заместители 6 и Х 1 объединены с образованием радикала, который выбирают из группы заместителей , представленных в описании. 15. Соединение по п. 14, отличающееся тем, что представляет собой соединение, выбранное из группы соединений , представленных в таблице описания. 16. Фармацевтическая композиция для лечения патологических состояний организма,связанных с отклонением от нормы пути трансдукции сигнала, характеризующегося взаимодействием между серин/треонин протеинкиназой и природным связывающим партнером, содержащая эффективное количество соединения по любому из пп. 8-15 или его соли и физиологически приемлемый носитель или разбавитель. 2 7598 1 2005.12.30 17. Способ синтеза соединения формулыпо п. 8, заключающийся в том, что осуществляют взаимодействие 2-амино-6-хлор-3-нитропиридина со спиртом или амином в растворителе и в присутствии основания с образованием первого промежуточного производного, затем первое промежуточное производное восстанавливают в присутствии катализатора и восстанавливающего агента с образованием второго промежуточного производного и проводят реакцию с 1,2-дионом с получением соответствующего конечного продукта, который далее очищают. 18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что спирт или амин выбирают из группы реагентов , представленных в описании. 19. Способ по п. 17, отличающийся тем, что 1,2-дион выбирают из группы, включающей 4-гидроксифенилглиоксаль и 1-фенил-1,2-пропандион. 20. Способ по п. 17, отличающийся тем, что восстанавливающим агентом является водород. 21. Способ по п. 17, отличающийся тем, что катализатором является никель Ренея. Изобретение относится к способам модуляции функции серин/треонин протеинкиназы соединениями на основе 5-азахиноксалина, к фармацевтическим композициям, включающим соединения на основе 5-азахиноксалина, соединениям на основе 5-азахиноксалина и способам их получения. Следующее описание предпосылок создания изобретения предназначено для объяснения изобретения и не может рассматриваться как предшествующий уровень техники. Трансдукция клеточных сигналов - фундаментальный механизм, посредством которого внешние воздействия, регулирующие разнообразные процессы в клетке, передаются внутрь клетки. Одним из ключевых биохимических механизмов трансдукции сигнала является обратимое фосфорилирование белков, которое позволяет регулировать активность зрелых белков путем изменения их структуры и функции. Наиболее охарактеризованные протеинкиназы эукариот фосфорилируют белки по гидроксигруппам остатков серина, треонина и тирозина. Эти киназы подразделяются в основном на две группы - специфично фосфорилирующие остатки серина и треонина и специфично фосфорилирующие остатки тирозина. Некоторые киназы относятся к ферментам с двойной специфичностью, они способны фосфорилировать как остаток тирозина, так и остатки серина/треонина. Протеинкиназы характеризуют также по локализации в клетке. Некоторые киназы являются трансмембранными рецепторными белками, способными связывать лиганды на внешней стороне клеточной мембраны. Связывание лигандов ведет к изменению каталитической активности рецепторной протеинкиназы. Другие киназы являются нерецепторными белками и не имеют трансмембранного домена. Эти нерецепторные протеинкиназы могут присутствовать в различных отделах клетки от внутренней стороны клеточной мембраны до клеточного ядра. Многие киназы включены в регуляторный каскад, гдеих субстратами могут быть другие киназы, активность которых регулируется путем их фосфорилирования. В конечном счете активность последующего эффектора модулируется фосфорилированием в результате активации такого пути. Семейство серин/треонин протеинкиназ включает такие ферменты, которые регулируют многие стадии сигнального каскада, включая каскады, контролирующие клеточный рост, миграцию и дифференциацию клеток, генную экспрессию, мышечное сокращение,метаболизм глюкозы, биосинтез белка и регуляцию клеточного цикла. Примером нерецепторной протеинкиназы, фосфорилирующей белки-мишени по остаткам серина и треонина, является .модулирует каталитическую активность других протеинкиназ, таких как протеинкиназа, которая фосфорилирует и тем самым ак 3 7598 1 2005.12.30 тивирует митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК). Собственноактивируется заякоренным на мембране белком , который в свою очередь активируется в ответ на активацию лигандами рецепторных тирозин протеинкиназ, таких как рецептор эпидермального фактора ростаи рецептор тромбоцитарного фактора роста . О важной ролив регуляции клеточных процессов свидетельствуют данные о том, что измененные формымогут вызвать развитие онкологического заболевания в организме. Данные о значениив развитии злокачественных опухолей приводятся в статье.,, 2, 668 (1996), полностью включенной в описание в качестве ссылки, включая все фигуры и таблицы. В поисках новых способов лечения онкологических заболеваний и др. заболеваний специалисты в области химии и биохимии создали, синтезировали и испытали соединения,которые ингибируют функцию протеинкиназ. Некоторые низкомолекулярные органические соединения составляют класс соединений, которые модулируют функцию протеинкиназ. Примерами соединений, которые согласно опубликованным данным ингибируют функцию протеинкиназ, являются бис-моноциклические, бициклические или гетероциклические арилпроизводные (92/20642), производные винилен-азоиндола (94/14808), 1-циклопропил-4-пиридилхинолоны (патент США 5330992), производные стирила (., патент США 5217999),(Производные стирила, ингибирующие тирозин протеинкиназу рецептора ),208/050), стирил-замещенные пиридилы (патент США 5302606), некоторые производные хиназолина (заявка на выдачу европейского патента 0566266 1), селеноиндолы и селениды (94/03427), трициклические полигидроксильные соединения (92/21660) и соединения на основе бензилфосфоновой кислоты (91/15495). Соединения, которые могут проходить через клеточные мембраны и проявляют устойчивость к кислотному гидролизу, обладают значительным преимуществом как лекарственные средства, так как становятся биодоступными после перорального введения. Однако многие из этих ингибиторов обладают слабой ингибирующей активностью в отношении протеинкиназ. Кроме того, они могут ингибировать многие другие протеинкиназы и,следовательно, при использовании в качестве лекарственных средств будут вызывать множество побочных эффектов. Несмотря на значительный прогресс в разработке лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний, в данной области техники все еще актуальной является идентификация особых структур, положения и строения заместителей для получения соединений, модулирующих функцию определенных протеинкиназ. Способы модуляции функции серин/треонин протеинкиназ соединениями на основе 5-азахиноксалина по изобретению включают клетки, экспрессирующие серин/треонин протеинкиназу, такую как . Кроме того, в заявке описываются способы профилактики и лечения патологических состояний организма, связанных с серин/треонин протеинкиназой, с использованием соединения по изобретению.. Способы тестирования соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы Способы по настоящему изобретению обеспечивают средства для модулирования функций как рецепторных, так и плазматических серин/треонин протеинкиназ. Эти способы обеспечивают средства модулирования ферментов как, так и. Для примененияспособы по изобретению частично относятся к способу идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназ. Таким образом, первым аспектом изобретения является способ модулирования функции серин/треонин протеинкиназы соединением на основе 5-азахиноксалина. 5-азахиноксалин по выбору замещен соответствующими группами. Способ включает контактирование клеток, экспрессирующих серин/треонин протеинкиназу с соединением по изобретению. 4 7598 1 2005.12.30 Термин функция означает роль, выполняемую серин/треонин протеинкиназой в клетке. Семейство серин/треонин протеинкиназ включает ферменты, регулирующие многие стадии сигнальных каскадов, включая каскады, контролирующие клеточный рост, миграцию и дифференциацию клеток, генную экспрессию, мышечное сокращение, метаболизм глюкозы, биосинтез белка и регуляцию клеточного цикла. Термин каталитическая активность, используемый в данном тексте, означает скорость, с которой протеинкиназа фосфорилирует субстрат. Каталитическую активность можно определить, например, по количеству субстрата, превратившегося в продукт, как функцию времени. Фосфорилирование субстрата происходит в активном центре протеинкиназы. Обычно активный центр представляет собой полость (в белковой глобуле), в которой субстрат связывается с протеинкиназой и фосфорилируется. Термин субстрат, используемый в данном тексте, относится к молекуле, фосфорилируемой серин/треонин протеинкиназой. Предпочтительно субстрат является пептидом,более предпочтительно белком. В отношении протеинкиназыпредпочтительным субстратом является МЕК, а субстратом МЕК является МАРК. Термин активирует означает усиление клеточной функции протеинкиназы. Предпочтительной функцией протеинкиназы является взаимодействие с природным связывающим партнером, наиболее предпочтительно каталитическая активность. Термин ингибирует означает снижение клеточной функции протеинкиназы. Предпочтительной функцией протеинкиназы является взаимодействие с природным связывающим партнером, наиболее предпочтительно каталитическая активность. Термин модулирует также означает изменение функции протеинкиназы путем увеличения или уменьшения вероятности образования комплекса между протеинкиназой и природным связывающим партнером. Предпочтительно модулятор увеличивает вероятность образования комплекса между протеинкиназой и природным связывающим партнером, более предпочтительно увеличивает или уменьшает вероятность образования комплекса между протеинкиназой и природным связывающим партнером в зависимости от концентрации соединения, воздействующего на протеинкиназу, наиболее предпочтительно снижает вероятность образования комплекса между протеинкиназой и природным связывающим партнером. Предпочтительно модулятор активирует каталитическую активность протеинкиназы, более предпочтительно активирует или ингибирует каталитическую активность протеинкиназы в зависимости от концентрации соединения, воздействующего на протеинкиназу, или наиболее предпочтительно ингибирует активность протеинкиназы. Термин комплекс означает агрегат по крайней мере из двух молекул, связанных друг с другом. Трансдуцирующие сигнал комплексы часто содержат по крайней мере две связанные друг с другом молекулы белка. Например, субъединицы рецепторной протеинкиназы, 2, ,исобираются в трансдуцирующий сигнал комплекс в ответ на митогенный лиганд. Термин природный связывающий партнер означает полипептиды, которые связываются с протеинкиназой в клетках. Природный связывающий партнер может выполнять функцию усиления сигнала в процессе трансдукции сигнала протеинкиназой. Изменение взаимодействия протеинкиназы с природным связывающим партнером может проявляться как увеличение или уменьшение вероятности того, что это взаимодействие произойдет,или как увеличение или уменьшение концентрации комплекса протеинкиназа/природный связывающий партнер. Природный связывающий партнер протеинкиназы связывается с высоким сродством с внутриклеточным фрагментом протеинкиназы. Высокое сродство означает константу равновесия порядка 10-6 или менее. Кроме того, природный связывающий партнер может также кратковременно взаимодействовать с внутриклеточным фрагментом протеинкиназы и модифицировать ее за счет химической реакции. Природные связывающие партнеры протеинкиназы выбирают из группы, которая включает (но не ограничивается перечис 5 7598 1 2005.12.30 ленным)гомологичный домен 2 (2) или домен 3 (3), другие фосфорилтирозинсвязывающие домены , гуаниннуклеотид обменные факторы, протеинфосфатазы и другие протеинкиназы. Способы определения изменений взаимодействия протеинкиназы с природными связывающими партнерами хорошо известны в данной области техники. Термин серин/треонин протеинкиназа означает фермент, аминокислотная последовательность которого по крайней мере на 10 идентична другим ферментам, фосфорилирующим белки по остаткам серина и треонина. Серин/треонин протеинкиназа катализирует присоединение фосфатной группы к белкам по остаткам серина и треонина. Серин/треонин протеинкиназы могут существовать в форме мембранно-связанных белков,а также в форме плазматических белков. Термин контактирование, используемый в данном тексте, означает смешивание раствора, содержащего соединение на основе 5-азахиноксалина по изобретению, с жидкой средой для культивирования клеток согласно способу. Раствор, содержащий соединение по изобретению, может также включать другой компонент, такой как диметилсульфоксид(ДМСО), который способствует поглощению клетками соединения или соединений на основе 5-азахиноксалина. Раствор, содержащий соединение на основе 5-азахиноксалина, может быть добавлен в среду для культивирования клеток с помощью любого дозирующего устройства, такого как пипетка или шприц. Термин соединение на основе 5-азахиноксалина относится к органическому замещенному соединению на основе 5-азахиноксалина. Соединения на основе 5-азахиноксалина представлены общей формулой Термин замещенный, используемый в данном тексте, относится к соединению на основе 5-азахиноксалина, которое является производным с любым числом заместителей. Предпочтительным вариантом воплощения изобретения является способ модулирования функции серин/треонин протеинкиназы, в котором протеинкиназа означает .протеинкиназа фосфорилирует белки-мишени по остаткам серина или треонина. Одним из таких белков является протеинкиназа (МЕК), которая фосфорилирует и в результате активирует митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК). Собственноактивируется гидролизующим гуанинтрифосфат мембранным ферментомв ответ на активацию митогенами рецепторных тирозин протеинкиназ, таких как рецептор эпидермального фактора ростаи рецептор тромбоцитарного фактора роста . Более конкретно предметом изобретения являются способ модулирования функции серин/треонин протеинкиназы, включающий контактирование клеток, экспрессирующих упомянутую серин/треонин протеинкиназу, с соединением на основе 5-азахиноксалина общей формулы 3 4 где,,,инезависимо выбирают из группы, включающей водород С 1-С 6 алкил, возможно замещенный фенилом-(Х 8)- и -(Х 8)Х 9, где Х 8 и Х 9 независимо выбирают из группы, включающей С 1-С 6-алкил и фенил, а 1 фенил и пиридил, возможно замещенные одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей С 1-С 6-алкил, галоген, тригалогенметил,гидрокси, С 1-С 6-алкокси, карбокси и 2 6 7598 1 2005.12.30 Х 1 - азот или кислород. В предпочтительном варианте упомянутой серин/треонин протеинкиназой является киназа быстро увеличивающейся фибросаркомы. В предпочтительном варианте 1, 2, 3, 4 и 6 независимо выбирают из группы,включающей фенил, возможно замещенный одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей С 1-С 6-алкил, галоген, тригалогенметил, гидрокси, С 1-С 6-алкокси, карбокси и 2. Предпочтительно 1 и 2 независимо выбирают из группы, включающей фенил, возможно замещенный заместителем, выбранным из группы, включающей С 1-С 6-алкил, галоген, тригалогенметил, 2, карбокси, гидрокси и С 1-С 6-алкокси. В предпочтительном варианте Х 1 является азотом или кислородом и предпочтительно 6 и Х 1 объединены с образованием остатка, который выбирают из группы заместителей, представленных в описании далее, а упомянутое соединение на основе 5-азахиноксалина выбирают из соединений , представленных в таблице А. Способы по изобретению позволяют обнаруживать соединения, которые модулируют функцию протеинкиназыв клетках.фосфорилирует протеинкиназу МЕК, которая в свою очередь фосфорилирует митоген-активируемую протеинкиназу (МАРК). Способы анализа, которые позволяют определить уровни фосфорилирования протеинкиназы МЕК ферментом , являются недостаточно чувствительными в связи с очень низким уровнем фосфорилирования МЕК. С целью повышения чувствительности метода согласно способу по изобретению контролируют фосфорилирование двух ферментов МЕК и МАРК. Сигнал фосфорилирования МАРК усиливает сигнал фосфорилирования МЕК и позволяет определить уровень -зависимого фосфорилирования с помощью аналитического метода, такого как иммуноферментный анализ. Кроме того, способ анализа по изобретению выполняется в высокой производительностью, что позволяет за короткий период времени анализировать множество соединений. Другим аспектом изобретения является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, включающий такие стадии контактирования клеток, экспрессирующих серин/треонин протеинкиназу, с соединением, и мониторинг эффекта на клетки. Термин мониторинг означает наблюдение за эффектом, полученным после добавления испытуемого соединения к клеткам согласно изобретению. Результат может проявляться в форме изменения клеточного фенотипа, пролиферации, каталитической активности протеинкиназы или взаимодействия между протеинкиназой и природным связывающим партнером. Термин эффект означает изменение или отсутствие изменения клеточного фенотипа или клеточной пролиферации. Эффект также означает изменение или отсутствие изменения каталитической активности протеинкиназы. Эффект также означает изменение или отсутствие изменения взаимодействия между протеинкиназой и природным связывающим партнером. Предпочтительным является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, в котором эффектом является изменение или отсутствие изменения клеточного фенотипа. Термин клеточный фенотип относится к внешнему виду клетки или ткани или к функции клетки или ткани. Примерами клеточного фенотипа являются размер клеток(уменьшение или увеличение), клеточная пролиферация (увеличение или уменьшение числа клеток), клеточная дифференциация (изменение или отсутствие изменений формы клеток), выживание клеток, апоптоз (гибель клеток) или усвоение метаболитических пи 7 7598 1 2005.12.30 тательных веществ (например, потребление глюкозы). Изменение или отсутствие изменений клеточного фенотипа легко определить способами, известными в данной области техники. Другим предпочтительным вариантом является способ идентификации соединений,модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, в котором эффектом является изменение или отсутствие изменения клеточной пролиферации. Термин клеточная пролиферация относится к скорости, с которой происходит деление группы клеток. Количество клеток, выращиваемых в сосуде для культивирования,может быть подсчитано специалистом в данной области техники, когда визуально подсчитывают число клеток в определенном объеме, используя обычный световой микроскоп. По альтернативному варианту скорость клеточной пролиферации рассчитывают с использованием приборов, в которых плотность клеточной суспензии в соответствующей питательной среде измеряют оптическим или кондуктометрическим методами. Другим предпочтительным вариантом является способ идентификации соединений,модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, в котором эффектом является изменение или отсутствие изменения взаимодействия между серин/треонин протеинкиназой и природным связывающим партнером. Термин взаимодействие, используемый в данном тексте, относится к комплексу, образованному между внутриклеточным фрагментом протеинкиназы и природным связывающим партнером или соединением. Термин взаимодействие может быть также означать комплекс, образованный между соединением по изобретению и внутриклеточным и внеклеточным фрагментами исследуемой протеинкиназы. Хотя плазматическая протеинкиназа не имеет внеклеточного фрагмента, рецепторная протеинкиназа имеет оба фрагмента. Термин внутриклеточный фрагмент, используемый в данном тексте, означает ту часть молекулы протеинкиназы, которая расположена внутри клетки. Термин внеклеточный фрагмент, используемый в данном тексте, означает ту часть молекулы протеинкиназы, которая экспонирована на внешней стороне мембраны. Предпочтительным является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, который, кроме того, включает следующие стадии (а) лизирование клеток с получением лизата, содержащего серин/треонин протеинкиназу (б) адсорбцию серин/треонин протеинкиназы на антителах (в) инкубацию адсорбированной серин/треонин протеинкиназы с субстратом или субстратами (г) адсорбцию субстрата или субстратов на твердом носителе или на антителах. Стадия мониторинга эффекта на клетки включает измерение концентрации фосфата в субстрате или в субстратах. Термин лизирование, используемый в данном тексте, относится к способу разрушения клетки с высвобождением внутреннего содержимого. Лизирование клеток осуществляют различными способами, известными специалистам в данной области техники. Предпочтительно клетки разрушают обработкой ультразвуком или гомогенизацией, более предпочтительно обработкой детергентами. Термин антитело, используемый в данном тексте, относится к белку, который специфически связывает протеинкиназу. Предпочтительно антитело связывает один класс протеинкиназ, более предпочтительно специфически связывает протеинкиназу . Термин специфически связывает, используемый в данном тексте, относится к антителу, которое связывает протеинкиназу с более высоким сродством, чем другую протеинкиназу или клеточный белок. Специфически связывающее протеинкиназу антитело адсорбирует большее количество специфической протеинкиназы по сравнению с другой протеинкиназой или клеточным белком. Термин адсорбирование, используемый в данном тексте, относится к связыванию молекулы на поверхности антитела или твердого носителя. Примерами твердых носителей являются химически модифицированная целлюлоза,такая как фосфоцеллюлоза, и нейлон. Антитела могут быть связаны с твердым носителем 8 7598 1 2005.12.30 способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. См., например,руководство, ,, 1989,. Термин измерение концентрации фосфата, используемый в данном тексте, относится к методикам, хорошо известным специалистам в данной области техники. Эти методики могут включать количественное определение содержания фосфата в субстрате или определение относительного содержания фосфата в субстрате. Эти методики могут включать адсорбцию субстрата на мембране и определение содержания фосфата в субстрате по измерению радиоактивности. Другим предпочтительным вариантом является способ идентификации соединений,модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, который, кроме того, включает следующие стадии (а) лизирование клеток с получением лизата, содержащего(б) адсорбциюна антителах (в) инкубирование адсорбированнойс МЕК и МАРК(г) адсорбцию МЕК и МАРК на твердом носителе или на антителах. Стадия мониторинга эффекта на клетки включает определение концентрации фосфата в вышеупомянутых МЕК и МАРК. Предпочтительным вариантом является способ идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, в котором соединение на основе 5-азахиноксалина имеет структуру, представленную формулой , как определено в описании,или любой формулой из подгрупп, представленных в описании. Термин соединение означает соединение или его фармацевтически приемлемую соль, сложный эфир, амид, пролекарство, изомер или метаболит. Термин фармацевтически приемлемая соль означает форму соединения, которая не изменяет биологическую активность и другие свойства соединения. Фармацевтические соли могут быть получены взаимодействием соединения по изобретению с неорганическими или органическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота,метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, паратолуолсульфоновая кислота,салициловая кислота и т.п. Термин пролекарство означает агент, который превращается в исходное лекарственное соединение.некоторых ситуациях пролекарства можно ввести более простым способом, чем исходное лекарственное соединение. Например, пролекарство может быть биодоступным при пероральном введении, а исходное соединение не обладать таким свойством, или пролекарство может иметь хорошую растворимость, что позволяет вводить его внутривенно. Другим предпочтительным вариантом является способ идентификации соединений,модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназы, в котором соединение на основе 5-азахиноксалина имеет структуру, представленную формулой , причем соединение на основе 5-азахиноксалина выбирают из группы, включающей соединения . Термин соединенияозначает группу соединений на основе 5-азахиноксалина, имеющих структуру, представленную формулой , и пронумерованных от А-1 до А-90 в таблице А.. Способы профилактики или лечения патологических состояний В рамках изобретения описывается способ профилактики или лечения патологических состояний организма. Способ включает следующие стадии (а) введение в организм соединения согласно изобретению, определенного в данном тексте формулойс любыми соответствующими ограничительными условиями, представленными в данном тексте, и(б) ускорение или подавление аномального взаимодействия. Термин организм относится к любому живому объекту, включающему по крайней мере одну клетку. Организмом может быть простой объект, такой как эукариотическая клетка, или сложный организм, такой как млекопитающее. В предпочтительном варианте воплощения изобретения организмом является человек или млекопитающее. 9 7598 1 2005.12.30 Термин профилактика относится к способу согласно изобретению для снижения вероятности или ликвидации возможности возникновения или развития в организме патологических состояний. Термин лечение означает способ согласно изобретению, позволяющий получить терапевтический эффект и по крайней мере частично облегчать или нейтрализовать патологическое состояние организма. Термин терапевтический эффект относится к ингибированию клеточного роста, который является причиной патологического состояния или способствует возникновению патологического состояния (например, онкологического заболевания). Термин терапевтический эффект относится также к ингибированию факторов роста, вызывающих или способствующих возникновению патологического состояния. Терапевтический эффект означает также в некоторой степени облегчение одного или более симптомов патологического заболевания. Относительно лечения онкологических заболеваний термин терапевтический эффект означает одно или более следующих воздействий (а) уменьшение размера опухоли (б) ингибирование (т.е. замедление или подавление) метастазирования опухоли (в) подавление роста опухоли и (г) в некоторой степени облегчение одного или более симптомов патологических состояний. Соединения, проявляющие эффективность против лейкемий, могут быть определены, как указано в данном тексте, за исключением того, что эти соединения вместо подавления метастазирования могут в большей степени замедлять или снижать пролиферацию или рост клеток. Термин патологическое состояние относится к функции клеток или тканей организма, которые отличаются от нормальной функции данного организма. Термин патологическое состояние может относиться к пролиферации клеток, дифференциации клеток или выживанию клеток. Патологические состояния, связанные с нарушением пролиферации клеток, включают онкологические заболевания, такие как фиброзные и мезангиальные нарушения, нарушения развития и образования кровеносных сосудов, заживление ран, псориаз, сахарный диабет и воспалительные процессы. Патологические состояния, связанные с нарушением дифференциации, включают (но не ограничены нейродегенеративными нарушениями) замедление процессов заживления ран и имплантации тканей. Патологические состояния, связанные с нарушением выживания клеток, относятся к состояниям, при которых активированы или нарушены пути запрогаммированной гибели клеток (апоптоз). Ряд протеинкиназ включены в пути апоптоза. Нарушение функции одной из протеинкиназ может привести к иммортализации клеток или к преждевременной гибели клеток. В данной области техники известны простые способы для оценки явлений пролиферации, дифференциации и выживания клеток. Такие способы могут включать наблюдение за количеством клеток или за внешним видом клеток под микроскопом в течение времени(например, дней). Термин введение в широком смысле означает обеспечение организма соединением и более конкретно способ введения соединения в клетки или ткани организма. Профилактику или лечение патологических состояний можно проводить, если клетки или ткани организма существуют внутри организма или вне организма. Клетки, существующие вне организма, можно культивировать или выращивать в чашках Петри. В данной области техники известен ряд способов введения соединений в клетки, существующие внутри организма,включая (но не ограничивая) способы орального, парентерального, кожного, инъекционного и аэрозольного введения. В данной области техники известен также ряд способов введения соединений в клетки, существующие вне организма, включая (но не ограничивая) методы микроинъекции, методы трансформации и методы с использованием носителей. Согласно изобретению, в способе профилактики или лечения патологических состояний организма используют соединение на основе 5-азахиноксалина, имеющее структуру,10 7598 1 2005.12.30 определенную формулой , как указано в данном тексте, или соответствующее любой подгруппе этих соединений, как определено в данном тексте, в частности, выбирают из группы, включающей соединения . Предпочтителен способ профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором организмом является млекопитающее. Термин млекопитающее относится к таким организмам, как мыши, крысы, кролики,морские свинки и козы, более предпочтительно - обезьяны и приматы, наиболее предпочтительно - человек. Предпочтительно способ относится к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором патологическим состоянием является онкологическое заболевание или фиброзные нарушения, а также к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором онкологическое заболевание выбирают из группы, включающей рак легких, рак яичников, рак молочной железы, рак мозга,рак внутриаксиального мозга, рак ободочной кишки, рак предстательной железы, саркома,саркома ксеродермы, меланома и глиома. В рамках изобретения способ относится также к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором патологическим состоянием являются состояния, связанные с нарушением пути трансдукции сигнала, характеризующихся взаимодействием между серин/треонин протеинкиназой и природным связывающим партнером. Термин путь трансдукции сигнала относится к распространению сигнала. В основном внешний сигнал передается через клеточную мембрану и превращается в внутриклеточный сигнал. Затем этот сигнал выбывает клеточный ответ. Термин включает также сигналы, которые распространяются только внутри клетки. Обычно к полипептидам,включенным в процессы трансдукции сигнала, относятся рецепторные и нерецепторные протеинкиназы, рецепторные и нерецепторные протеинфосфатазы, факторы нуклеотидного обмена и факторы транскрипции. Термин отклонение в сочетании с процессом трансдукции сигнала относится к протеинкиназе, которая находится в организме в сверхактивированном или подавленном состоянии. В результате мутаций фермент обладает пониженной или повышенной каталитической активностью по сравнению протеинкиназной активностью клеток дикого типа. В результате мутаций фермент не способен взаимодействовать с природным связывающим партнером и не модифицируется другой протеинкиназой или протеинфосфатазой. Термин активирование или нарушение патологического взаимодействия относится к способу, который осуществляется путем введения соединения по изобретению в клетки или ткани организма. Соединение может активировать взаимодействие между протеинкиназой и природными связывающими партнерами благодаря предпочтительным взаимодействиям с многочисленными атомами на межсубъединичной поверхности комплекса. В другом случае соединение ингибирует взаимодействие между протеинкиназой и природными связывающими партнерами благодаря разрушению предпочтительных взаимодействий между атомами на межсубъединичной поверхности комплекса. Способ относится также к способу профилактики или лечения патологических состояний организма, в котором серин/треонин протеинкиназой является .. Соединения и фармацевтические композиции согласно изобретению Другим предметом изобретения является соединение на основе 5-азахиноксалина общей формулы 3 4 7598 1 2005.12.30 где 1, 2, 3, 4 и 6 независимо выбирают из группы, включающей водород С 1-С 6-алкил, возможно замещенный фенилом-(Х 8)-ОН и -(Х 8)-О-Х 9, где Х 8 и Х 9 независимо выбирают из группы, включающей С 1-С 6-алкил и фенил, а 1 фенил и пиридил, возможно замещенные одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей С 1-С 6-алкил, С 1-С 6-алкокси, галоген, тригалогенметил, карбокси и 2 Х 1 - азот или кислород. В предпочтительном варианте 1, 2, 3, 4 и 6 независимо выбирают из группы,включающей фенил, возможно замещенный одним, двумя или тремя заместителями, независимо выбранными из группы, включающей С 1-С 6-алкил, галоген, тригалогенметил, гидрокси, С 1-С 6-алкокси, карбокси и 2. Предпочтительно 3 и 4 являются водородом,1 и 2 независимо выбирают из группы, включающей фенил, возможно замещенный заместителями, выбранными из группы, включающей С 1-С 6-алкил, галоген, гидрокси и С 1-С 6-алкокси. Более предпочтительно 1 и 2 независимо выбирают из группы, включающей водород, метил, фенил и 4-гидроксифенил. В предпочтительном варианте 1 - азот или кислород и предпочтительно заместители 6 и 1 объединены с образованием радикала, который выбирают из группы заместителей, представленных в данном описании. В одном из вариантов соединение представляет собой соединение, выбранное из группы соединений , представленных в таблице А. Термин заместителиозначает группу заместителей, включающую метокси,бензиламино, 4-фторбензиламино, 2-карбоксибензиламино, 3-карбоксибензиламино, 4-карбоксибензиламино,2-нитробензиламино, 3-нитробензиламино, 4-нитробензиламино,2-метилбензиламино, 3-метилбензиламино, 4-метилбензиламино,2-хлорбензиламино, 3-хлорбензиламино, 4-хлорбензиламино,2-фторбензиламино, 3-фторбензиламино, 4-фторбензиламино,2-(трифторметил)бензиламино, 3-(трифторметил)бензиламино,4-(трифторметил)бензиламино, фенетил-1-амино, фениламино,2-карбоксифениламино, 3-карбоксифениламино, 4-карбоксифениламино,2-нитрофениламино, 3-нитрофениламино, 4-нитрофениламино,2-метилфениламино, 3-метилфениламино, 4-метилфениламино,2-хлорфениламино, 3-хлорфениламино, 4-хлорфениламино,2-фторфениламино, 3-фторфениламино, 4-фторфениламино,2-(трифторметил)фениламино, 3-(трифторметил)фениламино,4-(трифторметил)фениламино, пирид-2-амино, пирид-3-амино, пирид-4-амино и пирид 2-метиламино. Термин бензиламино относится к группе, имеющей структуру, представленную следующей формулой 2 где арильный цикл может быть по выбору замещен в положении 2, 3 или 4. 12 7598 1 2005.12.30 Термин фениламино относится к группе, имеющей структуру, представленную следующей формулой где арильный цикл может быть по выбору замещен в положении 2, 3 или 4. Термин фенетил-1-амино относится к группе, имеющей структуру, представленную следующей формулой Термин пирид-2-амино относится к пиридиновому циклу, замещенному -группой в положении 2. Аналогично, термины пирид-3-амино и пирид-4-амино относятся к пиридиновому циклу, замещенному -группой в положении 3 и 4 соответственно. Еще одним предметом изобретения является фармацевтическая композиция для лечения патологических состояний организма, связанных с отклонением от нормы пути трансдукции сигнала, характеризующегося взаимодействием между серин/треонин протеинкиназой и природным связывающим партнером, содержащая эффективное количество соединения по изобретению или его соли и физиологически приемлемый носитель или разбавитель. Термин фармацевтическая композиция означает смесь соединения на основе 5-азахиноксалина по изобретению с другими химическими компонентами, такими как разбавители или носители. Фармацевтическая композиция способствует ускорению введения соединения в организм. В данной области техники известны многочисленные способы введения соединения, включая, но не ограничивая, оральный, инъекционный, аэрозольный,парентеральный и местный способы. Фармацевтические композиции могут быть также получены при взаимодействии соединений с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, паратолуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и т.п. Термин физиологически приемлемый относится к носителю или разбавителю, которые не приводят к снижению биологической активности и нейтрализации свойств соединения. Термин носитель относится к химическому соединению, которое способствует ускорению введения соединения в клетки или ткани. Например, диметилсульфоксид (ДМСО) является широко распространенным носителем для ускорения поглощения многих органических соединений клетками или тканями организма. Термин разбавитель относится к химическим соединениям, которые в виде водного раствора растворяют активное соединение, а также стабилизируют биологически активную форму соединения. В данной области техники в качестве разбавителей используют соли, растворенные в буферных растворах. Одним из самых широко используемых буферных растворов является фосфатный буферный раствор, содержащий хлорид натрия,так как указанный буферный раствор по составу аналогичен солевому составу крови человека. Так как соли буферного раствора могут поддерживать рН раствора в низкой концентрации, буферный разбавитель редко модифицирует биологическую активность соединения.. Способы синтеза по изобретению Предметом изобретения является также способ синтеза соединения по изобретению,заключающийся в том, что осуществляют взаимодействие 2-амино-6-хлор-3-нитропиридина со спиртом или амином в растворителе и в присутствии основания с образованием 13 7598 1 2005.12.30 первого промежуточного производного, затем первое промежуточное производное восстанавливают в присутствии катализатора и восстанавливающего агента с образованием второго промежуточного производного и проводят реакцию с 1,2-дионом с получением соответствующего конечного продукта, который далее очищают. В предпочтительном варианте спирт или амин выбирают из группы реагентов ,1,2-дион выбирают из группы, включающей 4-гидрокси-фенилглиоксаль и 1-фенил-1,2 пропандион, восстанавливающим агентом является водород, а катализатором является никель Ренея. Согласно предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором растворителем является -бутанол, а основанием является порошкообразный карбонат калия. Термин реагентыотносится к группе реагентов, включающей метанол, бензиламин, 4-фторбензиламин, 2-карбоксибензиламин, 3-карбоксибензиламин, 4-карбоксибензиламин, 2-нитробензиламин, 3-нитробензиламин, 4-нитробензиламин, 2-метилбензиламин, 3-метилбензиламин, 4-метилбензиламин, 2-хлорбензиламин, 3-хлорбензиламин,4-хлорбензиламин, 2-фторбензиламин, 3-фторбензиламин, 4-фторбензиламин, 2-(трифторметил)-бензиламин, 3-(трифторметил)бензиламин, 4-(трифторметил)бензиламин, фенетил 1-амин, анилин, 2-карбоксианилин, 3-карбоксианилин, 4-карбоксианилин, 2-нитроанилин,3-нитроанилин, 4-нитроанилин, 2-толуидин, 3-толуидин, 4-толуидин, 2-хлоранилин,3-хлоранилин, 4-хлоранилин, 2-фторанилин, 3-фторанилин, 4-фторанилин, 2-(трифторметил)-анилин, 3-(трифторметил)анилин, 4-(трифторметил)анилин, 2-аминопиридин, 3-аминопиридин, 4-аминопиридин и 2-метил-аминопиридин. Термин катализатор, использованный в данном описании, относится к молекуле, которая при добавлении к смеси реагентов увеличивает скорость взаимодействия реагентов с образованием конечных продуктов реакции. В данной области техники известно много типов катализаторов. Согласно другому предпочтительному варианту воплощения изобретения используют способ синтеза соединения по изобретению, в котором восстанавливающим агентом является водород. Описание сущности изобретения, представленное выше, не ограничивает объем изобретения, и другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из следующего описания предпочтительных вариантов воплощения изобретения, а также из формулы изобретения. Описание предпочтительных вариантов воплощения изобретения В настоящем изобретении в частности описаны способы модулирования функции серин/треонин протеинкиназ с помощью соединений на основе 5-азахиноксалина. Кроме того, изобретение в частности относится к способам идентификации соединений, модулирующих функцию серин/треонин протеинкиназ. Эти способы включают использование клеток, экспрессирующих серин/треонин протеинкиназу, такую как киназу .является нерецепторной протеинкиназой, которая включается в клеточную мембрану в процессе связывания с активированным ферментом , гидролизующим гуанинтрифосфат.активизируется в процессе связывания активированным рецептором тирозин протеинкиназы, таким какили , с белком-адаптором 2 и с фактором гуаниннуклеотидного обмена .отщепляет гуаниндифосфат от , заменяет его на гуанинтрифосфат, тем самым активируя . Затемсвязывается си в результате активирует . Затемможет фосфорилировать другие белковые мишени по остаткам серина и треонина, такие как киназу (МЕК), которая фосфорилирует и,следовательно, активирует митоген-активированную протеинкиназу (МАРК). Таким образом,является медиаторным фактором, контролирующим митоген-активированную трансдукцию сигнала. В связи с важной рольюв жизнедеятельности клеток модификации в аминокислотной последовательностимогут привести к изменению его функции и, следова 14 7598 1 2005.12.30 тельно, модифицировать поведение клеток. Рольв клеточной пролиферации подтверждается обнаружением взаимосвязи мутаций в аминокислотной последовательностис опухолями и онкологическими заболеваниями. Так как мутации в молекуле ,вызывающие онкологическое заболевание в клетках, приводят к образованию молекулс нерегулируемой каталитической активностью, то ингибиторымогут снизить или даже оборвать пролиферацию клеток, вызывающую онкологическое заболевание этих клеток. Способы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для определения соединений, модулирующих функцию протеинкиназыв клетках.фосфорилирует МЕК, которая в свою очередь фосфорилирует митоген-активированную протеинкиназу (МАРК). Методы определения только фосфорилирования МЕК с помощьюявляются не достаточно чувствительными, так как уровни фосфорилирования МЕК невысоки. Чтобы преодолеть эту проблему, в способ определения согласно изобретению включено определение фосфорилирования как МЕК, так и МАРК. Сигнал фосфорилирования МАРК усиливает сигнал фосфорилирования МЕК и позволяет определять уровень зависимого фосфорилирования методом иммуно-ферментного анализа (ИФА). Кроме того,способ согласно изобретению характеризуется высокой производительностью и таким образом, можно быстро проанализировать множество соединений за короткий период времени. С помощью способов согласно настоящему изобретению идентифицируют соединения, ингибирующие функцию протеинкиназы . Такими соединениями являются производные на основе 5-азахиноксалина. Хотя производные на основе 5-азахиноксалина хорошо изучены относительно их способности ингибировать ферменты, включенные в синтез нуклеотидов у бактерий, многие из этих соединений еще не достаточно исследованы по отношению к ингибированию протеинкиназ. Так какхарактеризуется высокой аминокислотной гомологией с другими серин/треонин протеинкиназами, можно предположить, что соединения на основе 5 азахиноксалина согласно изобретению будут ингибировать другие серин/треонин протеинкиназы, отличающиеся от . Таким образом, способы по изобретению относятся также к другим серин/треонин протеинкиназам, отличающимся от , включая рецепторные и нерецепторные серин/треонин протеинкиназы. Способы согласно изобретению относятся также к другим соединениям, которые модулируют функциюв клетках, так как высокая производительность этих способов позволяет анализировать большое число молекул за короткий промежуток времени. Следовательно, с помощью способов согласно изобретению можно идентифицировать ряд существующих молекул, не включенных в область данного изобретения и модулирующих функцию .. Биологическая активность соединений на основе 5-азахиноксалина Соединения на основе 5-азахиноксалина согласно настоящему изобретению анализируют по их способности ингибировать функцию протеинкиназы . Биологические способы анализа и результаты определения ингибирующей способности представлены в данном тексте описания. Для измерения модулирования функции протеинкиназы соединениями на основе 5-азахиноксалина используют методы с высокой производительностью, аналогичные опубликованным. в заявке на выдачу патента США, сер.08/702232(Комбинаторная библиотека индолинон-содержащих и аналогичных продуктов, способы лечения заболеваний),221/187, поданной 23 августа 1996 года. Заявка 088/702232 полностью включена в данное описание изобретения, включая любые фигуры.. Заболевания-мишени, предназначенные для лечения соединениями на основе 1,4,5 триазанафталина Разработанные в данном изобретении способы, соединения и фармацевтические композиции предназначены для ингибирования нарушений клеточной пролиферации путем 15 7598 1 2005.12.30 модулирования функции протеинкиназы . Нарушения пролиферации приводят к нежелательной пролиферации одной или более подгрупп клеток в многоклеточном организме, что в свою очередь наносит вред организму. Способы, соединения и фармацевтические композиции, описанные в данном тексте, могут быть также использованы для профилактики и лечения других нарушений в организме, таких как нарушения, связанные с преждевременной гибелью клеток (то есть неврологические заболевания) или с воспалительным процессом. Такие нарушения могут являться результатом несоответствующей функции молекулили несоответствующей функции молекул, подобных протеинкиназе . Эти десенсибилизирующие исследования с использованием киназыв качестве мишени свидетельствуют о том, что соединения на основе 5-азахиноксалина по изобретению, которые модулируют функцию протеинкиназы , могут снижать и по-видимому обращать пролиферацию злокачественных клеток в организме. Эти соединения на основе 5-азахиноксалина можно анализировать, с помощью методов, описанных в примере. Более того, эти соединения на основе 5-азахиноксалина можно анализироватьпо их влиянию на опухолевые клетки с использованием ксенотрансплантатных методов,также описанных в примере. Существует по крайней мере два пути, по которым несоответствующая активностьможет вызывать нежелательную клеточную пролиферацию определенного типа клеток (1) прямое стимулирование роста отдельной клетки или (2) увеличение новообразования кровеносных сосудов в отдельных участках, таких как опухолевая ткань, тем самым ускоряя рост ткани. Использование настоящего изобретения будет более эффективным, если прежде всего определить, зависит ли нарушение клеточной дифференциации от киназы . Как только такие нарушения идентифицированы, можно выявить пациентов, страдающих от таких нарушений, путем анализа симптомов с использованием процедур, хорошо известных терапевтам или ветеринарам, являющимся специалистами в данной области техники. Такие пациенты могут быть подвергнуты лечению, как указано в данном тексте описания. Определение зависимости нарушения клеточной пролиферации от киназыможно осуществить прежде всего путем определения уровня активностив клетке или в определенном участке тела пациента. Например, в случае раковых клеток уровень активности одной или болееможно сравнить с уровнем активности в клетках при независимых оти зависимых отонкологических заболеваниях. Если в опухолевых клетках наблюдается более высокий уровень активности , чем в клетках при зависимых отонкологических заболеваниях, предпочтительно равны и/или более по сравнению с зависимыми отонкологическими заболеваниями, то такие клетки являются объектом для лечения с использованием модулирующихспособов и соединений по изобретению. В случае нарушений клеточной пролиферации, возникающих из-за нежелательной пролиферации не-раковых клеток, уровень активностисравнивают с уровнем активности в основной популяции (например, средний уровень активности, наблюдаемый в основной популяции людей или животных за исключением людей или животных, страдающих от нарушений клеточной пролиферации). Если нарушение, связанное с нежелательной клеточной пролиферацией, характеризуется более высоким уровнем активностипо сравнению с наблюдаемым уровнем в основной популяции, то это нарушение является объектом для лечения с использованием описанных модулирующихспособов и соединений по изобретению.. Фармацевтические композиции и введение соединений на основе 5-азахиноксалина Способы получения фармацевтических композиций, содержащих соединения, способы определения количеств соединений для введения пациентам и способы введения 16 7598 1 2005.12.30 соединений в организм описаны. в заявке на выдачу патента США сер.08/702232(Комбинаторная библиотека индолинон-содержащих и аналогичных продуктов, способы лечения заболеваний),221/187, поданной 23 августа 1996 года, и. в международном патенте, публикация 96/2297632-(Водорастворимые производные 3-арилиден-2-оксиндола в качестве ингибиторов тирозинкиназы),опубликованной 1 августа 1996 г. Обе публикации полностью включены в данное описание изобретения, включая любые фигуры. Специалисту в данной области техники представляется очевидным, что указанные описания могут быть использованы в изобретении и могут быть легко приспособлены для использования в условиях изобретения. Примеры Приведенные ниже примеры не ограничивают область изобретения и представляют различные аспекты и признаки настоящего изобретения. В примерах описаны способы синтеза соединений настоящего изобретения и способы измерения эффекта соединения на функцию протеинкиназы . Использованные в методиках клетки имеются в продаже. Векторы нуклеиновых кислот, содержащиеся в клетках, также имеются в продаже, а последовательности генов различных протеинкиназ легко определить с помощью баз данных по последовательностям. Таким образом, специалист в данной области техники при необходимости может легко получить линии клеток с помощью комбинирования коммерческих препаратов клеток,векторов нуклеиновых кислот и генов белковых киназ, используя методы, легко доступные для специалиста в данной области техники. Пример 1 Методики синтеза на основе соединений 5-азахиноксалина по настоящему изобретению Настоящее изобретение проиллюстрировано следующими примерами без ограничения области изобретения, в которых, если особо не оговорено упаривание осуществляют на роторном испарителе в вакууме высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) проводят на обращеннофазном силикагеле-18 (, Дармштадт, Германия) выходы соединений приведены только для иллюстрации и не обязательно являются максимальными температуры плавления приведены без учета поправки и были определены с помощью цифрового прибора для определения температуры плавления 2000 структуры всех соединений формулыпо настоящему изобретению подтверждены спектроскопией протонного магнитного резонанса на спектрофотометре 500-, элементным микроанализом и, в определенных случаях, масс-спектроскопией чистоту соединений определяют с помощью тонкослойной хроматографиина силикагеле (д 60 254) или с помощью ВЭЖХ промежуточные соединения обычно полностью не характеризуют и чистоту оценивают методамиили ВЭЖХ. Методики синтеза Соединение А-2 5-Бензиламино-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин 4-Гидроксифенилглиоксаль получают из 4-гидроксиацетофенона (, ) согласно опубликованной методике (. . . ., 71, 1045 (1949. 2-Амино-6-бензиламино-3-нитропиридин получают нагреванием смеси 2-амино-6 хлор-3-нитропиридина (17,35 г, 0,10 моль), бензиламина(10,72 г, 0,10 моль) и порошкообразного карбоната калия (10,4 г, 0,35 моль) в н-бутаноле (100 мл) с обратным холодильником в течение 2 ч. Суспензию фильтруют и после охлаждения до комнатной 17 7598 1 2005.12.30 температуры твердый остаток собирают фильтрованием, промывают бутанолом и сушат в вакууме при 50 С, при этом получают 22,2 г (выход 91 ) 2-амино-6-бензиламино-3 нитропиридина, т. пл. 145-146 С. 6-Бензиламино-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин получают гидрированием 2-амино-6-бензиламино-3-нитропиридина под давлением 5,5 бар в атмосфере 2 в присутствии 10 гРенея в 400 мл диоксана при 60 С. Через 2 ч реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры, фильтруют, добавляют 4-гидроксифенилглиоксаль, затем перемешивают в атмосфере аргона. Полученную суспензию разбавляют водой, твердый остаток собирают фильтрованием, промывают водой, перекристаллизовывают из 2-пропанола и сушат при 50 С в вакууме, при этом получают 8 г (выход 24,4 ) 6-бензиламино-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалина, т. пл. 271-273 С. Соединение А-1 6-Фениламино-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин 6-Фениламино-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин получают по аналогичной методике, указанной в примере А-2, заменяя бензиламин на фениламин. Соединение А-3 6-Метокси-2-метил-3-фенил-5-азахиноксалин 6-Метокси-2-метил-3-фенил-5-азахиноксалин получают по аналогичной методике,указанной в примере А-2, заменяя 4-гидроксифенилглиоксаль на 1-фенил-1,2-пропандион и бензиламин на метанол. Соединение А-4 6-Метокси-2,3-дифенил-5-азахиноксалин 6-Метокси-2,3-дифенил-5-азахиноксалин получают по аналогичной методике, указанной в примере А-2, заменяя 4-гидроксифенилглиоксаль на фенил и бензиламин на метанол. Соединение А-5 6-(4-Фторбензиламино)-2-метил-3-фенил-5-азахиноксалин 6-(4-Фторбензиламино)-2-метил-3-фенил-5-азахиноксалин получают по аналогичной методике, указанной в примере А-2, заменяя 4-гидроксифенилглиоксаль на 1-фенил-1,2 пропандион и бензиламин на 4-фторбензиламин. Соединение А-6 2,3-Дифенил-6-(4-фторбензиламино)-5-азахиноксалин 2,3-Дифенил-6-(4-фторбензиламино)-5-азахиноксалин получают по аналогичной методике, указанной в примере А-2, заменяя 4-гидроксифенилглиоксаль на бензил и бензиламин на 4-фторбензиламин. Соединение А-7 3-Фенил-6-фениламино-5-азахиноксалин 3-Фенил-6-фениламино-5-азахиноксалин получают по аналогичной методике, указанной в примере А-2, заменяя 4-гидроксифенилглиоксаль на фенилглиоксаль и бензиламин на анилин. Соединения А-8 - А-26 Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А-2,заменяя бензиламин на соответственно замещенный бензиламин. Соединение А-8 6-(2-Карбоксибензиламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-9 6-(3-Карбоксибензиламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-10 6-(4-Карбоксибензиламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-11 3-(4-Гидроксифенил)-6-(2-нитробензиламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-12 3-(Гидроксифенил)-6-(3-нитробензиламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-13 3-(4-Гидроксифенил)-6-(4-нитробензиламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-14 3-(4-Гидроксифенил)-6-(2-метилбензиламино)-5-азахиноксалин. 18 7598 1 2005.12.30 Соединение А-15 3-(4-Гидроксифенил)-6-(3-метилбензиламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-16 3-(4-Гидроксифенил)-6-(4-метилбензиламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-17 6-(2-Хлорбензиламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-18 6-(3-Хлорбензиламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-19 6-(4-Хлорбензиламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-20 6-(2-Фторбензиламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-21 6-(3-Фторбензиламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-22 6-(4-Фторбензиламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-23 3-(4-Гидроксифенил)-6-2-(трифторметил)бензиламино-5-азахиноксалин. Соединение А-24 3-(4-Гидроксифенил)-6-3-(трифторметил)бензиламино-5-азахиноксалин. Соединение А-25 3-(4-Гидроксифенил)-6-4-(трифторметил)бензиламино-5-азахиноксалин. Соединение А-26 3-(4-Гидроксифенил)-6-(фенетил-1-амино)-5-азахиноксалин. Соединения А-27 - А-48 Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А 2, заменяя бензиламин на соответственно замещенный анилин. Соединение А-27 6-(2-Карбоксифениламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-28 6-(3-Карбоксифениламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-29 6-(4-Карбоксифениламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-30 3-(4-Гидроксифенил)-6-(2-нитрофениламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-31 3-(4-Гидроксифенил)-6-(3-нитрофениламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-32 3-(4-Гидроксифенил)-6-(4-нитрофениламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-33 3-(4-Гидроксифенил)-6-(2-метилфениламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-34 3-(4-Гидроксифенил)-6-(3-метилфениламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-35 3-(4-Гидроксифенил)-6-(4-метилфениламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-36 6-(2-Хлорфениламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-37 6-(3-Хлорфениламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-38 6-(4-Хлорфениламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-39 6-(2-Фторфениламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. 19 7598 1 2005.12.30 Соединение А-40 6-(3-Фторфениламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-41 6-(4-Фторфениламино)-3-(4-гидроксифенил)-5-азахиноксалин. Соединение А-42 3-(4-Гидроксифенил)-6-(2-трифторметил)фениламино-5-азахиноксалин. Соединение А-43 3-(4-Гидроксифенил)-6-(3-трифторметил)фениламино-5-азахиноксалин. Соединение А-44 3-(4-Гидроксифенил)-6-(4-трифторметил)фениламино-5-азахиноксалин. Соединение А-45 3-(4-Гидроксифенил)-6-(пирид-2-амино)-5-азахиноксалин. Соединение А-46 3-(4-Гидроксифенил)-6-(пирид-3-амино)-5-азахиноксалин. Соединение А-47 3-(4-Гидроксифенил)-6-(пирид-4-амино)-5-азахиноксалин. Соединение А-48 3-(4-Гидроксифенил)-6-(пирид-2-метиламино)-5-азахиноксалин. Соединения А-49 - А-67 Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А-2,заменяя бензиламин на соответственно замещенный бензиламин и 4-гидроксифенилглиоксаль на фенилглиоксаль. Соединение А-49 6-(2-Карбоксибензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-50 6-(3-Карбоксибензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-51 6-(4-Карбоксибензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-52 6-(2-Нитробензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-53 6-(3-Нитробензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-54 6-(4-Нитробензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-55 6-(2-Метилбензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-56 6-(3-Метилбензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-57 6-(4-Метилбензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-58 6-(2-Хлорбензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-59 6-(3-Хлорбензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-60 6-(4-Хлорбензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-61 б-(2-Фторбензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-62 6-(3-Фторбензиламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-63 6-(4-Фторбензиламино)3-фенил-5-азахиноксалин. 20 7598 1 2005.12.30 Соединение А-64 3-Фенил-6-2-(трифторметил)бензиламино-5-азахиноксалин. Соединение А-65 3-Фенил-6-3-(трифторметил)бензиламино-5-азахиноксалин. Соединение А-66 3-Фенил-6-4-(трифторметил)бензиламино-5-азахиноксалин. Соединение А-67 3-Фенил-6-(фенетил-1-амино)-5-азахиноксалин. Соединения А-68 - А-89 Следующие соединения получают по аналогичной методике, указанной в примере А-2,заменяя бензиламин на соответственно замещенный анилин и 4-гидроксифенилглиоксаль на фенилглиоксаль. Соединение А-68 6-(2-Карбоксифениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-69 6-(3-Карбоксифениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-70 6-(4-Карбоксифениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-71 6-(2-Нитрофениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-72 6-(3-Нитрофениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-73 б-(4-Нитрофениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-74 6-(2-Метилфениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-75 6-(3-Метилфениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-76 6-(4-Метилфениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-77 6-(2-Хлорфениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-78 6-(3-Хлорфениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-79 6-(4-Хлорфениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-80 6-(2-Фторфениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-81 6-(3-Фторфениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-82 6-(4-Фторфениламино)-3-фенил-5-азахиноксалин. Соединение А-83 3-Фенил-6-(2-трифторметил)фениламино-5-азахиноксалин. Соединение А-84 3-Фенил-6-(3-трифторметил)фениламино-5-азахиноксалин. Соединение А-85 3-Фенил-6-(4-трифторметил)фениламино-5-азахиноксалин. Соединение А-86 3-Фенил-6-(пирид-2-амино)-5-азахиноксалин. Соединение А-87 3-Фенил-6-(пирид-3-амино)-5-азахиноксалин. 21 7598 1 2005.12.30 Соединение А-88 3-Фенил-6-(пирид-4-амино)-5-азахиноксалин. Соединение А-89 3-Фенил-6-(пирид-2-метиламино)-5-азахиноксалин. Соединение А-90 6-Фениламино-3-(4-метоксифенил)-5-азахиноксалин 6-Фениламино-3-(4-метоксифенил)-5-азахиноксалин получают по аналогичной методике, указанной в примере А-1, заменяя 4-гидроксифенил на 4-метоксифенил. Пример 2 Метод определения фосфорилирующей функцииЭтот метод анализа позволяет определить степень фосфорилирования МЕК (белкамишени протеинкиназы ), а также степень фосфорилирования МАРК (белка-мишени протеинкиназы МЕК). Последовательность генаописана в статье., 1985,5 1400-1407, и может быть получена в различных базах данных по последовательностям генов. Конструкция вектора нуклеиновой кислоты и клеточных линий,использованных на данной стадии по изобретению, полностью описана в статье., 1988, 85 8855-8859. Материалы и реагенты 1. Клетки 9 ( ) -, , . 2. Буфер 20 мМ /7,4, 137 мМ , 10 раствор глицерина, 1 мМ, 5 мг/л апротенина, 0,5 Тритон Х-100. 3. Гибридный белок тиоредоксин-МЕК (-МЕК) экспрессию и очистку -МЕК афинной хроматографией осуществляют согласно рекомендациям производителей (каталог К 350-01 и 350-40,.,, ). 4. - ( 2) экспрессию -содержащего МАРК осуществляют в клетках 1 , трансформированных вектором 18, кодирующим . очищают -афинной хроматографией по известной методике (каталог 27-4949-01, , , ). 5. Антитела овцы противмыши,,(каталог 515006-008,28563). 6. Антитела, специфичные к протеинкиназе белка -1 2653 фирмы . 7. Буфер для нанесения , раствор хлорида натрия в фосфатном буфере фирмы-, , . 8. Буфер для промывки- 50 мМ Трис/ рН 7,2, 150 мМ , 0,1 Тритон Х-100. 9. Блокирующий буфер , 0,1 этанолимин рН 7,4. 10. ДМСО, фирмы , ., . 11. Буфер для киназной реакции 20 мМ / рН 7,2, 150 мМ , 0,1 Тритон Х-100, 1 мМ , 5 мг/л апротенина, 75 мМ ортованадата натрия, 0,5 мМи 10 мМ 2. 12. Смесь АТФ 100 мМ МдС 2, 300 мкМ АТФ, 10 мкКи -33 Р АТФ /мл. 13. Раствор для остановки реакции 1 фосфорная кислота фирмы , ,. 14. Полоски фильтровальной бумаги на основе фосфата целлюлозыфирмы, , . 15. Раствор для промывки фильтров 1 фосфорная кислота фирмы , ,. 16. Устройство, фирмы , , . 17. Ридер, , . 18. Полипропиленовые планшеты для ИФА с -образным дном с 96 ячейками фирмы(, -72092). 22 7598 1 2005.12.30 Методика Все следующие стадии осуществляют при комнатной температуре, если специально не оговорено. 1. Нанесение антител в ячейки планшета наносят (по 100 мкл в ячейку) очищенную специфичную антисыворотку овцы против антител мыши (1 мкг/100 мкл буфера для нанесения) в течение ночи при 4 С. Планшеты можно использовать в течение 2 недель при хранении при 4 С. 2. Переворачивают планшету и удаляют жидкость. Добавляют по 100 мкл блокирующего раствора и инкубируют в течение 30 мин. 3. Удаляют блокирующий раствор и промывают 4 раза буфером для промывки. Помещают чашку на бумажное полотенце и удаляют избыток жидкости. 4. В каждую ячейку добавляют по 1 мкг антител, специфичных к -1 и инкубируют в течение 1 ч. Промывают, как описано на стадии 3. 5. Размораживают лизаты клеток 9, инфицированных /, и разбавляют их буферомдо концентрации 10 мкг/100 мкл. В ячейки добавляют по 10 мкг разбавленного лизата и инкубируют в течение 1 ч. В процессе инкубирования планшеты встряхивают. В отрицательном контроле лизат не добавляют. Лизаты из клеток насекомых 9,инфицированных /, получают после инфицирования клеток рекомбинантными бакуловирусами (5 на каждый вирус) и сбора клеток через 48 ч. Клетки промывают 1 рази лизируют в буфере . Нерастворимые компоненты удаляют центрифугированием (5 мин при 10 ОООхд). Аликвоты лизатов замораживают в смеси сухой лед/этанол и хранят при -80 С до использования. 6. Несвязанные компоненты удаляют и промывают, как описано выше (стадия 3). 7. В каждую ячейку добавляют 2 мкг -МЕК и 2 мкг - и доводят объем до 40 мкл буфером для киназной реакции, методы очистки -МЕК и МАРК из клеточных экстрактов описаны ниже в примере. 8. Соединение (исходный раствор 10 мг/мл ДМСО) или 20-кратные экстракты предварительно разбавляют в смеси 1 ДМСО. В лунку добавляют по 5 мкл предварительно разбавленных соединений/экстрактов, описанных на стадии 6. Инкубируют в течение 20 мин. В контроле лекарственные вещества отсутствуют. 9. Киназную реакцию активируют добавлением 5 мкл смеси АТФ, во время инкубирования планшет встряхивают на шейкере для планшетов ИФА. 10. Киназную реакцию останавливают через 60 мин добавлением в каждую лунку 30 мкл буфера для остановки реакции. 11. Фосфоцеллюлозные полоски фильтровальной бумаги и планшет помещают в устройство . Осуществляют процесс сбора и фильтр промывают раствором для промывки фильтров в соответствии с рекомендациями поставщиков. Полоски фильтровальной бумаги сушат. Полоски фильтровальной бумаги запечатывают и помещают их в держатель. Держатель помещают в прибор для определения радиоактивности и в фильтрах определяют количество радиоактивного фосфора. Другой способ аликвоты объемом 40 мкл из отдельных лунок планшета можно перенести в соответствующие позиции фосфоцеллюлозных полосок фильтровальной бумаги. После сушки фильтров на воздухе их помещают в поддон. Поддон аккуратно покачивают и меняют промывной раствор каждые 15 мин в течение 1 ч. Полоски фильтровальной бумаги сушат на воздухе. Полоски фильтровальной бумаги запечатывают и помещают их в держатель, подходящий для определения количества радиоактивного фосфора в образцах. Держатель помещают в измерительный прибор и в полосках определяют количество радиоактивного фосфора. Величины 50 определяют в соответствии с методикой для соответствующих соединений на основе 5-азахиноксалина методом ИФА 1 23 Величина 50 - концентрация ингибитора на основе 5-азахиноксалина, (52) которая приводит к уменьшению количества фосфорилированного белка-мишени или клеточного роста на 50 . Величины 50, определенные по степени фосфорилирования -1 методом ИФА, представлены в табл. 1. Пример 3 Очистка МАРК и МЕК Белки МАРК и МЕК легко экспрессируются в клетки субклонированием гена, кодирующего последовательность данных белков, в промышленно выпускаемый вектор, который экспрессирует белки с полигистидиновым фрагментом. Гены, кодирующие последовательности этих белков, можно получить в соответствующих лабораториях или с помощью клонирования этих генов в клетках, содержащих библиотеки кДНК. Библиотеки выпускаются фирмами и специалисты в данной области техники могут легко создать зонды нуклеиновых кислот, гомологичные молекулам кДНК, кодирующих последовательно 24 7598 1 2005.12.30 сти МЕК или МАРК, с использованием последовательностей нуклеиновых кислот МЕК и МАРК, доступных в различных базах данных генов, таких как . Клонирование гена можно провести очень быстро с использованием методик, легко доступных для специалистов в данной области. Очистка белков МЕК и МАРК из клеточных экстрактов может быть проведена с использованием следующего модифицированного способа, описанного в статье., 1993, . . . 268 5097-5106. 1. Клетки лизируют методами озвучивания, осмотического шока или гомогенизатора типа, легко доступными для специалистов в данной области. Необходимый буфер для озвучивания описан ниже. 2. Твердый носитель, предварительно связанный с ионами никеля или кобальта, уравновешивают в равновесном буфере, описанном ниже. Полигистидиновый фрагмент белка специфически связывается с атомами кобальта или никеля на твердом носителе. Уравновешивание достигается 3-кратным промыванием смолы 10 объемами равновесного буфера по отношению к объему твердого носителя. Твердый носитель легко доступен для специалистов в данной области. 3. Клеточные лизаты добавляют к твердому носителю и уравновешивают в сосуде в течение некоторого периода времени. Другим способом, твердый носитель можно поместить в хроматографическую колонку и провести хроматографию лизата на твердом носителе. 4. Твердый носитель промывают буфером для промывки, описанным ниже. 5. Белки МЕК и МАРК элюируют необходимым количеством буфера для промывки(описанным ниже) для элюции основного количества белка из твердого носителя. Буфер для озвучивания 50 мМ фосфат натрия рН 8,0 0,3 хлорид натрия 10 мМ/-меркаптоэтанол 140 10 м 0,5 мМУравновешивающий буфер 50 мМ фосфат натрия рН 8,0 0,3 хлорид натрия 10 мМ/-меркаптоэтанол 140 10 мМ 1 мМ имидазол Буфер для промывки 50 мМ фосфат натрия рН 8,0 0,3 хлорид натрия 10 мМ/-меркаптоэтанол 140 10 мМ 10 мМ имидазол Буфер для элюирования 50 мМ фосфат натрия рН 8,0 0,3 хлорид натрия 10 мМ/-меркаптоэтанол 140 10 мМ 10-500 мМ имидазол 25 7598 1 2005.12.30 Пример 4 Метод определения фосфорилирующей функции рецептораКиназную активность рецептора(метод анализа -33) в целых клетках определяют, как подробно описано в 960116, поданной 5 июня 1996 г. авторами.(Соединения индолинона для лечения заболеваний), полностью включенной в настоящее описание,включая любые фигуры. Величины 50, определенные методом определения фосфорилирующей функции рецептора , представлены в табл. 2. Пример 5 Метод определения эффекта соединений на основе 5-азахиноксалина на рост клеток,экспрессирующихПриведенный ниже метод предназначен для определения скоростей роста клеток 33, экспрессирующих . Цель метода заключается в определении эффекта соединений на рост клеток -33, экспрессирующих -. Материалы Стерильные планшеты с 96 ячейками с плоским дном Стерильные планшеты с 96 ячейками с круглым дном Стерильная емкость объемом 25 мл или 100 мл Пипетки, многоканальный пипетман Стерильные наконечники для пипеток Стерильные пробирки объемом 15 мл и 50 мл Реагенты 0,4 в 1 уксусной кислоте 10 мМ Трис-основание 10 ТХУ (трихлоруксусная кислота) 1 уксусная кислота Стерильный ДМСОСоединение в ДМСО (100 мМ или менее концентрированный раствор) Трипсин-ЭДТА ( ) Клеточная линия 3 Т 3/- (клон 7 клеток 3 Т 3, экспрессирующих геномный фрагмент гена онкогенной -). Клетки получают в соответствии со следующей методикой 1. Фрагмент гена, кодирующий последовательность , субклонируют в промышленно выпускаемый вектор, который будет стабильно трансфектировать клетки -33. Этот фрагмент происходит из генетически трансформированной аллели -. 2. Клетки -33 трансфектируют субклонированным вектором фосфаткальциевым методом. Клетки, экспрессирующие , отбирают в 2 сыворотку в . Заметные колонии наблюдают через 2 недели. Трансформированные клетки собирают для создания устойчивой трансформированной клеточной линии. Среда роста 2 сыворотка теленка/2 мМ глутамин, / Методика День 0 Нанесение клеток на планшеты Данную стадию метода осуществляют в ламинаре. 1. Клетки обрабатывают трипсином. 200 мкл суспензии клеток переносят в 10 мл изотонного буфера. Число клеток подсчитывают с помощью прибора. 2. Клетки разбавляют до концентрации 60 000 клеток/мл средой для роста. В каждую ячейку планшета с 96 ячейками с плоским дном переносят по 100 мкл клеток, т.е. по 6000 клеток на ячейку. 26 7598 1 2005.12.30 3. Для каждого соединения используют половину планшеты (четыре ряда) и по четыре ячейки для каждой концентрации соединения. Четыре ячейки оставляют для контроля среды. 4. Мягко встряхивают планшет для равномерного связывания с клетками. 5. Планшет инкубируют при 37 С в инкубаторе, содержащем 102. День 1 Добавление соединения Данную стадию проводят под ламинаром. 1. В планшет с 96 ячейками с круглым дном в каждую ячейку вертикальных рядов(столбцов) с 1 по 11 добавляют по 120 мкл среды для роста, содержащей ДМСО, с концентрацией в 2 раза большей (2 х) по сравнению с конечной концентрацией ДМСО, определенной для самой высокой концентрации тестируемого соединения. Например, если самая высокая концентрация определена в 100 мкл, которые были получены из концентрированного раствора (100 мМ), то концентрация 1 х ДМСО равна 0,1 , тогда как 2 х ДМСО будет составлять 0,2 . Этот планшет используют для титрования соединения, четыре ряда на 1 соединение. 2. В стерильной пробирке объемом 15 мл готовят раствор 2 х с самой высокой концентрацией соединения в среде роста 2 х ДМСО. Требуется 1 мл на 1 клеточную линию. Начальная концентрация соединения обычно составляет 100 мкМ, но может изменяться в зависимости от растворимости соединения. 3. В четыре ячейки столбца 12 планшета с 96 ячейками с круглым дном помещают по 240 мкл исходного раствора 2 х с начальной концентрацией соединения. Проводят серию разбавлений 12 по направлению справа налево, перенося по 12 мкл из ячейки колонки 12 в ячейку колонки 11, из ячейки колонки 11 в ячейку колонки 10 и так далее до ячейки колонки 2. Затем переносят по 100 мкл разбавлений соединения и по 100 мкл среды из колонки 1 в соответствующие ячейки планшета с 96 ячейками с плоским дном, в которых содержится по 100 мкл суспензии клеток. Общий объем в ячейке должен составлять 200 мкл. 4. Снова помещают планшет в инкубатор и инкубируют в течение 3 дней. День 4 Окрашивание клеток Данную стадию проводят на лабораторном столе. 1. Среду удаляют. В каждую ячейку добавляют по 200 мкл холодного раствора 10 ТХУ для фиксирования клеток. Планшет инкубируют по меньшей мере в течение 60 мин при 4 С. 2. ТХУ удаляют и промывают ячейки водопроводной водой 5 раз. Планшет сушат,помещая его рабочей стороной на бумажные полотенца. 3. Клетки окрашивают, добавляя в каждую ячейку по 100 мкл 0,4 раствораи инкубируя планшет в течение 10 мин. 4. Растворудаляют и ячейки промывают 1 уксусной кислотой 5 раз. Планшет сушат, помещая его рабочей стороной на бумажные полотенца. 5. Краситель солюбилизируют, добавляя в каждую ячейку по 100 мкл 10 мМ раствора Трис-основания и инкубируя в течение 5-10 мин при перемешивании на качалке. 6. Поглощение измеряют при 570 нм по сравнению с 630 нм, помещая планшет в ридер. Отбирают соединения, ингибирующие скорость роста клеток, экспрессирующих ,как представлено в табл. 3. Пример 6 Метод определения эффекта соединений на основе 5-азахиноксалина на рост клеток А 549 Приведенный ниже метод предназначен для определения скоростей роста клеток А 549. Цель метода заключается в определении эффекта соединений на рост клеток А 549 карциномы легкого человека. Эти клетки можно получить на фирмах, таких как 7598 1 2005.12.30 Материалы Стерильные планшеты с 96 ячейками с плоским дном Стерильные планшеты с 96 ячейками с круглым дном Стерильная емкость объемом 25 мл или 100 мл Пипетки, многоканальный пипетман Стерильные наконечники для пипеток Стерильные пробирки объемом 15 мл и 50 мл Реагенты 0,4 в 1 уксусной кислоте 10 мМ Трис-основание 10 ТХУ 1 уксусная кислота Стерильный ДМСОСоединение в ДМСО (исходный раствор с концентрацией 100 мМ или менее) Трипсин-ЭДТА ( ) Клеточная линия и среда роста Клетки А 549 карциномы легкого человека ( 185) 10 сыворотка эмбриона теленка в среде 12 Методика День 0 Нанесение клеток на планшеты Данную стадию осуществляют в ламинаре. 1. Клетки обрабатывают трипсином. 200 мкл суспензии клеток переносят в 10 мл изотонного буфера. Число клеток подсчитывают с помощью прибора. 2. Клетки разбавляют до концентрации 20000 клеток/мл средой для роста. В каждую ячейку планшета с 96 ячейками с плоским дном переносят по 100 мкл клеток, т.е. по 2000 клеток на ячейку. 3. Для каждого соединения используют половину планшета (четыре ряда) и по четыре ячейки для каждой концентрации соединения. Четыре ячейки оставляют для контроля среды. 4. Мягко встряхивают планшеты для равномерного связывания с клетками. 5. Планшеты инкубируют при 37 С в инкубаторе, содержащем 102. День 1 Добавление соединения Данную стадию проводят под ламинаром. 1. В планшет с 96 ячейками с круглым дном в каждую ячейку вертикальных рядов(столбцов) с 1 по 11 добавляют по 120 мкл среды для роста, содержащей ДМСО, с концентрацией в 2 раза большей (2 х) по сравнению с конечной концентрацией ДМСО, определенной для самой высокой концентрации тестируемого соединения. Например, если самая высокая концентрация составляет 100 мкМ, которая была получена из концентрированного раствора (100 мМ), то концентрация 1 х ДМСО равна 0,1 , тогда как 2 х ДМСО будет составлять 0,2 . Этот планшет используют для титрования соединения, по четыре ряда на 1 соединение. 2. В стерильной пробирке объемом 15 мл готовят раствор с самой высокой концентрацией соединения в среде роста 2 х ДМСО. Требуется 1 мл на 1 клеточную линию. Начальная концентрация соединения обычно составляет 100 мМ, но может изменяться в зависимости от растворимости соединения. 3. В четыре ячейки столбца 12 планшета с 96 ячейками с круглым дном помещают по 240 мкл исходного раствора 2 х с начальной концентрацией соединения. Проводят серию разбавлений 12 по направлению справа налево, перенося по 120 мкл из ячейки колонки 12 в ячейку колонки 11, из ячейки колонки 11 в ячейку колонки 10 и так далее до ячейки колонки 2. Затем переносят по 100 мкл разбавлений соединения и по 100 мкл среды из колонки 1 в соответствующие ячейки планшета с 96 ячейками с плоским дном, в которых содержится по 100 мкл суспензии клеток. Общий объем в ячейке должен составлять 200 мкл. 28 7598 1 2005.12.30 4. Снова помещают планшет в инкубатор и инкубируют в течение 3 дней. День 5 Окрашивание клеток Данную стадию проводят на лабораторном столе. 1. Среду удаляют. В каждую ячейку добавляют по 200 мкл холодного раствора 10 ТХУ для фиксирования клеток. Планшет инкубируют по крайней мере в течение 60 мин при 4 С. 2. ТХУ удаляют и промывают ячейки водопроводной водой 5 раз. Планшет сушат,помещая его рабочей стороной на бумажные полотенца. 3. Клетки окрашивают, добавляя в каждую ячейку по 100 мкл 0,4 раствораи инкубируя планшет в течение 10 мин. 4. Растворудаляют и ячейки промывают 1 уксусной кислотой 5 раз. Планшет сушат, помещая его рабочей стороной на бумажные полотенца. 5. Краситель солюбилизируют, добавляя в каждую ячейку по 100 мкл 10 мМ раствора Трис-основания и инкубируя в течение 5-10 мин при перемешивании на качалке. 6. Поглощение измеряют при 570 нм по сравнению с 630 нм, помещая планшет в ридер. Отбирают соединения, ингибирующие скорость роста клеток А 549, как представлено в табл. 4. Пример 7 Метод определения биологической активности модуляторовКсенотрансплантатный анализ используют для измерения ингибирующей способности соединений по изобретению по отношению к клеткам опухолей яичников, меланомы,предстательной железы, легкого и молочной железы. Методика анализа подробно описана. в публикации 9640116, поданной 5 июня 1996 г.,(Соединения индолинона для лечения заболеваний) и полностью включенной в текст настоящего описания в качестве ссылки, включая любые фигуры. Иллюстративно описанное в данном тексте изобретение может быть использовано соответствующим образом при отсутствии любого элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые подробно не описаны в данном тексте. Использованные в данном тексте термины и выражения следует рассматривать как описательные термины, а не ограничивающие термины, и не следует считать, что при использовании таких терминов и выражений исключены любые эквиваленты рассмотренных или описанных признаков,или их части. Однако следует понимать, что в пределах области заявленного изобретения возможны различные модификации и варианты. Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение подробно описано в виде предпочтительных вариантов воплощения изобретения и необязательных признаков, специалисты в данной области техники могут использовать модификации и варианты описанных в данном тексте концепций и что такие модификации и варианты будут находиться пределах области изобретения,заявленной в формуле изобретения. Те ссылки, которые не были предварительно включены в текст описания в качестве ссылок, включая патентные и непатентные публикации, должны быть полностью включены в текст описания для всех целей. Другие варианты воплощения изобретения заявлены в следующих пунктах формулы. Таблица А метил фенил метил фенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил фенил фенил фенил фенил фенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил 4-гидроксифенил фениламино фениламино метокси метокси 4-фторбензиламино 4-фторбензиламино фениламино 2-карбоксибензиламино 3-карбоксибензиламино 4-карбоксибензиламино 2-нитробензиламино 3-нитробензиламино 4-нитробензиламино 2-метилбензиламино 3-метилбензиламино 4-метилбензиламино 2-хлорбензиламино 3-хлорбензиламино 4-хлорбензиламино 2-фторбензиламино 3-фторбензиламино 4-фторбензиламино 2-(трифторметил)бензиламино 3-(трифторметил)бензиламино 4-(трифторметил)бензиламино фенетил-1-амино 2-карбоксифениламино 3-карбоксифениламино 4-карбоксифениламино 2-нитрофениламино 3-нитрофениламино 4-нитрофениламино 2-метилфениламино 3-метилфениламино 4-метилфениламино 2-хлорфениламино 3-хлорфениламино 4-хлорфениламино 4-хлорфениламино 3-фторфениламино 4-фторфениламино 2-(трифторметил)фениламино 3-(трифторметил)фениламино 4-(трифторметил)фениламино пирид-2-амино пирид-3-амино