Высокоафинные мутеины интерлейкина-4

2. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 1, отличающийся тем, что указанную замену производят в положениях, выбранных из группы, включающей положения 5, 11, 13 и 16 для альфа-спирали А, И 77, 78, 81, 84, 85, за исключением замены К 85 О, и 89 для альфа-спирали С.3. Рекомбинантный мутеин человеческого П-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 13 представляет собой треонин на аспартат.4. Рекомбинантный мутеин человеческого 11-4 по п. 3, отличающийся тем, что он кодирован последовательностью ДНК, представленной в виде БЕО П) ЫО 9, или ее стабильно гибридизуемым вариантом.5. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на аланин.6. Рекомбинантный мутеин человеческого 11-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на аспартат.7. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на гистидин.8. Рекомбинантный мутеин человеческого 114-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на изолейцин.9. Рекомбинантный мутеин человеческого П.-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на лейцин.10. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на глютамин.11. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на аргинин.12. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на треонин.13. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на валин.14. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на тирозин.15. Рекомбинантный мутеин человеческого 114-4 по п. 2, отличающийся тем, что замена в положении 16 представляет собой серин на лизин.16. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 1, отличающийся тем, что представляет собой аминокислотную последовательность, представленную в виде ЗЕО 113 МО 8.17. Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики заболевания, опосредованного 11,4, содержащая рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь 4 по п. 1 в терапевтически эффективном количестве И фармацевтически приемлемый носитель.18. Аминокислотная последовательность, определяющая рекомбинантный мутеин человеческого 11 д-4 по п. 1.19. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный мутеин человеческого 11-4 по п. 1.20, Линия клеток СНО трансформированная последовательностью по п. 19.21. Линия клеток СНО, экспрессирующая рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 4.22. Рекомбинантный мутеин человеческого 11-4, аминокислотная последовательность которого пронумерована в соответствии с последовательностью 1 Ь-4 дикого типа, представленной в виде ЗЕО 113 НО 1, и содержитб) по крайней мере, одну аминокислотную замену в связывающей поверхности либо альфа-спирали А, либо альфа-спирали С, посредством которой указанный мутеин связывается с рецептором 1 Ь-4 Коъ с большим сродством, чем П-4 дикого типа.23. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 22, отличающийся тем, что указанную замену производят в положениях, выбранных из группы, включающей положения 5,11, 13 И 16 для альфа-спирали А и 77, 78, 81, 84, 85, за исключением замены 12850, и 89 для альфа-спирали С.24. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 23, отличающийся тем, что замена в положении 13 представляет собой треонин на аспартат.25. Рекомбинантный мутеин человеческого П-4 по п. 24, отличающийся тем, что он кодирован последовательностью ДНК, представленной в виде ЗЕО П) МО 9, или ее стабильно гибридизуемым вариантом.26. Рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 22, отличающийся тем, что представляет собой аминокислотную последовательность, представленную в виде ЗЕО П) ЫО 9.27. Фармацевтическая композиция для лечения и профилактики заболевания, опосре дованного 1 Ь-4, содержащая рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 22 в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый носитель.28. Полинуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантный мутеин человеческого 1 Ь-4 по п. 22.29. Линия клеток СНО, трансформированная последовательностью по п. 28.30. Линия клеток СНО, экспрессирующая рекомбинантный мутеин человеческого Ц 4 по п. 25.Изобретение относится, главным образом, к областям фармакологии и иммунологии. Более конкретно, изобретение направлено на новые варианты из семейства цитокинов и, в частности, человеческий интерлейкин-4 (1 Ь-4).Интерлейкин-4 (1 Ь-4) представляет собой гликопротеин массой 15 кда,секретируемый активированными Т-клетками (Ночь/ага е а 1., 1. Ехр. Мес 1. 155914(1982, тучными клетками (Вгошп е а 1., Се 11 502809 (1987 и базофилами (Беаег е а 1., Ргос. Май. Аса 1. 01 НЗА 882835 (1991, который регулирует Широкий спектр клеточных функций кроветворных и некроветворных клеток. Последовательность описана в патенте США Не 5017691. Интерлейкин-4 (1 Ь-4) представляет собой плейотропный цитокин, обладающий эффектами на клетки иммунной системы, эндотелия и на клетки ряда фибробластов. Описанные эффекты введения 1 Ь-4 йп что включают в себя пролиферацию Т- и В-клеток,переключение классов иммуноглобулина в В-клетках, стимуляцию продукции молекул адгезии поверхности клеток эндотелиальньпии клетками и стимуляцию секреции Ь-б. Что касается Т-клеток, П-4 стимулирует пролиферацию Т-клеток после предварительной активации митогенами и ингибирует продукцию РМ-у. В моноцитах 1 Ь-4 индуцирует экспрессию молекул МНС П класса, секрецию липополисахарид-индуцированного ЕРА и экспрессию С 1 Э 23. В эндотелиальных клетках (ЭК) П-4 индуцирует экспрессию УСАМ-1 и секрецию 1 Ь-6. 1 Ь-4 снижает экспрессию 1 САМ 1 (МаЬег, 13, е а 1., Нишап 1 птег 1 еи 1 йн-4 г Ал 1 штппошос 1 и 1 атог шин Ротептйа Тнегареитйс Аррйсайопэ, Ргогезз 111 (Этот/Ш Растог Кеэеагсп, 343-56у По причине его способности к стимулированию пролиферации Т-клеток,активированных воздействием Ц-2 исследовались терапевтические приложения 1 Ь-4. Например, 1 Ь-4 проявлял противоопухолевую активность в животных моделях злокачественных опухолей почки и вызывал регресс опухоли у мышей(Воэсо, М., ер а 1., Ъош Воэез оГ 1 Ь-4 Щесгед Регпухпрпатйсапу йп Тишог-Ьеаппв Мйсе ЕпЫЫс (Ье ОготЬ 01 Роог 1 у апс 1 Аррагеппу Ыопйштипогепйс Тишогз апб 1 пс 1 исе а Тшпог Бресте Ьптипе Метогу, 1. 1 тпшпо 1. 1453136-43 (1990. Однако его токсичность ограничивает размер дозировки у людей (Магвопп, К. е а 1., РЬазе П Зтидйез оГ Нитап Кесошыпапк 1 шег 1 еи 1 сйп-4 111 Абуапсеа Кепа 1 Сапсег апсВ настоящее время известны общая структура и функция 1 Ь-4 и родственных мономерных лигандов, содержащих 4 антипараллельных а-спиральныхлдомена (А-В). Была определена трехмерная структура 1 Ь-4 (Рошегз е а 1., Зсйепсе 25621673, 1992). Белок содержит 4 левые оъ-спирали и две В-складки.Рецептор 1174 состоит, по крайней мере, из двух цепей. Первая цепь П.-4 К,1 Ь-4 Ка, проявляет значительную гомологию с В-Цепью 1 Ь-2 К и с другими членами надсемейства рецепторов факторов роста (Шгегаа ет а 1., .Т. Ехр.Мес 1. 1712861(199 О. Была определена вторая цепь 1 Ь-4 К, цепь 1 Ь-2 К, также известная как общая Цепь, ус (Киеве е а 1., Зсйспсе 2621877 (1993. Два участка связывания,вероятно, вовлечены в последовательный процесс двойного связывания, который приводит к образованию третичного 111 комплекса. Считается, что участок 1 Ь-4,вероятно ответственный за связывание с 1 Ь-4 Ксх, расположен либо на одной из спиралей А или С, либо на них обеих, тогда как считается, что участок,взаимодействующий с ус, расположен на спирали В. В соответствии с данной теорией считается, что первое событие связывания включает в себя взаимодействие лиганда с 11-4 К 1, первичным связывающим компонентом. С данным событием не связана какая-либо активность, выражающаяся в передаче сигнала. Второе событие связывания имеет место, когда комплекс 1 Ь-4/1 Ь-4 Ка укомплектовывается второй цепью, у, После данного второго события связывания происходит передача сигнала и осуществляется клеточная активность. Антагонизм по отношению к 1 Ь-4 дикого типа обнаруживают, когда взаимодействия при связывании, опосредованные вторым участком(необходимым для клеточной активности), ослабляются или устраняются при сохраняющемся связывании с 1 Ь-4 Ка. Агонизм имеет место в том случае, когда претендующий лиганд конструктивно взаимодействует посредством первого и второго участков с обоими рецепторными компонентами. В литературе есть сообщения об антагонистах 1 Ь-4. Мутанты П-4, которые действуют как антагонисты, включают мутеин-антагонист П.-4 1 Ь-4/У 12413 (Кшзе М, Топу НР,еЬа 1 с 1 Ш, Сопуегзйоп оГ Ьшпап 1 птег 1 еиКп-4 11110 а ыдь аГйпйу апгавопйвт Ьу а зйп 31 е апппо астб гер 1 асешепг, ЕшЬо 1., 113237-44 (1992 и двойной мутеин Ш 4 К 121)/У 1241) (Топу, Н., е а 1., Пезйвп оГ Нцшап 1 шег 1 еи 1 пп-4 Аптазоптзсз йппыыбпв 1 птег 1 еи 1 стп-4-аерепс 1 епт апс 1 1 птег 1 ец 1 сйп-13 переносит гезропзез йп Т-се 11 з