Способ стабилизации эритроцитов для постановки реакции задержки гемагглютинации

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РЕАКЦИИ ЗАДЕРЖКИ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ(71) Заявитель Учреждение образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины(72) Авторы Корочкин Рудольф Борисович Прудников Виктор Сергеевич Вербицкий Анатолий Анатольевич Прудников Александр Викторович(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины(56) Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных Справочник. - Москва Агропромиздат, 1986, С. 226-227.1186544, 1970.1121825 1, 1996.648228, 1979.995744, 1983. ТВЕРДОХЛЕБОВА Т.И. и др. Медицинская паразитология и паразитарные болезни, 2005. -2. - С. 29-32. КИРЬЯНОВА Г.Ю. Разработка консервирующего раствора на основе модифицированного деионизированного желатина для пролонгированного хранения отмытых эритроцитов. Автореферат.Санкт-Петербург, 2005. - С. 8-9, 20-23.(57) Способ стабилизации эритроцитов для постановки реакции задержки гемагглютинации, включающий получение эритроцитов из крови животного-донора, отличающийся тем, что эритроциты в виде 10 -ной взвеси в изотоническом растворе натрия хлорида стабилизируют путем смешивания с равным объемом 50 -ного формалина и инкубирования смеси при комнатной температуре в течение 48 часов. Изобретение относится к области серологических и вирусологических исследований, в частности к способу стабилизации эритроцитов, применяемых при постановке реакции задержки (торможения) гемагглютинации (РЗГА, РТГА). При постановке реакции задержки (торможения) гемагглютинации в диагностике вирусных болезней животных и человека используют в качестве компонента 1 -ную взвесь эритроцитов, получаемых из крови животных-доноров (куры, морские свинки и др.) после дефибринирования или стабилизации химическими веществами (трилон Б, натрия цитрат,гепарин и др.) с последующим отделением от них плазмы путем многократного центрифугирования. Приготовленные таким образом эритроциты способны вступать во взаимодействие с рецепторами вируса (гемагглютинины), в результате чего наступает их агглютинация(склеивание). Однако этот способ постановки реакции задержки (торможения) гемагглютинации требует использования только свежеприготовленных эритроцитов, сохраняемых в холо 12500 1 2009.10.30 дильнике (4 С) непродолжительное время на срок не более 3-5 дней 1, что обусловливает необходимость постоянного содержания животных-доноров в лаборатории. Целью изобретения является разработка способа стабилизации эритроцитов, предназначенных для постановки реакции задержки (торможения) гемагглютинации, позволяющего сохранять и использовать их в качестве компонента реакции в течение одного года(срок наблюдения) с сохранением чувствительности и специфичности реакции. Поставленная цель достигается за счет стабилизации полученных эритроцитов 50 ным раствором формалина. Формалин (40 -ный водный раствор формальдегида) является наиболее распространенной фиксирующей жидкостью с достаточно высокой фиксирующей способностью и используется при проведении гистологических и патогистологических исследований. В основе стабилизирующего действия формальдегида лежит его способность взаимодействовать с клетками и вызывать стабилизацию белков цитоплазматической мембраны, в результате чего клетка приобретает более высокую стабильность 2. Заявляемый способ стабилизации эритроцитов для постановки реакции задержки гемагглютинации заключается в том, что эритроциты в виде 10 -ной взвеси в изотоническом растворе натрия хлорида стабилизируют путем смешивания с равным объемом 50 ного формалина и инкубирования смеси при комнатной температуре в течение 48 часов. Способ стабилизации эритроцитов осуществляют следующим образом. Получение эритроцитов из крови животных-доноров проводят по общепринятой методике. Затем из полученного осадка эритроцитов готовят 10 -ную взвесь путем добавления девяти объемов стерильного изотонического раствора (0,85 -ный раствор натрия хлорида). К полученной 10 -ной взвеси эритроцитов при постоянном перемешивании постепенно добавляют равный объем 50 -ного раствора формалина, который предварительно готовят путем смешивания равных объемов продажного формалина и изотонического раствора (0,85 ный раствор натрия хлорида). После тщательного перемешивания смесь оставляют на 48 часов при комнатной температуре. После осаждения эритроцитов на дно раствор формалина удаляют и к осадку эритроцитов добавляют 10 объемов стерильного изотонического раствора, затем смесь встряхивают и дополнительно оставляют в холодильнике при 4 С на 8 часов до полного оседания эритроцитов. Образовавшуюся надосадочную жидкость повторно удаляют и вновь добавляют стерильный изотонический раствор в том же объеме. Полученную суспензию центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут, надосадочную жидкость отсасывают и к осадку эритроцитов добавляют стерильный изотонический раствор в объеме, равном удаленному. Отмывание эритроцитов от формалина таким образом повторяют 6 раз, после чего к осадку эритроцитов добавляют девять объемов стерильного изотонического раствора, тщательно перемешивают до получения равномерной смеси и взвесь эритроцитов разливают в стерильную стеклянную посуду. Полученную таким образом 10 -ную взвесь формалинизированных эритроцитов хранят в холодильнике при 4 С в течение одного года. При этом в течение указанного периода они полностью пригодны для постановки реакции задержки (торможения) гемагглютинации. В день постановки реакции из исходной 10 -ной взвеси фиксированных эритроцитов готовят 1 -ную взвесь на изотоническом растворе и используют в реакции. Использование в реакции задержки (торможения) гемагглютинации стабилизированных формалином эритроцитов, сохраняемых при 4 С в течение одного года, не оказывает влияния на качество реакции. При этом стабилизированные эритроциты полностью сохраняют способность взаимодействовать с гемагглютининами вируса. Сохранение чувствительности и специфичности реакции задержки (торможения) гемагглютинации определяют по получению аналогичных результатов исследования сыворотки крови с определением антител к вирусу и идентификации вируса в исследуемом вируссодержащем материале, а также получению аналогичных контрольных результатов на самоагглютинацию стабилизированных эритроцитов и агглютинацию в присутствии сыворотки крови при традиционной методике постановки реакции и с использованием стабилизированных эритроцитов. 2 12500 1 2009.10.30 Результаты исследований сыворотки крови свиней и птицы для обнаружения специфических антител к вирусам гриппа и ньюкаслской болезни подтверждают возможность использования в реакции задержки (торможения) гемагглютинации стабилизированных формалином эритроцитов в течение одного года после их получения, в результате чего отпадает необходимость постоянного приготовления свежих эритроцитов для постановки реакции. Источники информации 1. Сюрин В.Н. и др. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных справочник. - Москва Агропромиздат, 1986. - С. 227, 8 л.ил. ил. 2. Препарат для фиксации материала для микроскопического исследования пат. Респ. Беларусь 5417, МПК 01 1/36 / Грошев И.М. и др. заявитель ОАО Витебскдрев 19990188 заявл. 26.02.99 опубл. 30.09.03 // Афцыйны бюл. / Нац. Цэнтр нтэлектуал. Уласцвасц - 2003. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3