Способ диагностики внутриутробной инфекции хламидийной, микоплазменной или трихомонадной этиологии у новорожденного

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРИУТРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ ХЛАМИДИЙНОЙ, МИКОПЛАЗМЕННОЙ ИЛИ ТРИХОМОНАДНОЙ ЭТИОЛОГИИ У НОВОРОЖДЕННОГО(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Хулуп Геннадий Яковлевич Бадыгина Наталья Александровна Костюк Светлана Андреевна Исмаил Марианна Николаевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(56) Шабалдин А.В. и др. Педиатрия. - 2000.3. - С. 38-41. Ткаченко А.К. Современные аспекты клиники, диагностики, лечения внутриутробных инфекций у новорожденных. - Мн., 2003. - С. 13-14.2225008 2, 2004.2110800 1, 1998.2231791 2, 2004.(57) Способ диагностики внутриутробной инфекции хламидийной, микоплазменной или трихомонадной этиологии у новорожденного, заключающийся в том, что проводят ПЦР в соскобе эпителиальных клеток из ротовой полости и носовых путей новорожденного и при положительной ПЦР и наличии у новорожденного отягощенного анамнеза диагностируют наличие инфекции. Изобретение относится к области медицины, а именно к способам ранней (доклинической) диагностики внутриутробных инфекций (ВУИ) в момент рождения ребенка. Известен способ выявления внутриутробных инфекций (ВУИ) у новорожденных, где объектами исследования в момент рождения ребенка являются аспират из глотки, желудка, моча, меконий, спинномозговая жидкость, отделяемое из конъюнктивы, ушей, периферическая кровь, послед. Основными клинико-лабораторными тестами диагностики данной группы инфекционных агентов предложены как методы прямого выявления возбудителей микроскопический, культуральный, обнаружения антигенов с помощью реакций иммунофлюоресценции, методы молекулярной гибридизации, так и непрямого - выявление специфических антител иммуноферментным методом 1. Недостатками этого способа являются трудность получения биологического материала, требующих дополнительных инвазивных врачебных манипуляций, необходимость специальной подготовки сотрудников, а также требуют значительных трудовых и временных затрат. Вместе с тем выявление возбудителей хламидийно-микоплазменно-трихомонадной инфекции в соскобе эпителиальных клеток из ротовой полости и носовых ходов новорож 10314 1 2008.02.28 денного с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) позволяет проводить быстрое прямое установление инфекционных агентов с высокой чувствительностью и специфичностью. Задачей заявленного способа является прямое раннее выявление возбудителей хламидийно-микоплазменно-трихомонадной инфекции в соскобе эпителиальных клеток ротовой полости и носовых ходов новорожденных с помощью полимеразной цепной реакции(ПЦР). Поставленная задача достигается следующим образом. Предложенный способ диагностики внутриутробной инфекции (ВУИ) хламидийной,микоплазменной или трихомонадной этиологии у новорожденных заключается в том, что проводят ПЦР в соскобе эпителиальных клеток из ротовой полости и носовых путей и при положительной ПЦР и наличии у новорожденного отягощенного анамнеза диагностируют наличие инфекции. Пример. Новорожденный женского пола, вес 2680 г, оценка по шкале Апгар 5/7, общее состояние тяжелое, крик слабый, кожные покровы и видимые слизистые цианотичны, асфиксия новорожденного умеренной степени, врожденная пневмония, катаральный конъюнктивит,ларингит. Мать В., 29 лет, история родов 3717, роды первые, 36-37 нед., Е 1 Р 1 Н 1 гестоз,преждевременное излитие околоплодных вод, родоразрешена путем кесарева сечения. Для выявления ДНК возбудителей у новорожденных производят соскоб из носовых ходов, слизистой поверхности ротовой полости. Стерильной одноразовой цитощеткой вращательными движениями поочередно в обоих носовых ходах и ротовой полости производят соскоб эпителиальных клеток. Из соскобов эпителиальных клеток ДНК выделяют сорбционным методом адсорбции на частицах двуокиси кремния в присутствии гуанидинатицианата натрия, отмывая этиловым спиртом. При этом к 100 мкл физиологического раствора, содержащего клинический материал в пробирке объемом 1,5 мл (типа ), добавляют 300 мкл раствора(лизирующего, 6 М раствор гуанидина изотиоцианата) и 10 мкл суспензии сорбента (2). Пробы инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, 1-2 раза перемешивая на микроцентрифуге при 1500 об/мин. Пробы центрифугируют в течение 15 с на центрифуге при 12 тыс. оборотов в мин, супернатант удаляют. К осадку добавляют 100 мкл раствора(промывочного, 96 этанол, содержащий 100 мМ ацетат натрия (рН 4,8, встряхивают и центрифугируют. Процедуру отмывки повторяют 2 раза с использованием раствора(промывочного, 70 этанол). Пробирки помещают в твердотельный микротермостат и подсушивают пробы 5 мин при температуре 50 С, оставляя пробирки открытыми. В пробирки с осадком добавляют 50 мкл ТЕ буфера (на 1 л буфера 0,04 М Трисацетат (242 г Трис, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты), 0,002 М ЭДТА (100 мл 0,5 М ЭДТА рН 8,0) и инкубируют в течение 5 мин при 50 С. Пробирки центрифугируют в течение 15 с при 12 тыс. оборотов. Водную фазу используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации. В пробирки типаобъемом 0,5 мл вносят 5 мкл анализируемого образца. В каждую из пробирок добавляют 20 мкл амплификационной смеси, состоящей из 17,5 мкл разбавителя, 2,5 мкл реакционной смеси и 0,2 мкл -полимеразы. Добавляют 25 мкл минерального масла. Амплификацию ДНК проводят в многоканальном амплификаторе по следующей программе для,,1. Денатурация ДНК (расплетение двойной спирали) -93 С 30 с 2. Отжиг (присоединение праймеров)93 С 10 с 60 С 10 с - 35 циклов 72 С 10 с 3. Элонгация (достраивание цепей ДНК)72 С 60 с. 2 10314 1 2008.02.28 С помощью источника тока с фиксированным напряжением 150 В полученные ампликоны разгоняют электрофорезом в 1,5 агарозном геле, содержащем 1 бромистый этидий в течение 30 мин при напряжении 10 В/см. Для оценки результатов используют трансиллюминатор Н-2 с длиной волны 310 нм с применением видеосистемы для регистрации гелей - с помощью программыверсия 1,0 на базе компьютера-4. Анализ результатов проводят по внутренним контролям и контрольным образцам. В соскобе эпителиальных клеток ротовой полости и носовых ходов новорожденного на 2-е сутки жизни с помощью полимеразной цепной реакции с электрофоретической схемой детекции продуктов амплификации обнаружена ДНК. По результатам ПЦР-диагностики ребенку была назначена специфическая антибактериальная терапия (максипин, кетоцефен, гентомицин, клацид, дифлюкан). Таким образом, по сравнению с прототипом заявленный способ позволяет получить следующие преимущества проводить быстрое прямое установление этиологии внутриутробных инфекций у новорожденных с высокой диагностической специфичностью и чувствительностью с использованием в качестве биологического материала малоинвазивного соскоба из ротовой полости и носовых ходов, что позволит врачам-неонатологам проводить выбор этиологической и патогенетической терапии, а также контроль за результатами лечения. Источники информации 1. Ткаченко А.К. Современные аспекты клиники, диагностики, лечения внутриутробных инфекций у новорожденных (учебно-методическое пособие). - Мн. МГМИ, 2003. С. 34. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3