Конъюгат моноклонального антитела или его антиген-связывающих фрагментов и модифицированного суперантигена, способ лечения колоректальной карциномы и меланомы

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ КОНЪЮГАТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА ИЛИ ЕГО АНТИГЕН-СВЯЗЫВАЮЩИХ ФРАГМЕНТОВ И МОДИФИЦИРОВАННОГО СУПЕРАНТИГЕНА, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ КОЛОРЕКТАЛЬНОЙ КАРЦИНОМЫ И МЕЛАНОМЫ(71) Заявитель ФАРМАЦИА ЭНД АПДЖОН АБ(73) Патентообладатель ФАРМАЦИА ЭНД АПДЖОН АБ(57) 1. Конъюгат, включающий а) моноклональное антитело С 242, моноклональное антитело С 215 или их антигенсвязывающие фрагменты, способные к связыванию с ассоциированной с заболеванием структурой клеточной поверхности, и 4927 1 б) пептид, который содержит аминокислотную последовательность, происходящую от аминокислотной последовательности стафилококкового энтеротоксина А,обладает способностью связываться с -цепью Т-клеточного рецептора и мутирован по аминокислотному остатку, координирующему цинк при связывании пептида с антигенами МНСкласса, таким образом, что пептид обладает пониженной, по крайней мере, на 10 аффинностью к антигенам МНСкласса по сравнению со стафилококковым энтеротоксином А,причем указанные части ковалентно сшиты вместе. 2. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что обладает способностью активировать Тлимфоциты для лизиса клеток, экспрессирующих указанную структуру клеточной поверхности. 3. Конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что указанная структура клеточной поверхности ассоциирована с заболеванием, выбранным из группы, включающей колоректальную карциному и меланому. 4. Способ лечения колоректальной карциномы и меланомы, отличающийся тем, что млекопитающему вводят терапевтически эффективное количество конъюгата по любому из пп. 1-3.(56)92/01470 1.93/24136 1. Суперантигены в основном являются белками вирусной или бактериальной природы и способны к одновременному связыванию с антигенами МНС классаклеток млекопитающего ицепью рецептора Т клетки. Связывание приводит к активации Т-лимфоцитов и лизису клеток, проявляющих МНС класса . Умеренная степень полиморфизма связывающей частицепи приводит к активации относительно большой части Тлимфоцитов при контакте с суперантигеном (по сравнению с активацией посредством обычного процессинга антигена). Первоначально понятие суперантигена было связано с различными стафилококковыми энтеротоксинами (, , 1, 2 и ). Недавно был открыт новый стафилококковый энтеротоксин, названный(., . . . 180 (1994) 1675-1683). С ростом интереса были открыты дальнейшие суперантигены. Среди прочих, примерами являются Токсин 1 синдрома токсического шока (ТСТШ-11), отслаивающие (экзофолиирующие) токсины , которые связаны с синдромом шелушения кожи, стрептококковый пирогенный экзотоксин А, В и С (СПЭ А, В и С), белки вируса опухоли молочной железы мыши (ВОМЖМ-), М белки стрептококков, энтеротоксин Клостридиума перфрингенс ( ) (КПЭТ-СРЕТ). В качестве обзора по суперантигенам и их свойствам см.. (. . 54 (1993) 99-166). В качестве функционального суперантигена рассматривался экзотоксин, поскольку имеются данные, свидетельствующие, что данный токсин может быть подвержен внутриклеточной процессии под действием вспомогательных клеток на фрагменты, которые экспрессируются на клеточной поверхности, обладающие способностью связываться сцепью, с последующей активацией Т клеток (..,135 (1991) 372-382). Для терапии различных заболеваний были предложены такие суперантигены с лечебным действием, которое сопровождается активацией иммунной системы (., 9104053.,9110680.,9324136., . . 4927 1 Совместно с вакцинами было предложено использовать суперантигены, которые мутировали таким образом, чтобы потерять свою . связывающую активность (,9314634). Мутации суперантигенов были описаны ранее (,9314634., . . . 175 (1992) 387-396., . . 147 (1991) 32743281., . . 59 (1991) 2126-2134). Ранее нами было предположено использовать для терапии конъюгаты между суперантигеном и антителом для того, чтобы лизировать клетки, которые экспрессируют структуры, относительно которых направлены антитела (.,9201470., . . 36 (1993) 223-228., . .. 10 (1993) 37-47., . . 150 (8, часть 2) (1993) 114 (, , , ,21-25 (1993., . . ., . . 33 (0)(1992) 339 (, ,20-23 (1992., . . . .88 (1991) 9287-9291). Предположительными заболеваниями, предназначенными для лечения, являются рак,вирусные инфекции, паразитарные инвазии, аутоиммунные заболевания и другие заболевания, связанные с экспрессией структур на поверхности клеток, специфических для заболевания. Ранее проведенные экспериментальные работы были направлены на конъюгаты,содержащие рекомбинантныеи различные противораковые антитела. Подобные конъюгаты имели несколько сниженную способность связываться с антигеном МНС класса , сравнимую с таковой у неконъюгированной формы суперантигена. Является ли пониженная способность связывания антигена МНС классадля достижения оптимального лизиса и оптимального терапевтического эффекта полезной или нет, определено не было. Эксперименты по иммунной терапии с применениемхимически конъюгированным с опухолевоспецифическим антиидиотипическим антителом были ранее описаны., (. . 151 (1993) 3180-3186). В период проведения расследования приоритета заявки в Шведском патентном бюро был дополнительно цитирован., (. , 148 (1992) (1-6), который описывает слияния между белком А и фрагментами , без усиления связывания МНС класса, или использования слияния для уничтожения клеток и., (. . 5(1993) 869-875), который описывает мутацию, влияющую на связывание МНС классанеслитой формы суперантигена стрептококкового эритрогенного токсина А. Объекты изобретения. Первым объектом изобретения является усовершенствование ранее известных конъюгатов суперантиген-антитело в отношении к общей иммунной стимуляции по сравнению с направленной цитотоксичностью. Стимуляция приводит к активации Т-лимфоцитов и зависит от способности суперантигена связываться и с рецептором Т клетки, и с антигеном МНС класса . Вторым объектом изобретения является получение конъюгатов между дубликатами с биоспецифическим сродством (например, антителами) и суперантигенами с модифицированным сродством к антигенам МНК класса . Это, как было теперь показано, улучшает селективность по отношению к суперантиген антитело зависимому цитолизу клетки в клетках, проявляющих антиген (по отношению к которому направлен конъюгат антитела/дубликата биоспецифического сродства) по сравнению с другими клетками,проявляющими антигены МНС класса . Третьим объектом изобретения является получение конъюгатов, которые могли бы быть использованы в качестве активного начала при лечении млекопитающих, болеющих раком, аутоиммунными заболеваниями, паразитарными инвазиями, вирусными инфекциями или другими заболеваниями, связанными с клетками, которые экспрессируют на своей поверхности структуры, которые являются специфическими для соответствующего заболевания. 3 4927 1 Описание изобретения. Главным аспектом изобретения является конъюгат, включающий а) дубликат с биоспецифическим сродством, который направлен по отношению к структуре, с которой он предназначен связываться в конъюгате,б) пептид, который) является производным суперантигена,) обладает способностью связываться сцепью рецептора Т клетки и) обладает модифицированной способностью связываться с антигенами МНС класса, по сравнению с суперантигеном, производным которого является пептид (дикий тип суперантигена(. Пептид и дубликат по сродству являются ковалентно связанными друг с другом через мостик (В). Предпочтительные конъюгаты имеют способность активировать и направлять Тлимфоциты к избирательному лизису клеток, которые на своей поверхности проявляют структуру, по отношению к которой направлен дубликат по сродству. Это означает, что конъюгаты будут вызывать цитолиз в способе, опосредованном(суперантиген антитело зависимая клеточная цитотоксичность). См. экспериментальную часть ниже и наши предыдущие публикации, относящиеся к конъюгатам между суперантигенами и антителами (например,.,9201470). Конъюгаты по изобретению имеют структуру, которая является аналогичной к конъюгату суперантигена-антитела, описанной в предшествующей области техники (.,9201470, которая здесь включена в качестве ссылки), т.е. конъюгат соответствует формуле Т-В-,где Т представляет дубликат по биоспецифическому сродству,представляет модифицированный суперантиген (вышеупомянутый пептид) и В представляет ковалентный мостик, связывающий Т ивместе. Т, в принципе, может быть любой структурой, которая связывается посредством биоспецифического сродства. В большинстве важных случаев Т способен к связыванию с поверхностной структурой клетки, предпочтительно, специфической для заболевания структурой, как дано выше. Структура, относительно которой направлен Т, обычно является отличной от (а) эпитопацепи, с которым связывается пептид, производный от суперантигенаи (б) эпитопа антигена МНС класса , с которым связывается немодифицированный суперантиген. Дубликат Т по биоспецифическому сродству может первично быть отобран из интерлейкинов (например, интерлейкин-2), гормонов, антител и фрагментов антител, связывающих антиген, факторов роста и т.п. См., например(доклиническая и клиническая разработка цитокинных токсинов), представленная на конференции,, ноябрь 7-11, 1993. Связывание полипептидов с константным доменом иммуноглобулинов (например, протеины А,и ), пектинами, стрептавидином, биотином и т.п. находилось в порядке очередности,представляющем меньшее значение. В порядке очередности, было предпочтительным, чтобы Т являлся антителом или фрагментом антитела, связывающим антиген (включая , 2, , антитело с одной цепью и т.п.), с конкретным усилением активного фрагмента антитела (такого как ) у антител, направленных относительно так называемых С 242 эпитопов (.,9301303) или по отношению к другим раковоспецифическим эпитопам. В случае, когда Т является антителом, это первично моноклональное или смесь определенного количества моноклональных (например, 2, 3, 4, 5 или больше) антител. Т может быть поликлональным антителом в случае, если использование является нетерапевтическим. 4 4927 1 Необязательно для Т иметь полипептидную структуру. Модифицированный суперантигенявляется первично мутированным антигеном, но может также потенциально быть химически модифицированным суперантигеном,включая фрагменты суперантигенов, сохраняющих способность связываться сцепью рецептора Т клетки. Выражение мутированный суперантиген означает, что природная способность суперантигена связываться с антигенами МНС классабыла модифицирована на геномном уровне путем замены, вставки или удаления одной или нескольких аминокислот из природного суперантигена. Фрагменты суперантигена, полученные путем мутаций по удалению части полной аминокислотной последовательности, и фрагменты, полученные путем ферментативного или химического расщепления суперантигена, могут быть использованы эквивалентно в химических конъюгатах по изобретению. Модифицированный суперантигенможет включать одну или несколько аминокислотных последовательностей, которые являются производными от различных суперантигенов и которые могли быть мутированными, например комбинации предпочтительных суперантигенов, упомянутых выше. Модифицированный суперантигенкак таковой может проявлять пониженную иммуногенность и токсичность по сравнению с нативным суперантигеном. Другие группы/соединения, которые способны к перекрестной реакции сцепью рецептора Т клетки, могут также потенциально быть использованы эквивалентно с мутированным суперантигеном , как дано выше. Подобные группы/соединения могут быть не полипептидной структуры. В конце года приоритета большинство интересующих продуктов-кандидатов по изобретению включали мутированные формы суперантигенов, имеющих множественные участки связывания МНС классаи/или способность к координатной связи с 2, например , ,и . Т, так же как и , может быть получен при помощи рекомбинантного способа. Мостик В может быть выбран, как ранее было описано (.,9201470), а именно будет предпочтительно гидрофильным и проявлять одну или несколько структур(у), выбранных из амида, тиоэфира, эфира, дисульфида и т.п. В случае, если мостик имеет незамещенные неразорванные углеводородные цепи, они предпочтительно не имеют ароматических колец, таких как фенил. Наиболее важными мостиками являются те,которые получены при помощи рекомбинантного способа, т.е. когда конъюгация имеет место на геномном уровне. В подобных случаях являются предпочтительными олигопептидные мостики, содержащие остатки гидрофильных аминокислот, такие как , , , и . Могут быть включены такжеи . В течение года приоритета было решено, что предпочтительным мостиком является пептид, включающий три аминокислотных остатка . Конъюгат по изобретению может включать один или несколько модифицированных суперантигенов на дубликат по биоспецифическому сродству и наоборот. Это означает,что Т в вышеуказанной формуле может содержать один или несколько модифицированных суперантигенов в добавление к биоспецифическому дубликату. По аналогии,может содержать один или несколько Т дубликатов по биоспецифическому сродству. Дубликат по сродству Т иможет также включать другие структуры. Количество модифицированных суперантигенов на дубликат по сродству составляет предпочтительно один или два. Синтез новых конъюгатов по изобретению может быть проведен в принципе согласно двум главным путям 1) рекомбинантным способом и 2) химическим присоединением Т к. Способы хорошо известны для обычного, квалифицированного в данной области работника и включают большое количество вариантов. Из этого следует, что изобретение 5 4927 1 относится первично к искусственным конъюгатам, то есть конъюгатам, которые не обнаруживаются в природе. Химическое сшивание модифицированного суперантигена с дубликатом Т биоспецифического сродства часто применяет функциональные группы (например, первичные аминогруппы или карбоксигруппы), которые имеются во многих положениях каждого соединения. Из этого следует, что конечный продукт будет содержать смесь конъюгатов молекул, различающихся по отношению к положению, по которому произошло сшивание. Для рекомбинантных конъюгатов (слитых белков) полученные конъюгированные субстанции будут единообразными по отношению к положению сшивания. Или концевой амин модифицированного суперантигена пришивается к карбокси концу дубликата по биоспецифическому сродству, или наоборот. Для подобного слияния для антител, таких как интактные антитела и фрагменты связывания антигена (,и т.п.), может быть использована либо легкая, либо тяжелая цепь. В настоящее время предпочтительны рекомбинантные конъюгаты с предпочтением дляфрагментов и пришиванием амино конца модифицированного суперантигена к первому константному домену тяжелой цепи антитела , без включения аналогов, сшивающихся с легкой цепью или с ,доменами, которые также могут дать достаточно хорошие результаты. Существует два различных способа получения больших количеств суперантигенов(включая модифицированные и слитые формы) на .внутриклеточная продукция и секреция. Последний способ предпочтителен для конъюгатов по изобретению, поскольку он предполагает очистку правильно уложенного белка из периплазмы и из культуральной среды. Внутриклеточная продукция приводит к сложному способу очистки и часто требует повторное укладывание белка(для того, чтобы получать белок с правильной третичной структурой). Вышеуказанное не исключает, что возможно получить активные конъюгаты также и в других клетках хозяевах, например эукариотических клетках, таких как дрожжи или клетки млекопитающих. Получение мутированных суперантигенов и отбор мутантов, имеющих модифицированную способность связываться (сродство) к антигену МНС класса , может быть проведено в соответствии с известными способами (см.., . . . 165 (1992) 387-396). См. также нашу экспериментальную часть. Способность конъюгата связываться сцепью рецептора Т клетки, со структуроймишенью и вызывать лизис клетки-мишени зависит, в частности, от пептида , который является производным от суперантигена, дубликата (Т) по биоспецифическому сродству и структуры и длины мостика (В). Квалифицированный работник способен оптимизировать конъюгаты по изобретению в отношении способности связываться и способности вызывать лизис путем изучения взаимоотношения между структурой и эффектом с помощью той модели, которая описана в соответствии с предыдущим знанием по конъюгатам суперантигена и антитела (см. вышеприведенные публикации). См. также экспериментальную часть ниже. Первоначально предполагалось, что путем модификации способности связывать антиген МНС классасоотношение 50(50 составляет 0,9 (90 ), такое как 0,5 (50 ) и возможно также 0,01 (1 ). В альтернативе, модифицированная способность связывания конъюгатов по изобретению может быть измерена в виде отношения констант диссоциации , при , измеренной в нМ и в том же пределе,как для соотношения 50(50. Для определения 50, 50,( и см. экспериментальную часть ниже. Ранее было известно, что некоторые суперантигены могут иметь два или более участков, которые связывают антиген МНС класса 11 (.,. .,7(1993)7-29). Для этого типа суперантигенов способность связывания была бы модифицирована по крайней мере по одному из связывающих участков, например, в виде снижения вышеупомянутой способности. Вместе с модификацией суперантигена, это 6 4927 1 возможно достаточно, чтобы создать изменения в разнице в сродстве для двух участков связывания МНС класса , экспериментально 10 , и предпочтительно путем снижения сродства по крайней мере одного участка. Суперантигены связываются сцепямиразличных подгрупп с различным сродством. В белках слияния/конъюгатах по изобретению использованный суперантиген может быть модифицированным таким образом, чтобы проявить измененную специфичность подгруппы или измененное сродство к одному или нескольким членам подгруппы. Имеются серьезные причины полагать, что существует параболическое взаимоотношение между сродством ки стимуляцией, посредством , то есть умеренное сродство будет давать максимальную стимуляцию. Соответственно, подходящее сродство модифицированного суперантигена кможет быть близким, в такой же мере, как у сплавления белка/конъюгата, включающего модифицированный суперантиген, способное значительно стимулировать к делению покоящуюся популяцию Т клеток, представляющих, по существу, распределение всех подгруппчеловека. Популяция Т клетки может быть накопленной из Т клеток от случайно выбранных человеческих индивидуумов. Это существенно означало, что стимуляцию возможно измерить. Результаты, представленные в табл. 2 (правая колонка), в экспериментальной части отмечают, что способность вызыватьу белков конъюгатов/слияния по изобретению часто, по существу, та же, что для слияния, включающего дикий тип суперантигена. Основное использование белков конъюгатов/слияния по изобретению. Конъюгаты, согласно изобретению, первоначально предназначались для лечения тех же заболеваний, что и конъюгаты между обычными суперантигенами и антителами. См. вышеупомянутые публикации. Таким образом, конъюгаты по изобретению могут быть введены либо в качестве основной терапии, либо в качестве адъювантной терапии при хирургическом вмешательстве, или совместно с другими препаратами. Фармацевтическая композиция по изобретению включает составы, которые подобны известным в данной области, но теперь содержат наши новые конъюгаты. Таким образом,композиции могут быть в виде материала из лиофилизированных частичек, стерильного или асептического производственного раствора, таблеток, ампул и т.п. Могут присутствовать наполнители, такие как вода (предпочтительно, подведенная буфером до физиологического значения рН при помощи, например, ) или другой инертный твердый или жидкий материал. В целом, термины композиции представляют полученные путем смешивания конъюгата с, растворения в, привязывания к или составленные другим образом с одним или несколькими водорастворимыми или нерастворимыми в воде водными или неводными наполнителями, если необходимо, вместе с подходящими добавками и адъювантами. Обязательно необходимо, чтобы наполнители и кондиционеры не проявляли неблагоприятного воздействия на активность конъюгата. Вода, как и подобное, включается в понятие наполнитель. Обычно конъюгаты будут продаваться и вводиться в предварительно приготовленных дозировках, содержащих каждая эффективное количество конъюгата, которое основано на результатах, представленных в настоящее время, предположительно, в интервале 1050 мкг. Точная доза варьируется от случая к случаю и зависит от веса пациента и возраста,пути введения, типа заболевания, антитела, суперантигена, пришивания (-В-) и т.п. Пути введения являются широко известными в данной области, то есть эффективное количество, лизирующее клетку-мишень, или терапевтически эффективное количество конъюгата по изобретению контактирует с клетками-мишенями. Для назначений, отмеченных выше, это главным образом представляет парентеральное введение, такое как инъекция или инфузия (подкожно, внутривенно, внутриартериально, внутримышечно) животному, такому как человек. Конъюгат может быть введен локально или системно. 7 4927 1 Предполагается, что эффективное количество, лизирующее клетку-мишень, является эффективным количеством для активации и направления Т-лимфоцитов на разрушение клетки-мишени. В конце года приоритета было решено, что предпочтительным путем введения для белка конъюгата/слияния, содержащего немодифицированные суперантигены, является 3 часовая внутривенная инфузия в день, комбинированная с жаропонижающим агентом(парацетомол). Введение повторяется в течение 4 дней и прекращается перед появлением у пациента второго антитела к слитому белку/конъюгату. Данная схема дозировки, повидимому, будет применима также для белков конъюгатов/слияния по настоящему изобретению. Альтернативные области использования. Конъюгаты по изобретению могут также применяться для количественного и качественного определения структур, по отношению к которым направлены отыскивающие мишень группы (Т). В целом, данные способы являются хорошо известными для специалистов в данной области. Таким образом, модифицированный суперантиген может функционировать в качестве маркерной группы в иммуноопределениях, включая иммуногистохимические определения, поскольку маркерная группа в свою очередь определяется,например, при помощи антитела, которое направлено по отношению к пептиду и мечено ферментативно, изотопом, флуорофором или другими известными маркерными группами. Другой метод иммуноопределения определяет в клеточной популяции клетки,которые на своей поверхности экспрессируют структуру, способную связываться с группой, отыскивающей мишень (Т). Данное применение означает, что образец из клеточной популяции инкубируется вместе с Т-лимфоцитами и конъюгатами по настоящему изобретению, так же как и вопределении. В случае, если инкубация приводит к лизису клеток, это показывает, что популяция содержит клетки, которые на своей поверхности экспрессируют структуру. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Получение рекомбинантных белков. Антитела. Экспериментальная работа вместе с изобретением первоначально была выполнена с моноклональным антителом С 215 в качестве модельной субстанции. Данное антитело направлено против антигена из семейства -733 (см., например, ЕП 376746), цитируемые здесь ссылки и., . . . 32 (1988) 877-82). Эпитоп С 215 оценивается как не достаточно специфический для лечения рака у человека. На дату приоритета, по экспериментальной оценке,242 (.,9301303) вместе со своим продуктом слияния с диким типом , по-видимому, был лучшим кандидатом. Бактериальные штаммы и плазмиды. Для экспрессии и клонирования были использованы штаммы .635 (-7, 14, Т 4, и НВ 101 (-, . . . 41 (1969) 459-472) соответственно. Для экспрессии - белков слияния (производных от антитела мыши С 215) был использован вектор рКР 889 и для секреции(фиг. 1) векторы рКР 943 и рКР 1055. Вектор рКР 889 экспрессии - идентичен рКР 865 (., .. . .(1994)) за исключением того, что спейсером между СНа 1 иявляется. Экспрессия из рКР 943 дает выходс природными аминокислотными остатками. Использование рКР 1055 дает , обладающее добавленнымк аминоконцу. У обоих векторов для транскрипции и трансляции используют сигналы из стафилококкового белка А (., . . . 259 (1984) 1695-1702) и синтетический сигнальный пептид для секреции (. , неопубликовано). Мутагенез. Мутации, полученные при помощи реакции полимеразной цепи, проанализировали на. Реакционная смесь (100 мкл) содержала 1,буфера РПЦ от 8 4927 1(10 мМ Трис/ рН 8,3 1,5 мМ 2, 0,001(вес/объем) желатин и дополнительные 2 мМ 2 0,4 мМ 2,5 единицыДНК полимеразы (, США) и 100 нг матрицы ДНК. Праймеры добавляли в конечной концентрации 0,8 мкМ. Оригинальная матрица представляла плазмиду, содержащую ген энтеротоксина А, идентичный к опубликованному., (. . 170 (1988) 34-41), за исключением того, что первый кодон (кодирующий ) заменен на ТСС для обставления сайтана 5 конце гена. Далее было использовано производное, содержащее несколько уникальных участков рестрикции ферментами, введенных путем покоящейся мутации. Мутации, введенные в окружение участков рестрикции, были получены путем одного набора праймеров, один из них охватывает мутацию и участок рестрикции. Для большинства мутаций должны были использовать два набора праймеров и проводить реакцию полимеразной цепи в два последовательных этапа. Новый участок рестрикции ферментом был введен вместе с каждой мутацией для возможности легкой идентификации. Олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров, были синтезированы на(,). Для подтверждения каждой мутации определяли родственную часть нуклеотидной последовательности на-, используя набор. Получение белков и анализ. Клетки . , содержащие конструкции различных генов, выращивали в течение ночи при комнатной температуре (- векторы) и при 34 С (векторы секреции, оптимум зависит от мутации). Питательная среда содержала 2,УТ (16 г Бакто триптона, 10 г/л дрожжевого Бакто экстракта, 5 г/л ), дополненного канамицином (50 мг/л). Слияние белков индуцировали путем добавления изопропилтиогалактозида в конечной концентрации 100 мкМ. (Промотор белка А, использованный в экспрессии не слитого ,являлся конституитивным). Клетки осаждали при 5000, и содержимое периплазмы отделяли путем осторожного размораживания ранее замороженного осадка клеток в Трис(рН 7,5) на льду при потряхивании в течение 1 часа. Экстракт периплазмы просветляли путем центрифугирования при 9500, в течение 15 минут. - белки использовали без дальнейшей очистки.и - далее очищали путем аффинной хроматографии на колонке с анти-. Поликлональные анти- антитела кролика были ранее получены от кроликов, предварительно иммунизированныхи очищали путем аффинной хроматографии на протеин Сефарозе ( ). Анализ белков. Белки разделяли на предварительно залитых полиакриламидныхТрис-Глицин гелях(градиент 4-20 , или гомогенном 12 , новая экспериментальная технология) и либо прокрашивали Кумасси бриллиантовым синим, либо использовали вблоте. Поликолональные анти- антитела кролика (выше) использовали для определениявблот анализе после обработки антителами свиньи противкролика и антителами кролика против пероксидазы хрена и пероксидазой. Вместе с белками слияния - использовали также конъюгированные при помощи пероксидазы хрена антитела крысы, распознающие каппа цепи ( 08,, ). Для визуализации пероксидазы использовали 3,3-диаминобензидин . Спектры кругового дихроизма (КД) получали на -720 спектрополяриметре (,Япония) при комнатной температуре (22-25 С) в 10 мМ фосфатном буфере, рН 8,2, в присутствии 0,02 мМ 4 и 0,005(объем/объем)20. Скорость сканирования составляла 10 нм/мин, и каждый спектр представлял среднее из пяти последовательных сканирований. Длина пути ячейки составляла 1 мм и концентрация белка от 0,2 до 0,5 мг/мл. Денатурацию при равновесии гуанидин гидрохлоридом (-) определяли при 23 С путем КД при 222 нм при концентрации белка 0,3 мг/мл и длине пути ячейки 1 мм. Эти данные использовали для расчета кажущейся Фракции развернутого белка . 9 4927 1 Параметры равновесия развертывания выводили путем подбора данных для двухсайтового процесса складывания (.,29 (1990) 4410-4419. СВЯЗЫВАНИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. Материалы. Реактивы Использовали среду 1640, полученную от (, , Англия). Среда имела рН 7,4 и содержала 2 мМ -глютамина (, , Англия), 0,01 М( , Израиль), 1 мМ 3 ( , Германия), 0,1 мг/мл Гентамицин сульфата ( , Израиль), 1 мМ -перувата (, США), 0,05 мМ меркаптоэтанола ( ., США), эссенциальные аминокислоты, концентрированные в 100 раз ( , Шотландия), дополненные 10 ной бычьей эмбриональной сывороткой (, , Англия). Рекомбинантный,и продукты слияния 21- и 21- получили, как описано выше. Рекомбинантный -2 человека получен от., США. Митомицин С получен от., США. 2 а 514 получен от , Германия. Физраствор на буферебез магния и кальция получили от , Англия. Клетки Линия клеток карциномы толстой кишки 205 и клетки В лимфомы клеточной линииполучены от(, , США)(экспрессирующие -23//10, -7, -1/2). Лимфобластоидные В клетки линии , трансформированные , представляли любезный дар Др., ., . Нидерланды. Клетки неоднократно проверяли на загрязнение микоплазмой при помощи -Т. С. теста. - .,, США. Линии Т клеток, активированных , были получены путем активации моноядерных клеток из периферической крови. Кровь получали в виде кожистого слоя от доноров крови из Госпиталя Университета Лунда. Клетки РВМ стимулировали при концентрации 2,106 клеток/мл обработанными митомицином С, покрытымиклетками(проинкубированными с 100 нг/мл ) в среде с 10. Линию Т клеток стимулировали повторно с двухнедельным интервалом рекомбинантным -2 человека 20 /мл и еженедельно обработанными митомицином С, покрытымиклетками . Линии клеток культивировали в течение 4-12 недель перед использованием в определении. Жизнеспособность эффекторных клеток, согласно определению включения трипанового синего, превышало 50 . Определение характеристик связывания МНС классадикого типа и мутанта . Способы радиоактивного иодирования. Подходящие количества дикого типа или мутантаметили радиоактивностью от 10 до 25 мС 125, используя способ с лактопероксидазой и ферментом на подложке (, , МА). Реакцию останавливали при помощи гашения азидом натрия, и связанную с белком радиоактивность отделяли от свободного иода путем фильтрации через колонку -10 (АВ, Швеция) в среде 10 в качестве буфера элюции. Условия выбирали, чтобы получить стехиометрическое соотношение между иодом-125 и белком 21. Радиохимическую чистоту подтверждали путем эксклюзионной ЖХВР хроматографии по размеру на колонке 3000. Влияние радиоиодирования на связывающую активность тестировали только для дикого типаи изменения не обнаружили (данные не представлены). Прямое определение связывания. Клетки . 6,104/100 мкл, предварительно культивированные в среде 10, добавляли в конические полипропиленовые пробирки и инкубировали (22 С/45 мин) в трипликатах со 100 мкл/на пробирку серийно разбавленного меченного 125 дикого типа или мутанта . Клетки промывали 2 мл 1(вес/объем) бычьим сывороточным альбуминомв 10 мМ физрастворе на фосфатном буфере, рН 7,4, центрифугировали при 300, в течение 5 минут и аспирировали. Данную процедуру повторяли дважды. В конце клетки анализировали на связанную с клетками радиоактивность в гамма счетчике (.,, , США). 10 4927 1 Кажущуюся константу диссоциации, , и количество участков связывания, , при насыщении определяли по Скэтчарду (, . . . (1949) 660-72) после вычитания неспецифического связывания (т.е. связывания после инкубации только в среде 10). Определение ингибирования (ингибирование связывания 125-меченного дикого типамутантами ). Данные эксперименты по ингибированию проводили, как описано для определения прямого связывания с небольшими модификациями. В кратком виде,50 мкл 125-меченного дикого типаоставляли конкурировать с избытком немеченного дикого типа или мутанта(50 мкл/пробирку) для связывания с 6,104/100 мкл клеток. Для получения максимальной чувствительности в исследовании ингибирования использовали следовые концентрации, дающие 40 связавшейся радиоактивности от прямого определения. Эффективность вытеснения конкурента выражали в виде концентрации, дающей 50 -ное ингибирование (50) связавшейся радиоактивности. Сродство связывания мутантов по отношению к дикому типурассчитывали, используя уравнение 5050. Для того чтобы проанализировать, действительно ли мутанты конкурируют за связывание с тем же участком на клетках , как и дикий тип , данные по связыванию,полученные с мутантами , выражали графически в виде двойной логарифмической функции и исследовали на параллельность с соответствующими данными для дикого типа. Определение ингибирования (ингибирование связывания меченного флуоресцентной меткойдикого типа под действием немеченногодикого типа и мутантов ). Клетки . (2,5, 105) инкубировали с ингибитором (диким типом или мутантом 0-6000 нМ), разведенным в 50 мкл СО 2-независимой среды , дополненной 10, глютамином и гентамицином, при 37 С в течение 30 мин. Добавляли флуоресцеин,конъюгированный с диким типомв конечной концентрации 30 нМ, и образцы инкубировали дополнительные полчаса при 37 С. Образцы промывали три раза ледяным ,дополненным 1(-), и окончательно выдерживали в 0,4 мл - во льду до анализа. Из каждого образца анализировали 10 000 живых клеток по зеленой флуоресценции на( ) проточном цитометре и рассчитывали среднее значение флуоресценции, используя программу. Определениеи,и их белков слияния при помощи 21. Определение . Анализировали цитотоксичность,и их белков слияния при помощи 21 по отношению МНС классаклетокв обычном исследовании высвобождения 513, используя стимулированную-специфическую линию Т клеток в качестве эффекторных клеток. В кратком виде, клетки , меченные 51, инкубировали в количестве 2,5, 103 клеток на 0,2 мл среды (, 10) в микротитровальных ячейках при определенном соотношении эффектора для клетки-мишени,в присутствии или отсутствии (контроль) добавок. Рассчитывали процент специфической цитотоксичности в виде 100 (счет в мин, высвобождение в эксперименте - счет в мин,фоновое высвобождение/счет в мин, общее высвобождение - счет в мин, фоновое высвобождение). Соотношение эффекторов к клеткам составляло 301 для неслитых белков и 401 для белков слияния.против клеток рака толстой кишки человека. Анализировали цитотоксичность 21-, 21-,и мутантовпо отношению к С 215 МНС классаклеток карциномы толстой кишки 620 в обычных условиях в течение 4 часов по определению выхода 513, используя стимулированнуюпод действиемлинию Т клеток в качестве эффекторных клеток. В кратком виде, клетки,620, меченные 513, инкубировали в количестве 2,5,103 клеток 11 4927 1 на 0,2 мл среды (, 10) в микротитровальных ячейках при соотношении эффектора к клеткам-мишеням 301 в присутствии или отсутствие (контроль) добавок. Процент специфической цитотоксичности рассчитывали так же, как и для определения СС. ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ. Опухолевые клетки. Клетки меланомы 16-10, трансфецированные кДНК, кодирующей ассоциированный антиген рака человека С 215 (В 16-С 215) (.,-. . . . ,, 1994), выращивали в виде налипших клеток до субконфлуентности. Культуральная среда состояла из 1640 (, ,), дополненной 5,10-5 М -меркаптоэтанолом (,,США), 2 мМ-глютамина , 0,01( , Израиль) и 10 эмбриональной сывороткой теленка . Клетки снимали путем быстрой инкубации в 0,02 ЭДТА и суспендировали в ледяном физрастворе на фосфатном буфере с 1 сывороткой сингенных мышей (наполнитель) в концентрации 4,105 клеток/мл. Животные и лечение животных. Мыши, возрастом 12-19 недель, являлись трансгенными мышами С 57 В 1/6 по 3 цепи рецептора Т клеток (.,79(1993) 520-527). Внутривенно в хвостовую вену инъецировали сто тысяч опухолевых клеток В 16-С 215 в 0,2 мл наполнителя. На 1, 2 и 3 дни мыши получали при внутривенной инъекции 215- или 215- ( 227 А) в 0,2 мл наполнителя в дозах, отмеченных на фиг. 5. Контрольные мыши получали только наполнитель согласно той же схеме. На 21 день после инъекции опухолевых клеток мышей забивали путем смещения шейных позвонков, извлекали легкие и фиксировали в растворе , подсчитывали количество метастазов в легких. РЕЗУЛЬТАТЫ. Сканирование аланина в стафилококковом энтеротоксине А. Первоначально структурабыла неизвестна и можно было только делать спекуляции в том, какие боковые цепи доступны на поверхности. Следовательно, большинство мутантов выбрали из линейно расположенных гомологичных суперантигенов (,248 (1990) 705-711). Чтобы некоторые из тех суперантигенов предположительно связывались с - консервативным образом, по традиции выбирали консервативные (в основном полярные) остатки (., . . 147 (1991) 3876-3881). Замещения на аланин использовали в соответствии с опубликованной стратегией (,244 (1988) 1081-1085). В процессе выполнения настоящей работы появилась доступная информация) было показано, что ион 2 является важным для взаимодействия междуи МНС классом(-) (., . . . .89 (1991) 5507-5511),) был представлен множественный анализ энтеротоксина В стафилококка(., . . . 175 (1992) 387-396),) представлена структура(.,359 (1992) 801-806). Было обнаружено, что наш первый мутант, проявляющий серьезно пониженное сродство к -, 227 очень плохо образует координатную связь с 2 (данные не представлены). Учитывая полную укладкуи , новые данные предполагают две области связывания МНС классаодна включает ион 2 и одна соответствует участку,определенному у . На основе данного предположения был получен второй набор мутантов. Этот второй набор мутантов экспрессировали в виде , несущего глицин, добавленный к амино концу. Сначала было показано, что расширение не имеет влияния на связывающие свойства дикого типа(следующий раздел). Большинство мутантов экспрессировались и секретировались .в функциональном виде, что определяли по данным анализа связывания моноклональных антител(табл. 1). Были получены очень небольшие количества мутантов Е 154 А/ 156 А и 160. Они были последовательно исключены из исследования. Мутанты, обладающие замеще 12 4927 1 нием на Ала по остаткам 128, 187, 225 или 227, не различались моноклональным антителом 1 Е. Последние два мутанта, проявляющие пониженный уровень экспрессии (более выраженный при 34 С, чем при 24 С), мигрировали быстрее при - электрофорезе в денатурирующих, но не восстанавливающих условиях (все другие мутанты мигрировали как дикий тип , данные не представлены). При оценке анализа КД спектра структура 227 А могла немного отличаться от нативного(фиг. 2), но стабильность была очень близка к дикому типу(определяли по устойчивости к денатурации гуанидинхлоридом). Рассчитаннаямежду мутантом и нативным составляла 0,16 ккал/моль, что составляет только около 4 от значений ) (данные не представлены). В целом, все сигналы при КД анализе были очень низкими, как ожидается, преимущественно, от -складчатой структуры. Недавно было доложено, что 225 координирует 2 (неопубликованные данные в работе., (. . . .89 (1991) 5507-5511). Поскольку 227 участвует в координатной связи 2 (выше) и предположительно расположен в той же -складчатой структуре, как и 225, это предполагает, что данных два остатка составляют цинк-связывающие ядра, обнаруженные в белках с цинккоординирующими структурами (, , 29 (1990) 5647-5659). Связывание с МНС классоми рецептором Т клетки. Сродство МНС классарассчитывали из количества, требующегося для конкуренции с меченным флуоресцеиномдикого типа для клетки , проявляющей большое количество МНС класса . Способность вытеснения для мутанта рассчитывали из концентрации, дающей 50 ингибирования (50), связанной флуоресцентной метки, по сравнению с концентрацией, требующейся длядикого типа в качестве конкурента. Длядикого типа и некоторых мутантов сравнивали результаты данного анализа с результатами, где использовали меченный 125 дикого типа в качестве следового количества. Как можно видеть из табл. 2, значения, полученные из этих двух анализов ингибирования, хорошо коррелируют. Было определено прямое связывание МНС классадля шести выбранных мутантов,используя 125-меченный мутант(табл. 2). Для мутанта Н 50 А значения, полученные из прямого определения связывания и определения ингибирования, коррелируют хорошо,однако с мутантом 47 А было обнаружено большое расхождение непосредственное связывание показывает только в 7 раз более слабое связывание, чем для дикого типа , но оба конкурентных анализа показывают, около, в 70 раз пониженное связывание. Данные двух из других мутантов показывают два различных типа взаимодействий при связывании. Для мутантов Н 225 А и Д 227 А в тех же определениях сродство было ниже, чем предел определения. Ранее мы показали, что белки слияния, состоящие изфрагмента реактивного к карциноме антитела и , могут быть использованы для направления цитотоксического действия Т клеток на специфический лизис раковых клеток, несмотря на то, что взаимодействие междуи рецептором Т клеткиявлялось слишком слабым, чтобы быть зарегистрированным само по себе (., . . . .в печати). Таким образом, в противоположность к анализам, включающим контекст выделенного суперантигена слияния , позволяет проводить функциональное определение для взаимодействия междуи , независимо от связывания МНС класса . Соответственно, эффективность различных конъюгатов непосредственно направлять Т клетки на лизис клеток, распознаваемых поостатку, определяли по выходу хрома. Данный анализ подтверждает, что мутации, проявляющие воздействие на связывание МНС класса ,не влияют на связывание(табл. 2). Биологические эффекты мутаций. Пролиферативное действие было определено в виде способности стимулировать периферические лимфоциты к делению. Все три мутанта, которые очень слабо конкурировали за МНС класс , индуцировали слабую пролиферацию или не вызывали ее, а 13 4927 1 промежуточный мутант Н 187 А проявлял некоторую пролиферативную способность, тогда как другие исследованные мутанты были неразличимы от дикого типа (табл. 3).. (. . 61 (1993) 3175-3183) недавно доложил о сходной сильной редукции стимуляторной активности Т клетки для мутантов 47 и 48. Очевидно, сильная редукция в любой из двух предполагаемых областей связывания приводит к сильному воздействию на способность индуцировать пролиферацию. Это предполагает, чтоперекрестно сшивает две молекулы МНС класса , приводя к димеризации ТСД и что это является необходимым для получения сигнала трансдукции. В отличие от эффективности различных мутантов по направлению, стимулированныхпод действиемТ клеток, к лизису клеток-мишеней, обладающих МНС класса, скорее наблюдается корреляция со сродством связывания, чем со способностью конкурировать (табл. 3). Например, эффективности 47 и 48 А являются пониженными только в 2,5 раза и 300 раз соответственно. Таким образом, здесь, очевидно, также нет неотъемлемого требования для двухвалентности. Увеличение в мультивалентности, являющееся результатом значительно большего количествана поверхности активированной Т клетки, возможно, частично экранирует эффект низкой способности взаимодействия /МНС класса . Путем использования специфических бифункциональных антител карциномы, содержащих один анти-3 остаток и один антикарциномный остаток, ранее было показано, что данная димеризация не является необходимой для непосредственной цитотоксичности Т клетки (.,264 (1994) 833-35). Функциональные экспериментырезультаты представлены на фиг. 6 А и 6 Б. Лечение мышей 21- и 21- (227 А) по понижению количества метастазов в легких клеток В 16-С 215 меланомы являлось высокоэффективным. Терапевтическое действие, по существу, было идентичным для двух вариантов целевых суперантигенов. Лечение 21- приводило к 70 летальности в дозах 5 мкг/инъекцию. В противоположность этому, смертность мышей в тех же дозах при применении 21- (5227 А) не было. Рассматривая вместе, (227 А) является примером мутанта с пониженной токсичностью и сохраненной терапевтической эффективностью при включении в - белок слияния. ДИСКУССИЯ. Недавно была доложена структура комплекса междуи - (., 368 (1994) 711-718). Большинство идентифицированных остатков , участвующих в данном взаимодействии, являются консервативными в . Наши данные по мутанту 227 А показывают слабое сродство взаимодействия между данным участком в.,(1994) 324-27). Были исследованы различия во взаимодействии между , и - и было показано, что комплекс междуи - не являлся стабильно поддерживаемым в отсутствие . Эксперименты по плазмоновому (рентгеновскому) резонансу показывают, что это происходило из-за очень быстрой скорости распада. Полученные эффекты захвата, еслиперекрестно пришивает две молекулы МНС класса , вслед за последовательной полимеризацией , могли бы объяснить, каким образомможет индуцировать пролиферативное действие при концентрациях,много ниже . Учитывая, что мутация 47 снижает сродство амино концевого участка ниже значимого,участка с 2 составляет около 95 нМ. Данная гипотеза недавно была подтверждена наблюдением, что мутанты 47, 47/50 и 47/48/50 проявляют идентичное сродство к МНС класса , так же как и 47 (неопубликовано). Основываясь на структуре(., . . . 175 (1992) 387-396) и на линейной гомологии (,248 (1990) 705-711), строго подтверждается, что 225 и 227 расположены в той же -складке и, таким образом, цепи 14 4927 1 должны быть проксимальными. Следовательно, наиболее вероятно, что эти два остатка составляют цинк-связывающее ядро, обнаруженное в цинк-координирующих белках(, , 29 (1990) 5647-5659). Подобно данным мутантам, мутанты с заменами по остаткам 128 и 187 также являются распознаваемыми всеми моноклонами,за исключением 1 Е.., (. . . .89 (1991) 5507-5511) показали,что 2 связывается си требуется для высокоаффинного взаимодействия с МНС класса . Сродство для цинка не изменяется путем добавления -. Основываясь на данном наблюдении и высоком сродстве к 2 ( около 1 мкМ), было предположено, что координатная связь обеспечивается исключительнои включает 4 координатных складки. Наши данные отмечают участие четырех остатков 128, Н 187, Н 225 и 227. Функции двух бывших остатков не ясны за исключением обеспечения возможной помощи лиганда 128 в депротонировании 227. Одним из аргументов в пользу этого является то, что влияние замены 227 более серьезное, чем замены Н 225. Ранее было доложено, что корреляция между сродством различных суперантигенов к МНС классаи способностью стимулировать Т клетки к пролиферации отсутствует(., . . 147 (1991) 3876-3881). Эти данные возможно частично объясняются различным сродством суперантигенов по отношению к различным-цепям. Здесь нами обнаружено такое же отсутствие корреляции, но в отличие от отдельных суперантигенов мутанты проявляют идентичное сродство к , как показано в контексте- (определяемого в виде ). Наиболее вероятным объяснением отсутствия корреляции является то, что две связывающие области, идентифицированные в данном анализе, представляют два различных участка связывания, которые обеспечивают не только кооперативное связывание, но которые приводят к перекрестному сшиванию двух молекул МНС класса , который в свою очередь обеспечивает димеризацию двух молекул рецептора Т клетки. Это означало бы, что сродство обоих участков является важным для получения пролиферативного эффекта. Взаимодействия внутри гексамерного комплекса,включающего две молекулы ,и МНС класса , приводят к высокой захватываемости. Таким образом, сильное средство/захватываемостьпо отношению к МНС классадает возможность взаимодействияс , несмотря на низкое непосредственное сродство. Другие дубликаты биоспецифического сродства белок слияния (227 А) и связывающего домена белка А стафилококка был получен путем рекомбинантной технологии и экспрессируется в . . Данный реактив успешно применяли для нацеливания Т-лимфоцитов на клетки 4 и - (полученные из АТСС), которые являются 7 и 38 позитивными, но -, - и - негативными. Клетки 4 ипреинкубировали с анти-7 или анти-38 моноклонами мыши (,Германия). Для того чтобы усилить связывание между моноклонами мыши и связывающей частью белка слияния, было также добавлено антитело кролика противмыши. По сравнению с белком А-, белок А-( 227 А) имеет пониженную способность связываться с клетками , экспрессирующими антиген МНС класса . Общее к чертежам мутант (227 А) ((9) или мутант 9) ко времени даты приоритета был наиболее многообещающим вариантом . Таким образом, мы отбирали для представления результатыис данным вариантом (фиг. 3-6). Фиг. 1 представляет схематическое изображение плазмиды, используемой для экспрессиии 21-. Кодирующие области и два транскрипционных терминатора,следующие за продуктами генов, отмечены прямоугольниками. Ген, кодирующий белок устойчивости к канамицину, отмечен .представляет репрессор гена .и СН 1 отмечают гены, кодирующиефрагмент тяжелой цепи антигена мыши С 215. Подобно к и Ск отмечают гены, кодирующие каппа цепь.представляет ген, кодирующий белок контроля репликации из рВ 322. Промотеры, направляющие транскрипцию продукта ге 15 4927 1 нов, показаны стрелками, в рК 889 промотори в других двух векторах промотор белкастафилококка . Область, содержащая природу репликации, отмечена . Различием между , кодирующим рКР 943 и рКР 1055, является только глициновый остаток, добавленный к Н-концу последнего. Ген , содержащий последний вектор, также содержит несколько уникальных участков для рестрикционных ферментов, введенных путем молчащих мутаций. Фиг. 2 представляет спектр кругового дихроизмадикого типа и мутантов 47 и 227 А, представляющих мутации с наиболее серьезными редукциями в области связывания каждого МНС класса . Сплошная линия представляет кривую для дикого типа . Кривые для мутантов представлены пунктирной или штрихпунктирной линиями для Р 47 А и 227 А соответственно. Фиг. 3 представляет концентрационную зависимость суперантиген-зависимой опосредованной клеточной цитотоксичностидляи (227). Фиг. 4 представляет концентрационную зависимость суперантиген-зависимой опосредованной клеточной цитотоксичностидля 21- и 21( 227 А). Фиг. 5 представляет концентрационную зависимость суперантиген -зависимой опосредованной клеточной цитотоксичностидля 215- и 215(227 А). Фиг. 6 А представляет сравнение терапевтического действия, полученного на С 57 В 1/6 мышах, несущих легочные метастазы клеток меланомы В 16-С 215 при лечении с 215 и 215-(227 А). Фиг. 6 Б представляет токсическое действие С 215- и С 215-(227 А) при лечении, как представлено на фиг. 6 А. Таблица 1 Подтверждение структурной целостности мутанта Определяли связывание шести моноклональных антител Мутация Дикий тип 11/14 45 47 Н 50 А К 55 А Н 114 А 123/132 128 147/148 Е 154 А/156 А 160 Н 187 А Е 191/195 А 197 Н 225 А 227 Примечания знак плюс означает связывание, скобки означают от 50 до 90 связывания, по сравнению с диким типом . НО означает не определено. 4927 1 Таблица 2 Связывание мутантов с МНС классаи рецептором Т клетки. Последнее определяли в виде способности специфически направлять активированные цитотоксические Т-клетки лизировать клетки карциномы, используя слияния - различных мутантов . С 50(нМ) 50(нМ) 227 9000 10000 8000 100 Примечания 1) НО означает не определено 2) в контексте а- спейсер между С 1 иоканчивается на . Таблица 3 Биологические эффекты мутаций. Была определена способность стимулировать покоящиеся Т клетки к пролиферации и способность направлять цитотоксические клетки к лизису клеток-мишеней, проявляющих МНС класса( - зависимая от суперантигена опосредованная клеточная цитотоксичность). Мутация Пролиферация,50 (относительная) дикий тип 100 1 НО 1 11/14 187 15 4 Е 191 А/195 А 100 1,1 197 НО 1,3 225 0,2 3102 227 0,01 3102 Примечания НО означает не определено. 17 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.