Многокомпонентная антигенная композиция и ее применение

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ МНОГОКОМПОНЕНТНАЯ АНТИГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ(71) Заявитель НОВАРТИС ВЭКСИНЕС ЭНД ДАЙЭГНОСТИКС ЛИМИТЕД(73) Патентообладатель НОВАРТИС ВЭКСИНЕС ЭНД ДАЙЭГНОСТИКС ЛИМИТЕД(57) 1. Способ получения антигенной композиции в форме суспензии, заключающийся в том, что вносят поверхностный антиген гепатитав раствор фосфата алюминия в кислой среде до концентрации 5-50 мкг/мл и смешивают в течение, как минимум, 10 мин добавляют токсоид дифтерии до концентрации 5-50 /мл добавляют токсоид столбняка до концентрации 1-20 /мл и антиген коклюша до концентрации 5-50 /мл при необходимости осуществляют коррекцию рН до значения 6,0-7,0 и добавляют конъюгат антигенадо концентрации 1-50 мкг/мл. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют коррекцию рН до значения 6,0-7,0 после добавления каждого антигена. 3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что смешивание осуществляют в среде с 6,0-7,0. 4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что смешивание осуществляют при температуре 15-30 С. 5. Антигенная композиция, полученная способом по любому из пп. 1-4. 6. Антигенная композиция на водной основе, содержащая фосфат алюминия,в концентрации 5-50 мкг/мл, токсоид дифтерии в концентрации 5-50 /мл, токсоид столбняка в концентрации 1-20 /мл, антиген коклюша в концентрации 5-50 /мл и конъюгат антигенав концентрации 1-50 мкг/мл, причемадсорбирован фосфатом алюминия, а конъюгат антигенане адсорбирован фосфатом алюминия. 7. Способ вызывания иммунного ответа пациента, заключающийся во введении пациенту композиции по п. 5 или 6. 16782 1 2013.02.28 8. Применение композиции по п. 5 или 6 в качестве вакцины. 9. Применение композиции по п. 5 или 6 для получения препарата для профилактики инфекционного заболевания, вызванного вирусом гепатита , . , . ,.и/или .тип . Изобретение относится к способу получения и составу многокомпонентной суспензии антигенов, обладающих высокой стабильностью. Комбинирование взвеси антигенов в одном сосуде является привлекательным методом 1, 2, 3, но может оказаться затруднительным в результате взаимодействия между различными сочетаемыми компонентами, особенно в жидких рецептурах 4. При этом возникают такие проблемы, как взаимовлияние антигенов, конкуренция между ними, деградация антигенов, подавление активности эпитопов и несовместимость с адъювантами(вспомогательными несущими компонентами состава). При этом также усложняется контроль качества смесей. Однако комбинирование антигенов не всегда связано с отрицательными эффектами. Например, сочетание антигенов против дифтерии, столбняка и коклюша (ДСК, или )(с использованием как цельноклеточных , так и бесклеточныхантигенов коклюша) используется в иммуногенных составах в течение многих лет, а дополнительное включение в состав ДСК капсульного полисахаридного конъюгата . , тип фактически может привести к повышению реакции антител на компонент 5. Сочетание антигенов против кори, свинки и краснухи (КСК или ) также находит широкое применение. Однако сообщается о проблемах с экспериментальным подтверждением эффективности некоторых иммуногенных фармацевтических средств, включая ДСК, , инактивированный вирус полиомиелита (ИВП, или ) и вирус гепатита(ВГВ, или ) 6. Сообщалось также о проблемах с выбором адъювантов для комбинаций антигенов вирусов гепатитаи В 7 и для комбинаций с участием 8, 9. Например, в качестве адъюванта для антигенов ДСК обычно используется гидрооксид алюминия, но это соединение может обуславливать гидролиз капсульного полисахаридного антигенав жидких рецептурах 9, 10. Известны жидкие пятикомпонентные иммуногенные составы, в которых иммунный ответ на компонентуменьшался после комбинирования с другими компонентами 11, 12, предположительно, в результате синергетического ингибирования иммунного ответа на антиген , обуславливаемого компонентамии . В отличие от этого сообщается об отсутствии отрицательного влияния на иммуногенность компонентов жидкого шестикомпонентного состава с сочетаниемполио 13. Этот шестикомпонентный продукт в Европе одобрен к использованию для человека и выпускается под названием . Цель данного изобретения заключается в совершенствовании (например, путем повышении стабильности) жидких комбинированных вакцин и способов их производства. В частности, цель изобретения заключается в совершенствовании комбинированных продуктов, включающих антигены вируса гепатита. Изобретение предусматривает процесс приготовления антигенного состава, включающий следующие этапысмешивание поверхностного антигена гепатитас раствором фосфата алюминия в кислой средедобавление в раствор (в любой последовательности) антигена дифтерии, антигена столбняка и антигена коклюша идобавление в раствор конъюгата антигена . Установлено, что иммуногенность антигенаявляется оптимальной при адсорбции алюмофосфатным адъювантом, однако конъюгатыподвергаются гидролизу при адсорбции гидрооксидом или фосфатом алюминия. Преимуществом процесса, пред 2 16782 1 2013.02.28 лагаемого по изобретению, является создание жидкой рецептуры, в которой антигенадсорбируется алюмофосфатным адъювантом, тогда как конъюгатне подвергается адсорбции таким алюмосодержащим адъювантом. Этот процесс обеспечивает высокую степень адсорбциии общую стабильность. Изобретение также предусматривает водный состав, содержащий фосфат алюминия,поверхностный антиген гепатита, антиген дифтерии, антиген столбняка, антиген коклюша и конъюгат антигена , в котором антигенадсорбируется фосфатом алюминия, а конъюгат антигенане адсорбируется фосфатом алюминия. Последовательность смешивания антигенов. Этапы - процесса по изобретению предпочтительно должны выполняться в определенном порядке, т.е. антигендолжен вводиться в раствор фосфата алюминия до введения антигенов , а конъюгатдолжен вводиться после антигенов . Применительно к этапупредпочтительно, но не обязательно вводить антиген дифтерии до антигенов столбняка и коклюша. Это способствует адсорбции антигена дифтерии алюмосодержащим адъювантом. В рамках этапаантигены столбняка и коклюша могут вводиться в любом порядке. В промежутках между операциями введения каждого антигена предпочтительно следует осуществлять перемешивание раствора (например, посредством помешивания) в течение, как минимум, 10 мин (например, в течение 30 мин).и температура. Во время этапапроцесса по изобретению фосфат алюминия и антигенсмешиваются в водной среде. В результате этого этапа происходит адсорбция антигенаалюмофосфатным адъювантом. Если во время перемешивания значениебудет слишком низким, то произойдет денатурирование антигена . Еслибудет чрезмерно высоким, то адсорбцияфосфатом алюминия не произойдет. Процесс может включать операцию корректировкипосле введения каждого антигена. После введения антигенана этапепри необходимости может быть произведена корректировкапримерно до его исходного значения. После добавления индивидуальных антигенов группыв рамках этапатакже может быть произведена корректировка . После завершения этапаи до введения конъюгата антигенав рамках этапапредпочтительно произвести корректировкус целью его доведения примерно до нейтрального значения. После введения конъюгата антигена в рамках этапапредпочтительно следует произвести корректировкус целью обеспечения приемлемости раствора для введения пациентам. Для предотвращения возвращения токсоида дифтерии в токсичное состояние предпочтительно следует обеспечитьна уровне менее 7,0. Поэтому предпочтительными являются значенияв диапазоне 6,2-6,9. Процесс по изобретению предпочтительно следует вести при температуре от 15 до 30 С (например, в диапазоне от 19 до 27 С, т.е. 234 С). Фосфат алюминия. Процесс по изобретению основан на смешивании антигенов с фосфатом алюминия в водной среде. Такая смесь фосфата алюминия с водой обычно именуется раствором, хотя,строго говоря, с точки зрения физико-химических характеристик эта соль является нерастворимой и образует суспензию. Фосфат алюминия предпочтительно следует использовать в виде водного раствора, в который вводятся антигени затем другие антигены. Перед вводом нтигенных компонентов предпочтительно следует разбавить фосфат алюминия до требуемой концентрации и обеспечить гомогенность раствора. Концентрация ионов 3 до введения антигенаобычно составляет от 0 до 10 мг/л. Раствор фосфата алюминия может также содержать буферное соединение, но это необязательно. 3 16782 1 2013.02.28 Раствор фосфата алюминия предпочтительно должен быть стерильным. Стерилизация фосфата алюминия посредством фильтрации невозможна, поэтому для его стерилизации предпочтительно следует применять обработку в автоклаве. Фосфат алюминия предпочтительно не должен содержать пирогенных компонентов. В растворе фосфата алюминия также может содержаться хлорид натрия. Поверхностный антиген гепатита . Приготовление антигенадетально описано в имеющейся документации. Описаны различные формы этого антигена (например, полностью или частично включающие последовательность -, антиген , описанный в 14 полипептид -2-, описанный в 15 или его аналоги, такие как описанные в 16 -мутанты, описанные в 17 и 18, такие какс мутацией 145). Любые из этих форм могут использоваться в рамках данного изобретения. Антигенможет вырабатываться в процессе очистки плазмы или выделяться в эвкариотических системах выделения, таких как дрожжевые клетки или клетки яичника китайского хомяка 19. Выделение в дрожжевых клетках является предпочтительным. Антигенпреимущественно применяется в виде частиц. Эти частицы предпочтительно должны сохранять форму, в которых они были выделены из дрожжей. Антигенможет быть инактивирован, например, посредством обработки формалином. Антиген дифтерии. В качестве антигена дифтерии предпочтительно следует применять токсоид дифтерии. Приготовление дифтерийного токсоида подробно описано в имеющейся документации глава 3 в 20 глава 9 в 21. Можно использовать любой подходящий токсоид дифтерии. Антиген столбняка. В качестве антигена столбняка предпочтительно следует применять столбнячный токсоид. Приготовление столбнячного токсоида подробно описано в имеющейся документации глава 4 в 20 глава 18 в 21. Можно использовать любой подходящий токсоид столбняка. Антиген коклюша. Антиген коклюша, используемый в соответствии с изобретением, может иметь клеточную (например, цельноклеточную) или бесклеточную форму. Приготовление антигенов обоих типов подробно описано в имеющейся документации глава 14 в 21 22. В случае использования бесклеточных антигенов предпочтительно следует использовать холотоксин коклюша (РТ) и филаментозный гемагглютинин , еще более предпочтительно в сочетании с пертактином (также известным под названием , или антиген 69 кДа) и, при желании, с агглютиногенами 2 и 3 (также известными под названием ) 23. Типичный состав смеси антигенов коклюша в одной дозе вакцины 10 мкг , 5 мкг , 3 мкг , 5 мкг сочетания агглютиногенов. Токсинявляется токсичным белком и поэтому при вводе в состав антигена коклюша его предпочтительно следует обезвреживать. Детоксификация может осуществляться с применением химических или генетических методов. Предпочтительным детоксифицированным мутантом является двойной мутант 9/129 24, именуемый ниже . Конъюгат антигена . Приготовление полисахаридных конъюгатов и, в частности, капсульных полисахаридов гемофильной палочкитипа Вподробно описывается в имеющейся документации 25-33 и т.п В данном изобретении можно использовать любой подходящий конъюгат . В качестве сахаридной части конъюгата можно применять полисахарид (например,полномерную цепочку ), но по предпочтительному варианту следует осуществлять гидролиз полисахаридов (например, кислотный гидролиз) с целью образования олигоса 4 16782 1 2013.02.28 харидов (например, с молекулярной массой от 1 до 5 кДа). В случае применения гидролиза получаемый продукт может сортироваться по размерам, чтобы удалить слишком короткие олигосахариды, которые не обладают эффективным иммуногенным действием. Предпочтительными сахаридными антигенами являются олигосахариды, отсортированные по размеру. В качестве несущей части конъюгата, как правило, применяется белок. Предпочтительными несущими белками являются бактериальные токсины или токсоиды, такие как токсоиды дифтерии или столбняка. Эти вещества часто используются в конъюгатных вакцинах. Особо предпочтительным является токсоид дифтерии 197 34, 35, 36. К другим приемлемым несущим белкам относятся белок внешней оболочки бактерии.37, синтетические пептиды 38, 39, белки, подвергнутые тепловому удару 40, 41, белки бактерии коклюша 42, 43, белокгемофильной палочки .44, цитокины 45, лимфокины 45, гормоны 45, факторы роста 45, токсины А или В бактерии .46 и т.п. Также можно использовать смеси различных несущих белков. Для конъюгации сахаридовмогут использоваться любые приемлемые активирующие или связующие химические методы. Как правило, сахарид активируется или приводится в функциональное состояние перед выполнением конъюгации. Для активации могут применяться, например, цианирующие реагенты, такие как(например, 1-циано-4 диметиламино-пиридин-тетрафтороборат 47, 48). В других приемлемых методиках используются карбодиимиды, гидразиды, активные эфиры, норборан, -нитробензольная кислота, -оксисукцинимид, - (сульфооксисукцинимид),(1-этил-3-(3 диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид),(1,1,3,3-тетраметилуроний-тетрафтороборат) введение к 49. Связи с помощью линкерных групп могут выполняться с использованием любых известных методов, например с использованием методик, описанных в 50 и 51. Один из типов связей основан на восстановительном аминировании полисахарида, связывании получаемой аминогруппы с одним концом адипиновой кислотной линкерной группы и последующим прикреплением белка к другому концу адипиновой кислотной линкерной группы 52, 53, 54. К числу других линкеров относятся -пропионамидол 55, нитрофенил-этиламин 56, галиды ацил-галогенов 57, гликозидные звенья 58, 6-аминокапроновая кислота 59,60, углеводородные составляющие от 4 до 12 61 и т.п. В качестве альтернативы использованию линкеров можно использовать прямые связи. Для образования прямой связи с белком может потребоваться окисление полисахарида с последующим восстановительным аминированием вместе с белком, как описано, например, в 62 и 63. Предпочтительный конъюгат содержит сахарид , ковалентно связанный с токсоидом 197 с помощью диэфира янтарной и адипиновой кислоты 64, 65. Характеристики составов по изобретению. В результате применения процесса по изобретению получают состав, содержащий антигены, некоторые из которых адсорбируются алюмофосфатным адъювантом. Этот состав предпочтительно должен обладать иммуногенными свойствами. Составы по изобретению могут использоваться в профилактических целях (т.е. для предотвращения инфекции) и в терапевтических целях (т.е. для лечения заболевания, вызванного инфекцией). Состав предпочтительно имеет жидкую рецептуру (т.е. не является сухим составом,получаемым посредством лиофилизации). Это обычно означает, что состав имеет водную основу, например, является суспензией. Состав по изобретению предпочтительно является стерильным. Поскольку фосфат алюминия и цельноклеточные антигены коклюша не поддаются стерилизации посредством фильтрования, предпочтительным способом является стерилизация состава по изобретению в автоклаве и (или) использование стерильных компонентов при приготовлении состава. 5 16782 1 2013.02.28 Состав по изобретению предпочтительно не должен содержать пирогенных компонентов. Состав по изобретению предпочтительно должен иметьв диапазоне от 6,0 до 7,0. Состав предпочтительно должен снабжаться буферным раствором для поддержания этого значения . Концентрация ионов 3 в составе по изобретению в общем случае составляет от 0,1 до 2,0 мг/мл. Состав может содержать хлорид натрия. Концентрация хлорида натрия в составе предпочтительно должна быть в диапазоне от 0,1 до 100 мг/мл. Концентрация антигенав общем случае составляет от 5 до 50 мкг/мл. Предпочтительная концентрация составляет от 10 до 30 мкг/л. Концентрация токсоида дифтерии в общем случае составляет от 5 до 50 флокулирующих единицна миллилитр. Предпочтительная концентрация составляет от 7,5 до 30 /мл. Концентрация токсоида столбняка в общем случае составляет от 1 до 20 /мл. Предпочтительная концентрация составляет от 2 до 9 /мл. При использовании клеточных антигенов коклюша концентрация антигенов коклюша в общем случае составляет от 5 до 50 оптических единицна миллилитр. Предпочтительная концентрация составляет от 10 до 40 /мл. Концентрация конъюгата антигенав общем случае составляет от 1 до 50 мкг/мл. Предпочтительная концентрация составляет от 10 до 30 мкг/мл. Состав может содержать консервант, такой как мертиолат. Концентрация консерванта предпочтительно должна быть низкой (например, 0,01 об. ). Консервант можно вводить извне либо в качестве компонента антигенов, смешиваемых для образования состава(например, консервант может присутствовать в антигенах коклюша или ). Однако применения ртутных консервантов предпочтительно следует избегать. Другие компоненты, приемлемые для введения в организм человека, описаны в 66. Состав по изобретению предпочтительно не должен содержать гидрооксида алюминия в измеряемой концентрации. Антигены будут присутствовать в составах по изобретению в иммунологически эффективном количестве, т.е. введение такого количества в организм как в виде одной дозы, так и в виде серии доз обеспечит эффективное лечение или предотвращение заболевания. Это количество зависит от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, его возраста, таксономической группы, к которой принадлежит индивидуум(например, низшие приматы, приматы и т.п.), способности иммунной системы индивидуума к синтезу антител, желаемой степени защиты, рецептуры состава, оценки медицинской ситуации по мнению лечащего врача и других релевантных факторов. Предполагается, что требуемое количество будет входить в достаточно широкий диапазон, который может быть определен посредством проведения обычных экспериментов. Вакцинация может производиться посредством введения одной дозы или нескольких доз по установленному графику (например, включая бустерные дозы). Состав может вводиться в сочетании с другими иммунорегулирующими средствами. Как правило, составы по изобретению подготавливаются в виде препаратов для инъекций. Прямой ввод составов в общем случае будет производиться парэнтерально (например, посредством подкожной, внутрибрюшной, внутривенной или внутримышечной инъекции или посредством введения во внутритканевое пространство). Составы также могут вводиться в пораженное место. Составы по изобретению с установленной рецептурой могут вводиться непосредственно пациентам. Пациентами могут являться животные в частности, можно проводить лечение людей. Вакцины являются особенно полезными для вакцинации детей и подростков. 16782 1 2013.02.28 Стандартные модели для экспериментов на животных и, а также корреляты защиты, используемые для оценки действенности вакцин ,и , хорошо известны. Адсорбция антигенов. В составах по изобретению антигенадсорбируется фосфатом алюминия. Предпочтительно, чтобы адсорбция была как можно более полной, например, из общей массы , имеющейся в составе, должно быть адсорбировано не менее 80(или,например, не менее 85, 90, 95, 98, 99 и более). Токсоид дифтерии, как правило, адсорбируется фосфатом алюминия. Предпочтительно, чтобы адсорбция была частичной, например, из общей массы дифтерийного токсоида,имеющегося в составе, должно быть адсорбировано примерно 30-80(или, например,примерно 40-70 , примерно 50-60 и т.п.). При хранении при температуре около 37 С степень адсорбции дифтерийного токсоида возрастает с течением времени. Токсоид столбняка, как правило, адсорбируется фосфатом алюминия. Предпочтительно, чтобы адсорбция была частичной, например, из общей массы столбнячного токсоида,имеющегося в составе, должно быть адсорбировано не более 40(или, например, не более 30 , не более 20 , не более 10 и т.п.). Степень адсорбции столбнячного токсоида может быть равна 0 . Конъюгатне адсорбируется алюмосодержащим адъювантом. Методы применения. Изобретение предусматривает способ вызывания иммунного ответа пациента, заключающийся во введении в организм состава по изобретению. Изобретение также предусматривает состав по изобретению, который может применяться в качестве медикамента (например, в качестве иммуногенного состава). Изобретение также предусматривает использование состава по изобретению при производстве медикаментов для лечения и (или) предотвращения заболеваний. Способы или области использования предпочтительно обеспечивают защиту от инфекции патогенами , . , . , .и (или) .. Эти патогены вызывают гепатит, дифтерию, столбняк, коклюш и (или) бактериальный менингит. Способы или области использования предпочтительно обеспечивают защиту от этих болезней. К числу других болезней, вызываемых гемофильной палочкой . , относятся воспаление среднего уха, бронхит, пневмония, целлюлит и перикардит. Предпочтительными пациентами являются люди. Предпочтительными пациентами являются дети. Способ может обеспечить бустерную реакцию в организме пациента, который ранее уже был иммунизирован. Единичная доза состава предпочтительно составляет 0,5 мл. Изобретение также предусматривает средство введения (например, шприц или безыгольный инъектор), содержащее состав по изобретению. Средство введения предпочтительно содержит одну дозу вакцины. Другие компоненты состава. Состав по изобретению предпочтительно является пятикомпонентным (1)(2)(3) дифтерия (4) столбняк (5) коклюш. Однако изобретение не исключает возможность включения в состав дополнительных антигенов (например, создание шестикомпонентных, семикомпонентных, восьмикомпонентных, девятикомпонентных, десятикомпонентных составов, а также составов с более высоким числом компонентов). Например,состав может включать один или несколько из нижеуказанных дополнительных антигенов белковый антиген из . , серогруппа В, например, описанный в 67-73 везикулярный препарат внешней оболочкибактерии . , например,описанный в 74, 75, 76, 77 и т.п. 7 16782 1 2013.02.28 сахаридный антиген из ., серогруппа А, С, 135 и (или) , такой как олигосахарид, описанный в 78 из серогруппы С 79, или олигосахариды, описанные в 80 сахаридный антиген из 81, 82, 83 антиген из вируса гепатита , например инактивированный вирус 84, 85. антиген(-ы) полиомиелита 86, 87, например, такие как оральная вакцинаили,предпочтительно, инъекционная вакцина . Состав может включать один или несколько из этих дополнительных антигенов. Определения. Термин содержащий означает включающий, а также состоящий например, состав, содержащий , может состоять исключительно изили же может включать нечто дополнительное, например. Термин примерно применительно к численному значениюозначает, например,10 . На фиг. 1 показаны результаты анализа стабильности антигена , входящего в состав по изобретению, полученные по методике вестерн-блот. На фиг. 2 показаны результаты определения иммунодиффузии дифтерийного токсоида, входящего в состав по изобретению. На фиг. 3 показаны результаты определения иммунодиффузии столбнячного токсоида, входящего в состав по изобретению. На фиг. 4 показан график изменения во времени значенийсоставов по изобретению. Водная рецептура. Основной способ приготовления рецептуры заключался в выполнении следующих операций (1) ввести выделенный из дрожжей антигенв раствор фосфата алюминия (2) поочередно ввести антигены дифтерии, столбняка и коклюша (3) откорректироватьи (4) добавить конъюгат антигена -197. Дополнительные подробности описываются ниже начать с приготовления алюмофосфатного адъюванта добавить раствор антигена( 7,0 в фосфатно-солевом буферном растворе) до конечной концентрации 20 мкг/мл откорректироватьмешать в течение 305 мин (для обеспечения адсорбцииадъювантом) добавить дифтерийный токсоид до конечной концентрации 15 флокулирующих единицна миллилитр мешать в течение 30 мин добавить столбнячный токсоид до конечной концентрации 6,5 /мл мешать в течение 30 мин добавить клеточные антигены коклюша до конечной концентрации 30 оптических единицна миллилитр мешать в течение 30 мин при необходимости откорректироватьдобавить конъюгат 197- до конечной концентрации 20 мкг/мл мешать в течение 15 мин. Таким образом, окончательный состав антигенов в данной рецептуре имел следующий вид Компонент Концентрация Дифтерийный токсоид 15 /мл Столбнячный токсоид 6,5 /мл Цельноклеточный антиген коклюша 30 /мл Антиген гепатита 20 мкг/мл Конъюгат антигена гемофильной палочки 20 мкг/мл (как сахарид) 1978 16782 1 2013.02.28 Три отдельные партии этой рецептуры были подготовлены для экспериментов. Тестирование стабильности. В целях тестирования проводилось центрифугирование 10 мл этого состава с частотой вращения 3500 об/мин в течение 20 мин, после чего надосадочная жидкость фильтровалась через фильтр - с порами 0,22 мкм с целью отбора неадсорбированных антигенов. Отфильтрованная надосадочная жидкость в нулевой момент времени анализировалась на присутствие антигена(с использованием метода вестерн-блот), токсоидов дифтерии и столбняка (с помощью метода радиальной иммунодиффузии) и конъюгата(с использованием прибора , основанного на высокоэффективной анионнообменной жидкостной хроматографиив сочетании с импульсным амперометрическим детектором (. Также определялась концентрация свободного фосфата. Те же анализы выполнялись после хранения проб при температуре 2-8 С или 36-38 С в течение 2 недель или 4 недель. Анализ антигеновметодом вестерн-блот. Степень адсорбции антигенак алюмосодержащему адъюванту является важным фактором для его иммуногенности. Для этого анализа применялась процедура иммунного блоттинга, в сущности включавшая следующие операции 1 мл надосадочной жидкости вакцины подвергался осаждению с помощью - (дезоксихолат и трихлоруксусная кислота), денатурированию с помощью(буфер с низким содержанием соли) и затем помещался на 12-процентную полиакриламидную матрицу для выполнения электрофореза - (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) 1 мкг из каждой партиизагружался в качестве контрольной пробы (это представляет собой 5 дозы ) препарат козьих антител антииспользовался в качестве первичного антитела (с разбавлением 11000), а конъюгат пероксидазыкозьего антитела (с разбавлением 12500) использовался в качестве вторичного антитела. Результаты показаны на фиг. 1. Дорожки 6-8 на рис. 1 демонстрируют отсутствие поддающейся обнаружении концентрации растворимого антигенав пятикомпонентном составе в нулевой момент времени, а дорожки 5-10 на фиг. 1 и 1 демонстрируют, что эта ситуация сохраняется после двух и четырех недель хранения при температуре 2-8 С или 36-38 С. В трех различных партиях 99 антигенаостаются адсорбированными на адъюванте в этих разнообразных условиях. Дополнительный анализ стабильности был проведен после хранения при температуре 2-8 С в течение шести месяцев. Для каждой из этих трех партий степень адсорбции сохранилась на уровне 99 . Для позитивного контроля, показанного на фиг. 1, использовался 1 мкг . Наблюдалась одиночная полоса, соответствующая -пептиду (24 кДа) и характеристичная полоса агрегатов (45 кДа). Полосы -2 не наблюдались. Анализ на токсоиды дифтерии и столбняка по методике радиальной иммунодиффузии. Анализиспользовался для оценки единообразия характеристик различных партий токсоидов дифтерии и столбняка. Для подготовки эталонных кривых были выбраны одна партия дифтерийного токсоида и одна партия столбнячного токсоида. Для анализа на дифтерийный токсоид в пробу надосадочной жидкости вводилась стандартная добавка с концентрацией 10 флокулирующих единицна миллилитр, а для анализа на столбнячный токсоид использовалась стандартная добавка с концентрацией 5 /мл. Градуировочная кривая для дифтерийного токсоида состояла из точек, соответствующих концентрациям дифтерийного токсоида 5, 10, 20, 30 /мл. Градуировочная кривая для столбнячного токсоида состояла из точек, соответствующих концентрациям столбнячного токсоида 5, 10, 15, 20 /мл. В колонкизагружали либо эталонный раствор,9 16782 1 2013.02.28 либо пробу объемом 15 мкл. Конфигурация колонок показана в следующих таблицах, где численные величины означают концентрацию в /,относится к надосадочному объему состава. 30 5 На фиг. 2 показаны результаты анализадля одной партии дифтерийного токсоида в исходный момент времени (2) и после хранения в течение 4 недель при температуре 2-8 С (2) или 36-38 С (2). На фиг. 3 показаны результаты анализадля одной партии столбнячного токсоида в исходный момент времени (3) и после хранения в течение 4 недель при температуре 2-8 С (3) или 36-38 С (3). Результаты были подвергнуты компьютерному анализу с целью определения концентраций антигенов (с корректировкой на антиген в стандартной добавке) и, соответственно,для определения приблизительного (в пределах 10 ) значения процента адсорбции дифтерийного и столбнячного компонентов вакцины. Были получены следующие результаты. Партия 2-8 С 2 недели 4 недели Дифтерийный токсоид 50-60 50-60 50-60 50-60 40-50 40-50 Столбнячный токсоид 0-10 0-10 0-10 10-20 0-10 0-10 Анализ на содержание свободных и общих сахаридов . Критическим параметром стабильности и эффективности антигенов является процент гидролиза конъюгата . Клинический предел составляет 25 свободных сахаридов (в 10 сообщается, что 20 не оказывают влияния на клиническую иммуногенность). Этот параметр измеряется с помощью прибора , обеспечивающего возможность прямого количественного определения содержания несвязанных углеводов на пикомолекулярном уровне при минимальных потребностях в сепарации и очистке. Основной целью анализа является определение содержания свободных сахаридов. Анализ сахаридов проводится для определения общего содержания сахаридов (в мкг/мл) содержания свободных сахаридов (в результате гидролиза конъюгата 197-)(в мкг/мл). Значениевыражалось в виде процента отвеличинаили в виде процента от теоретической общей концентрации сахаридов (20 мкг/мл) величина е. Получены следующие результаты. Для клинического использования допускается содержание свободных сахаридов не свыше 25 . Все значения были ниже этого предела и при хранении в течение 4 недель при температуре 2-8 С были ниже 6,5 . В условиях повышенной температуры (4 недели при температуре 36-38 С) наблюдался более высокий уровень свободных сахаридов, однако даже максимальное значение 11,6 , наблюдавшееся для партии 1, было намного меньше лимита в 25 . В ходе предшествующей работы с многокомпонентными составами с использованием антигеновбыло показано, что степень гидролиза конъюгата - в течение одного месяца хранения при температуре 36-38 С была выше, чем в течение двух лет хранения при температуре 2-8 С. Поэтому можно ожидать, что при нормальных условиях хранения степень гидролиза останется приемлемой, как минимум, в течение 2 лет. Анализ на свободные сахариды, выполнявшийся с помощью прибора , также был проведен после хранения в течение 6 месяцев при температуре 2-8 С. Получены следующие данные. Партия 1 2 3 Таким образом, после хранения в течение 6 месяцев наблюдается лишь незначительное увеличение процентного содержания свободных сахаридов в сравнении с результатами, полученными после хранения в течение 4 недель, и полученные значения все еще намного ниже 25-процентного предела. Следовательно, конъюгат 197- демонстрирует весьма высокую стабильность во всех трех рецептурах.и осмолярность. На фиг. 4 показано изменение значенийв течение 6 месяцев хранения трех партий при температуре 2-8 С. На фиг. 4 показано изменениев течение 4 недель хранения трех партий при температуре 36-38 С. При температуре 2-8 С значенияоставались стабильными в течение 6 месяцев, тогда как в условиях повышенной температуры наблюдалось некоторое снижениена 0,1 после 2 недель и дальнейшее небольшое снижение после 4 недель. Все значенияоставались в диапазоне допустимых значений от 6,0 до 7,0. 11 16782 1 2013.02.28 Осмолярность всех трех партий была в диапазоне от 312 до 315 мОсм/кг, что соответствует центральной части диапазона от 240 до 360 мОсм/кг допустимых значений осмолярности вакцин для инъекций. Тестирование потенции и иммуногенности вакцины. Оценка потенции и иммуногенности антигенов имеет важное значение для оценки эффективности комбинированного продукта. Производилась оценка потенции антигенов дифтерии, столбняка и коклюша, а также определение иммуногенности конъюгатаи антигена . Для оценки содержания специфичных антител после иммунизации проводился анализ(ферментно-связанный иммуносорбентный анализ). Иммуногенность антигенаопределялась на модели мыши с использованием графика иммунизации, отличавшегося от графика, использовавшегося для определения потенции антигена вируса гепатита. Были получены нижеуказанные значения потенции антигенов дифтерии, столбняка и коклюша . Партия 1 2 3 Результаты тестирования на потенцию каждого из этих антигенов намного превышают минимальные допустимые пределы, что демонстрирует высокую эффективность этих трех антигенов. Для оценки иммуногенности антигенагруппам из 10 нормальных мышей(1) вводился пятикомпонентный продукт посредством подкожной инъекции (0,5 мл, с разбавлением солевым раствором до концентрации 14) в дни 0 и 14. В день 21 у мышей была взята кровь, использованная для иммуноферментного анализана антитела,специфичные для антигена , проводившегося по методике(тест Дейда-Беринга) или(тест Аббота). Эти иммуноферментные анализы выполняются по разным методикам и имеют разную чувствительность к антигенам. Поэтому значения среднегеометрических титров (СГТ), полученные с помощью этих двух тестов, нельзя сравнивать между собой. Однако в рамках каждого из этих тестов значения среднегеометрических титров сыворотки были оптимальными. Получены следующие результаты. Партия 1 2 3 Только адъювант Все значения СГТ, полученные в ходе этого анализа иммуногенности на мышах, были выше значений, сообщаемых в литературе. Процент респондеров (мышей, реагирующих на оба антигена) постоянно был высоким и находился на оптимальном уровне 100 . Для оценки иммуногенности антигенагруппам из 8 нормальных мышей (1) вводился пятикомпонентный продукт посредством подкожной инъекции (0,5 мл, с разбавлением солевым раствором до концентрации 14) в дни 0, 10 и 20. В день 34 у мышей была взята кровь, использованная для иммуноферментного анализана антитела, специфичные для антигена . Получены следующие результаты. 12 Сравнительное исследование. Вакцины. Полностью жидкую вакцину (Квинваксем (, доза 0,5 мл которой содержит 30 дифтерийного токсина,60 столбнячного токсина, 4( 952 ) инактивированного . , 10 мкг поверхностного антигена вируса гепатита Ви 10 мг олигосахарида , конъюгированного с 197,получали описанным ниже способом. В качестве вакцины сравнения с -использовали вакцину . Доза 0,5 мл вакцинысодержит 30 дифтерийного токсина,60 столбнячного токсина,4( 952 ) инактивированного . , 10 мкг поверхностного антигена вируса гепатита Ви 10 мг олигосахарида , конъюгированного с 197. В качестве контрольной вакцины против гепатитаиспользовали вакцину -. Доза 0,5 мл вакцинысодержит 10 мкг очищенного . Антигены ,и , содержащиеся в опытных партиях вакцини , использованных в этом исследовании, получали в одних и тех же лабораториях одинаковыми способами получения. Антиген , использованный в вакцине , был идентичным антигену в вакцине-. Исследуемая популяция. Младенцы, общим количеством 303 человека (132 девочки и 171 мальчика, средний возраст которых составлял 2,2 месяца), находились под наблюдением в течение четырех месяцев и были случайным образом распределены на группы, вакцинированные - (152) или -НерВ (151). Эти группы не имели никаких существенных демографических отличий. Вакцины вводили внутримышечно в переднелатеральный участок бедра в 2-, 3- и 4-месячном возрасте, при этом младенцы из группы с раздельным введением получали вакцину - в левое бедро, а вакцину гепатита- в правое бедро. Образцы крови брали у младенцев непосредственно перед первым введением и через месяц после третьей вакцинации. Серология. Данные, полученные от 299 младенцев (, 151 -,148), включенные в популяцию в соответствии с протоколом , использовали для первичного анализа иммуногенности (через месяц после третьей вакцинации). У четырех младенцев отсутствовали данные измерения титров после начала исследования, и они были исключены из анализа иммуногенности. Антитела копределяли, используя коммерчески доступный набор ( - ,). В качестве контроля использовали человеческую сыворотку, положительную по анти- антителам,откалиброванную при помощи стандартного препарата ВОЗ. Серопротекцию к вирусу гепатитаопределяли, используя уровень порога отсечки 10 мМЕ/мл анти- антител. Противодифтерийные и противостолбнячные антитела определяли, используя метод непрямой , при серопротекции, определенной в виде уровня титра 0,1 МЕ/мл. Титры как противодифтерийных, так и противостолбнячных антител 0,01 МЕ/мл обычно считаются положительными, однако в диапазоне титров 0,10,01 МЕ/мл корреляцияс тестами нейтрализациибыла снижена, что свидетельствовало о необходимости использования более консервативного предела 0,1 МЕ/мл. Для обнаруженияантител к .использовали , основанный на целых клетках. Также следовало установить зависимость защиты в отношении 13. , поэтому определяли сероконверсию в виде либо уровней титра 20 (ед.)/мл, либо в виде 4-кратного увеличения уровней титра после вакцинации. Метод, который является специфическим для обнаружения антител к капсулярным полисахаридам .типа , был использован в качестве сравнительного . Пул сывороток с высоким уровнем титра служил в качестве внутреннего стандарта и был откалиброван относительно стандарта . Уровни серопротекции противопределяли для обоих уровней титра 0,15 мкг/мл и 1,0 мкг/мл. Иммуногенность. Было получено подтверждение, что вакцина является не менее эффективной по сравнению с раздельно вводимыми вакцинами -в отношении каждого антигена через месяц после третьей вакцинации. После завершения основного курса вакцинации уровни серопротекции против вируса гепатитасоставляли 94,7 и 99,3 для групп и -соответственно. Все, кроме одного индивидуума (-группа), имели защиту от дифтерии, и у всех младенцев были получены протективные титры антител против столбняка. Вакцина вызвала серопротекцию к .у 94,7 младенцев, при этом у 95,4 младенцев было достигнуто по меньшей мере 4-кратное увеличение тигров антител по сравнению базовой линией сероконверсия в группе -составляла 99,3 , при этом у 98,0 наблюдалось по меньшей мере 4-кратное увеличение титра. Уровни серопротекции ксоставляли 94,7 и 96,6 при титре анти-1,0 мкг/мл после трех доз. Безопасность. Процент младенцев, перенесших по меньшей мере одну реакцию на ,был аналогичным проценту младенцев в случае введения одиночной - вакцины(16,4 против 17,2 соответственно), при этом младенцев, перенесших локальные реакции при введении одиночнойвакцины, было меньше (11,9 ). Как правило, случаи ожидаемых локальных реакций при введении комбинированной вакцины были аналогичны случаям введения одиночной - вакцины все отличия были статистически незначимыми. Зарегистрированные симптомы чаще всего проявлялись в виде локальной реакции у 15,8 и 15,2(-) младенцев. Все локальные реакции проявлялись в течение двух дней после вакцинации. Отсутствовало значимое отличие в проценте младенцев, перенесших по меньшей мере одно системное побочное действие (18,4 против 19,9 -). Наиболее обычным системным побочным действием в обеих группах была повышенная температура (температура тела 38 С), зарегистрированная у 12,5 и 12,6(-) младенцев. Заключение. В заключение, полностью жидкая вакцина является хорошо переносимой и обладает такой же иммуногенностью, как и отдельно вводимые лицензированные вакцина -и вакцина против гепатита(-). Профиль иммуногенности вакцины аналогичен задокументированному профилю, соответствующему используемой в настоящее время комбинированной вакцине/. Следует понимать, что данное описание изобретения приводится только в качестве примера, и в него могут быть внесены модификации без изменения объема и сути изобретения. Источники информации 1. Биологические науки. - 1994. - Т. 22. - С. 353-360. 16782 1 2013.02.28 2../ .Раппуоли и др. Инициатива / Европейской комиссии, отчет экспертной комиссии . 3. Пичичеро. Североамериканский журнал клинической педиатрии. - 2000. - Т. 47. - С. 407-426. 4. Корбель. Развитие биологических стандартов. - 1994. - Т. 87. - С. 113-124. 5. Парадизо. Журнал Американской медицинской ассоциации. - Т. 268. - С. 1685. 6. Сесардик и др. Биологические науки. - 1999. - Т. 27. - С. 177-181. 7. Международная патентная заявка 93/24148. 8. Международная патентная заявка 97/00697. 9. Международная патентная заявка 96/37222. 10. Стерджесс и др. Вакцины. - 1999. - Т. 17. - С. 1169-1178 11. Нолан и др. Вакцины. - 1998. - Т. 16. - С. 2085-2089. 12. Нолан и др. Вакцины. - 2001. - Т. 19. - С. 2127-2137. 13. Международная патентная заявка 99/13906. 14. Европейская патентная заявка 0 414 374. 15. Европейская патентная заявка 0 198 474. 16. Европейская патентная заявка 0 304 578. 17. Международная патентная заявка 91/14703. 18. Европейская патентная заявка 0 511 855. 19. Стивене. Вакцины. - 1988. - Т. 6. - С. 299-303. 20. Вакцины / Под ред. Плоткина и Мортимера, 1988. 21. Вакцины / Под ред. Плоткина и Оренстейна, 1999. 22. Густафсон и др. Медицинский журнал Новой Англии. - 1996. - Т. 334. - С. 349-355. 23. Раппуоли и др. // Тенденции биотехнологии. - 1991. - Т. 9. - С. 232-238. 24. Раппуоли. Природа и медицина. - 1997. - Т. 3. - С. 374-376. 25. Линдберг. Вакцины. - Т. 17. -2. - 1999. - С. 28-36. 26. Баттери и Моксон. Журнал Лондонского королевского медицинского колледжа. 2000. -34. - С. 163-168. 27. Ахмад и Чапник. Североамериканские клинические исследования инфекционных болезней. - 1999. -13. - С. 113-33, . 28. Гольдблатт. Журнал медицинской микробиологии. - 1998. - Т. 47. - С. 563-567. 29. Европейский патент 0 477 508. 30. Патент США 5,306,492. 31. Патент 98/42721. 32. Дик и др. В сб. Конъюгатные вакцины / Под ред. Круза и др. - Базель Каргер,1989. - Т. 10. - С. 48-114. 33. Хермансон. Методики биоконъюгатов. - Сан-Диего Академик Пресс, 1996. 34. Информация об исследованиях, 453077. - 2002. 35. Андерсон. Иммунитет к инфекциям. - 1983. - Т. 39. -1. - С. 233-238. 36. Андерсон и др. Журнал клинических исследований. - 1983. - Т. 76. -1. - С. 5259. 37. Европейский патент 0372501. 38. Европейский патент 0378881. 39. Европейский патент 0427347. 40. Международный патент 93/17712. 41. Международный патент 94/03208. 42. Международный патент 98/58668. 43. Европейский патент ЕР-А-0471177. 44. Международный патент 00/56360. 45. Международный патент 91/01146. 15 16782 1 2013.02.28 46. Международный патент 00/61761. 47. Лиис и др. Вакцины. - 1996. - Т. 14. - С. 190-198. 48. Международный патент 95/08348. 49. Международная патентная заявка 98/42721. 50. Патент США 4,882,317. 51. Патент США 4,695,624. 52. Европейский патент 0 477 508. 53. Молекулярная иммунология. - 1985. -22. - С. 907-919. 54. Европейский патент 0208375. 55. Международный патент 00/10599. 56. Гивер и др. Медицинская микробиология и иммунология. - 1979. - Т. 165. - С. 171288. 57. Патент США 4,057,685. 58. Патенты США 4,673,574 4,761,283 4,808,700. 59. Патент США 4,459,286. 60. Патент США 4,965,338. 61. Патент США 4,663,160. 62. Патент США 4,761,283. 63. Патент США 4,356,170. 64. Канра и др. Турецкий журнал педиатрии. - 1999. - Т. 42. - С. 421-427. 65. Равенскрофт и др. Развитие биологических наук. - Базель, 2000. - Т. 103. - С. 35-47. 66. Геннаро. Ремингтон теория и практика фармакологии. 20-е издание, 2000. 67. Международная патентная заявка 99/24578. 68. Международная патентная заявка 99/36544. 69. Международная патентная заявка 99/57280. 70. Международная патентная заявка 00/22430. 71. Теттелин и др. Наука, 2000. - Т. 287. - С. 1809-1815. 72. Международная патентная заявка 96/29412. 73. Пиза и др. Наука, 2000. - Т. 287. - С. 1816-1820. 74. Международная патентная заявка 01/52885. 75. Бжун и др. Ланцет, 1991. - Т. 338. -8775. - С. 1093-1096. 76. Фукасава и др. Вакцины, 1999. - Т. 17. - С. 2951-2958. 77. Розенквист и др. Развитие биологических стандартов. - 1998. -92. - С. 323-333. 78. Костантино и др. Вакцина, 1992. - Т. 10. - С. 691-698. 79. Костантино и др. Вакцина, 1999. - Т. 17. - С. 1251-1263. 80. Международная патентная заявка /02/03191. 81. Ватсон. Инфекционные педиатрические заболевания, 2000. - Т. 19. - С. 331-332. 82. Рубин. Североамер. журнал клинической педиатрии, 2000. - Т. 47. - С. 269-285, . 83. Едржеяс. Обзор микробиологии и молекулярной биологии, 2001. - Т. 65. - С. 187207. 84. Белл. Инфекционные педиатрические заболевания, 2000. - Т. 19. - С. 187-1188. 85. Иварсон. Скандинавский журнал патологии, микробиологии и иммунологии, 1995. Т. 103. - С. 321-326. 86. Саттер и др. Североамер. журнал клинической педиатрии, 2000. - Т. 47. - С. 287308. 87. Зиммерман и Спан. Американский семейный врач, 1999. - Т. 59. - С. 113-118, 125126. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 18