Вакцина ассоциированная инактивированная для профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота и способ ее получения

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ КОЛИБАКТЕРИОЗА, САЛЬМОНЕЛЛЕЗА,КЛЕБСИЕЛЛЕЗА И ПРОТЕОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Ломако Юрий Васильевич Гусев Анатолий Алексеевич Опарина Ирина Владимировна Амосова Любовь Александровна Новикова Оксана Николаевна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(57) 1. Способ получения вакцины ассоциированной инактивированной для профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота, заключающийся в том, что получают инактивированные поверхностные антигены бактерийштамм КМИЭВ-В 115,штамм КМИЭВ-В 128,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38, для чего каждую из бактерий культивируют на агаре Хоттингера 1820 ч при температуре 36-38, суспензируют в 0,1-0,3 -ном растворе солянокислого гидроксиламина с 7,4-7,6 до концентрацийштамм КМИЭВ-В 115 иштамм КМИЭВ-В 128 - 10-15 млрд клеток/мл,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38 - 2030 млрд клеток/см 3, выдерживают суспензию каждой из бактерий 24-48 ч при температуре 20-25 С, 20-30 мин при температуре 60-65 С и 4-6 ч при температуре 4 С, центрифугируют при 5000-1000020-30 мин, отбирают надосадочные жидкости, содержащие поверхностные антигены бактерий, добавляют формалин до концентрации 0,4-0,5 и выдерживают 24-96 ч при температуре 37-56 С получают суспензии инактивированных бактерийштамм КМИЭВ В-132,штамм КМИЭВ-44 иштамм КМИЭВ-18, для чего каждую из бактерий культивируют на мясопептонном агаре 18-20 ч при 35-38 С, суспензируют в физиологическом растворе с рН 7,2-7,4 до концентрацийштамм КМИЭВ В-132 - 1,0 млрд клеток/см 3,штамм КМИЭВ-44 иштамм КМИЭВ-1818460 1 2014.08.30 0,6 млрд клеток/см 3, добавляют к суспензиям формалин до концентрации 0,4-0,5 и выдерживают 72-120 ч при 37-56 С смешивают в соотношении 11111111 надосадочные жидкости, содержащие инактивированные поверхностные антигены бактерийштамм КМИЭВ-В 115,штамм КМИЭВ-В 128,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38 и суспензии инактивированных бактерийштамм КМИЭВ В-132,штамм КМИЭВ-44 иштамм КМИЭВ-18,добавляют сапонин в количестве 2,0 мас. , гель гидроокиси алюминия в количестве 26,0 мас.в качестве адъюванта и перемешивают до сорбции антигенов на адъюванте. 2. Вакцина ассоциированная инактивированная для профилактики колибактериоза,сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота, полученная способом по п. 1, содержащая надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерийштамм КМИЭВ-В 115,штамм КМИЭВ-В 128,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38, суспензии в физиологическом растворе инактивированных бактерийштамм КМИЭВ В-132,штамм КМИЭВ-44,штамм КМИЭВ-18, гель гидроокиси алюминия в качестве адъюванта и сапонин в качестве иммуностимулятора при следующем соотношении компонентов, мас.надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерийштамм КМИЭВ-В 115 9,0 штамм КМИЭВ-В 128 9,0 штамм КМИЭВ-98 9,0 штамм КМИЭВ-39 А 9,0 штамм КМИЭВ-38 9,0 суспензии в физиологическом растворе инактивированных бактерийштамм КМИЭВ В-132 9,0 штамм КМИЭВ-44 9,0 штамм КМИЭВ-18 9,0 гель гидроокиси алюминия 26,0 сапонин 2,0. Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления вакцины и в ветеринарии для профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота. В ветеринарной микробиологии известна ассоциированная инактивированная вакцина против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей (вакцина ОКЗ), содержащая в качестве антигенов штаммы-антигены 19,22,14,24,,,0999,013888,0119, в качестве инактиванта - 0,4-0,5 -ный формалин, в качестве адъюванта - гель гидроокиси алюминия 1. Недостатком данной вакцины является то, что антигены штаммов сальмонелл и кишечной палочки представлены в виде цельной клетки, что повышает ее реактогенность, а также иммуногенность данной вакцины относительно невысокая. Известные способы получения вакцины не позволяют получить заявляемую вакцину ввиду того, что для ее изготовления используют бактериальные клетки штаммов в высокой концентрации, что уменьшает выход получаемого продукта, также антигены представлены цельной бактериальной клеткой, что повышает реактогенность препаратов, так 2 18460 1 2014.08.30 как цельная микробная клетка, кроме протективных антигенов, содержит большое количество балластных веществ, не участвующих в выработке специфического иммунитета. Так, известен способ получения ассоциированной вакцины для иммунотерапии заболеваний, таких как клебсиеллез, протеоз, колибактериоз, вызываемых условно-патогенными микроорганизмами, заключающийся в том, что штаммы 204,177,-100147 раздельно культивируют на плотных питательных средах, смывают и проводят экстракцию поверхностных протективных антигенов солянокислым гидроксиламином, а штаммы 1991, 1986 выращивают на плотных питательных средах, смывают дистиллированной водой, инактивируют ацетоном и подвергают трехкратной водной экстракции все полученные компоненты смешивают, разливают по ампулам и высушивают 2. Недостатком указанного способа является то, что вакцина не содержит адьюванта, а также используемые штаммы неспецифичны для крупного рогатого скота на территории Республики Беларусь. Задачей заявляемого изобретения является конструирование и получение высокоиммуногенной и слабореактогенной вакцины для профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота на основе поверхностных антигенов иммуногенных штаммов-антигенов кишечной палочки и сальмонелл, а также антигенов иммуногенных штаммов-антигенов клебсиеллы и протея, обеспечивающей надежную защиту от указанных заболеваний, а также разработка способа ее получения, повышающего выход продукции. Поставленная задача достигается тем, что способ получения вакцины ассоциированной инактивированной для профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота заключается в том, что получают инактивированные поверхностные антигены бактерийштамм КМИЭВ-В 115,штамм КМИЭВ-В 128,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38, для чего каждую из бактерий культивируют на агаре Хоттингера 18-20 ч при температуре 36-38 С, суспензируют в 0,10,3 -ном растворе солянокислого гидроксиламина с 7,4-7,6 до концентрацийштамм КМИЭВ-В 115 иштамм КМИЭВ-В 128 -10-15 млрд клеток/мл,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38 - 20-30 млрд клеток/мл, выдерживают суспензию каждой из бактерий 24-48 ч при температуре 20-25 С, 20-30 мин при 60-65 С и 4-6 ч при температуре 4 С, центрифугируют при 5000-1000020-30 мин, отбирают надосадочные жидкости, содержащие поверхностные антигены бактерий, добавляют формалин до концентрации 0,4-0,5 и выдерживают 24-96 ч при температуре 37-56 С получают суспензии инактивированных бактерийштамм КМИЭВ В-132,штамм КМИЭВ-44 иштамм КМИЭВ-18, для чего каждую из бактерий культивируют на мясопептонном агаре 18-20 ч при 35-38 С, суспензируют в физиологическом растворе с 7,2-7,4 до концентрацийштамм КМИЭВ В-132 - 1,0 млрд клеток/мл,штамм КМИЭВ-44 иштамм КМИЭВ-18 - 0,6 млрд клеток/мл, добавляют к суспензиям формалин до концентрации 0,4-0,5 и выдерживают 72-120 ч при 37-56 С смешивают в соотношении 11111111 надосадочные жидкости, содержащие инактивированные поверхностные антигены бактерийштамм КМИЭВ-В 115,штамм КМИЭВ-В 128,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38 и суспензии инактивированных бактерийштамм КМИЭВ В-132,штамм КМИЭВ-44 иштамм КМИЭВ-18, добавляют сапонин в количестве 2,0 мас. , гель гидроокиси алюминия в количестве 26,0 мас.в качестве адъюванта и перемешивают до сорбции антигенов на адъюванте. 3 18460 1 2014.08.30 Кроме того, вакцина ассоциированная инактивированная для профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота, полученная вышеуказанным способом, содержит надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерийштамм КМИЭВ-В 115,штамм КМИЭВ-В 128,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38, суспензии в физиологическом растворе инактивированных бактерийштамм КМИЭВ В-132,штамм КМИЭВ-44,штамм КМИЭВ-18, гель гидроокиси алюминия в качестве адъюванта и сапонин в качестве иммуностимулятора при следующем соотношении компонентов, мас.надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерийштамм КМИЭВ-В 115 9,0 штамм КМИЭВ-В 128 9,0 штамм КМИЭВ-98 9,0 штамм КМИЭВ-39 А 9,0 штамм КМИЭВ-38 9,0 суспензии в физиологическом растворе инактивированных бактерийштамм КМИЭВ В-132 9,0 штамм КМИЭВ-44 9,0 штамм КМИЭВ-18 9,0 гель гидроокиси алюминия 26,0 сапонин 2,0. Таким образом, включение в вакцину поверхностных антигенов бактерийштамм КМИЭВ-В 115,штамм КМИЭВ-В 128,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38, экстрагированных солянокислым гидроксиламином, и отделение бактериальных клеток позволяет получить слабореактогенный препарат, обладающий высокими протективными свойствами. Использование бактерийштамм КМИЭВ-В 115,штамм КМИЭВ-В 128,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А,штамм КМИЭВ-38,штамм КМИЭВ -132,штамм КМИЭВ 44 иштамм КМИЭВ-18, выделенных в хозяйствах республики, повышает иммунологическую эффективность вакцины, а также применение небольших концентраций бактериальных клеток 10-30 млрд/мл позволяет удешевить производство вакцины и повысить ее выход. В предлагаемой вакцине в качестве продуцента антигенов используют бактерииштамм КМИЭВ-В 115,штамм КМИЭВ-В 128,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А,штамм КМИЭВ-38, а также бактерииКМИЭВ штамм В-132,штамм КМИЭВ 44 иштамм КМИЭВ-18. Штамм бактерийКМИЭВ-В 115 - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Таксономическая принадлежность. Предложенный штамм бактерийКМИЭВ-В 115 - штамм-антиген отнесен к семейству , роду ,виду. Морфологические признаки. Подвижные, грамотрицательные палочки, спор и капсул не образуют. Культуральные признаки. На МПБ образует равномерное помутнение через 6-10 ч роста при 37 С, на МПА формирует выпуклые колонии в -форме диаметром 1-3 мм, беловатого цвета, голубоватые в проходящем свете, на ПЖА - диффузный рост. Биохимические признаки. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, маннит, ксилозу, сорбит, арабинозу, дульцит. 4 18460 1 2014.08.30 Антигенные признаки. Агглютинируется монорецепторными сальмонеллезными сыворотками - О 9, Н ,. Патогенность. Патогенен для белых мышей, 50 составляет 75 клеток при внутрибрюшинном заражении. Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 , от 2 до 10 С. Пример 1. Приготовление питательной среды для культивирования штамма-антигенаКМИЭВ-В 115. Штамм бактерийКМИЭВ-В 115 - штамм-антиген выращивают в бульоне Хоттингера, для приготовления которого перевар Хоттингера разводят дистиллированной водой до содержания азота 200 мг . К бульону добавляют 0,5 натрия хлорида и 1 пептона, доводятдо 7,4-7,6. Кипятят бульон на огне 30-40 мин в кастрюле с закрытой крышкой. При выкипании уровень жидкости доводят до первоначального. После окончательного установлениябульон кипятят вторично. После кипячения среду оставляют для отстаивания, после чего осторожно сливают с осадка и фильтруют через полотняный фильтр или 3-4 слоя фильтровальной бумаги. Осадок на фильтре не выливают. Разливать бульон сразу не рекомендуется. За время хранения он хорошо отстаивается. По мере надобности бульон фильтруют, разливают по пробиркам. Бульон и агар Хоттингера стерилизуют 30 мин при давлении 1 атм. После стерилизации окончательно проверяют . Заявленный штамм бактерийКМИЭВ-В 115 - штамм-антиген выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь от коровы, больной сальмонеллезом, и является специфичным для сельскохозяйственных животных Республики Беларусь, что позволяет создать эффективную вакцину для профилактики сальмонеллеза в республике. Штамм бактерийКМИЭВ-В 128 - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Таксономическая принадлежность. Предложенный штамм бактерийКМИЭВ-В 128 - штамм-антиген отнесен к семейству , к роду, виду. Морфологические признаки. Подвижные, грамотрицательные палочки, спор и капсул не образуют. Культуральные признаки. На МПБ образует равномерное помутнение через 6-10 ч роста при 37 С, на МПА формирует выпуклые колонии в -форме диаметром 1-3 мм, беловатого цвета, голубоватые в проходящем свете, на ПЖА - диффузный рост. Биохимические признаки. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, маннит, ксилозу, сорбит, арабинозу, дульцит Антигенные признаки. Агглютинируется монорецепторными сальмонеллезными сыворотками -4,, 1,2. Патогенность. Патогенен для белых мышей, 50 составляет 50 клеток при внутрибрюшинном заражении. Условия хранения. Штаммы хранятся в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 , от 2 до 10 С. Пример 2. Культивирование штамма-антигенаКМИЭВ-В 128. Штамм бактерийКМИЭВ-В 128 - штамм-антиген находится в лиофилизированном состоянии. Для культивирования ампулу вскрывают в асептических условиях, разводят 1 см 3 МПБ, затем аккуратно переливают в пробирку с МПБ и выращивают при температуре 36-38 С в течение 18-20 ч. 18460 1 2014.08.30 Заявленный штамм бактерийКМИЭВ-В 128 - штамм-антиген выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому является специфичным для крупного рогатого скота в пределах республики, его включение в вакцину против сальмонеллеза позволяет усилить ее специфичность и повысить эффективность профилактики сальмонеллеза. Штамм бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Таксономическая принадлежность.КМИЭВ-98 относится к 5-й группе факультативно-анаэробных грамотрицательных палочек, подгруппе 1 - семейство , роду , виду. Морфологические признаки. В мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культур, при окраске по Грамму бактерии имеют вид тонких коротких (0,2-0,72-4 мкм) грамотрицательных палочек. Подвижны. Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании. Культура на плотных питательных средах формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым более оптически плотным центром. На среде Эндо бактерии образуют колонии малинового цвета с металлическим блеском размером от 0,2 до 0,5 см с более интенсивно окрашенным центром. Биохимические признаки. В биохимическом отношении на средах, содержащих углеводы и многоатомные спирты, штамм ферментирует глюкозу, лактозу, маннит, сорбит,арабинозу, мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты,дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра. Антигенные признаки. Имеет в своем составе адгезивный антиген 41, -антиген, не типируемый коммерческим набором -колисывороток, содержит жгутиковый антиген. Патогенность, иммуногенность. ШтаммКМИЭВ-98 - штамм-антиген патогенен. 50 составляет 670 млн микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Иммуногенность штаммаКМИЭВ-98 составляет 100 , антигенность в РА-13,80,1412. Условия хранения. ШтаммКМИЭВ-98 - штамм-антиген хранится при температуре -2-10 С после лиофильного высушивания в ампулах в течение 2-3 лет, а также в течение 3-6 месяцев на 0,3 ПЖА под слоем стерильного вазелинового масла. Пример 3. Культивирование штамма-антигенаКМИЭВ-98 в биореакторе. Штамм бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген выращивают в течение 8-10 ч (не более 12 ч) при температуре 37 С скорости вращения мешалки в начале культивирования - 70, а в конце - 300 об/мин подаче стерильного воздуха в процессе всего периода культивации - 0,1 л/л среды. Через каждый час культивирования отбирают пробы микробной суспензии, определяют уровень накопления бактериальной массы (по оптическим стандартам мутности) и устанавливаютсреды. Понижениев растущей культуре до 7 и ниже регулируют подщелачиванием путем добавления 10 -ного растворадо 7,6-7,8. Через 2, 4, 6 ч от начала засева среду трижды обогащают раствором глюкозы из расчета 0,3 сухого вещества глюкозы на 1 л среды. Заявленный штамм бактерийКМИЭВ-98 - штамм-антиген выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому является специфичным для крупного рогатого скота в пределах республики, его включение в вакцину против колибактериоза позволяет усилить ее специфичность и повысить эффективность профилактики данного заболевания. 18460 1 2014.08.30 Штамм бактерийКМИЭВ В-132 - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Таксономическая принадлежность. Предложенный штамм бактерийКМИЭВ В-132 - штамм-антиген отнесен к семейству , к роду, виду. Морфологические признаки. Грамотрицательные, неподвижные, толстые палочки размером 1,06,0 мкм, спор не образуют, образуют капсулу. Культуральные признаки. На МПБ дает помутнение и образование осадка, поднимающегося при встряхивании в виде косички, при росте на МПА - крупные (4-5 мм), выпуклые, влажные, часто сливающиеся колонии слизистой консистенции, на агаре Эндо крупные влажные сливающиеся малиновые колонии с металлическим блеском. Биохимические признаки. Образует индол, расщепляет глюкозу, маннит, сахарозу,мочевину, утилизирует цитраты, дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра. Патогенность. Патогенен для белых мышей, 50 составляет 123 млн микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 , от 2 до 10 С. Пример 4. Приготовление среды Эндо для культивирования штамма-антигенаКМИЭВ В-132. Штамм-антигенКМИЭВ В-132 выращивали на среде Эндо следующего состава дистиллированная вода 1000,0 питательный агар, сухой 26,5 ЭКДА 1,22 фуксин основной 0,23 сахар молочный 10,7 динатрий фосфат 0,48 сульфит натрия безводный 0,83 натрий углекислый 0,03.7,20,2. Оптимальная температура инкубирования 37 С. Заявленный штамм бактерийКМИЭВ В-132 - штамм-антиген выделен в животноводческом хозяйстве Республики Беларусь и поэтому является специфичным для крупного рогатого скота в пределах республики, его включение в вакцину против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза позволяет усилить ее специфичность и повысить эффективность профилактики клебсиеллеза. Штамм бактерийКМИЭВ-39 А - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Морфологические признаки. Неподвижные, короткие (0,2-0,72-4 мкм), грамотрицательные палочки. Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании. На плотных питательных средах формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым более оптически плотным центром. На среде Эндо образует колонии красного цвета с металлическим блеском размером от 0,2 до 0,5 см с более интенсивно окрашенным центром. Биохимические признаки. Ферментирует глюкозу, лактозу, маннит, сорбит, арабинозу,мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты, дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра. 18460 1 2014.08.30 Антигенные признаки. Имеет в своем составе антиген 25, -антигены, не типируемые коммерческим набором -сывороток, -антиген. Патогенность. Патогенен для белых мышей, 50 составляет 840 млн микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 , от 2 до 10 С 3. Заявленный штамм бактерийКМИЭВ-39 А - штамм-антиген выделен в 1999 году из слизистой оболочки тонкого кишечника десятидневного больного колибактериозом теленка, принадлежавшего колхозу им. Карла Маркса Светлогорского района Гомельской области. В результате отбора и проведения исследований был селекционирован штаммКМИЭВ-39 А, отличающийся наличием в антигенной структуре адгезивного антигена 25, идентичного адгезивным антигенам возбудителей колибактериоза телят в Республике Беларусь. Штамм бактерийКМИЭВ-38 - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Морфологические признаки. Короткие (0,2-0,72-4 мкм), слабоподвижные, грамотрицательные палочки, спор и капсул не образуют. Культуральные признаки. Факультативный анаэроб. Растет в МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды и образованием на дне пробирки осадка, легко разбивающегося при встряхивании, на плотных питательных средах формирует круглые, блестящие, выпуклые колонии с приподнятым более оптически плотным центром. На среде Эндо образует колонии красного цвета с металлическим блеском размером от 0,2 до 0,5 см с более интенсивно окрашенным центром, на среде Минка колонии растут в - и -формах. При -формах наблюдаются ровные края, колонии выпуклые с точкой уплотнения в центре. Биохимические признаки. Ферментирует глюкозу, лактозу, маннит, сорбит, арабинозу,мальтозу, ксилозу, манозу, дульцит с образованием кислоты и газа, продуцирует индол, не образует сероводород, не разжижает желатину, не утилизирует цитраты, дает отрицательную реакцию Фогес-Проскауэра. Антигенные признаки. Имеет в своем составе антиген К 99, -антигены, не типируемые коммерческим набором -сывороток, -антиген. Патогенность. Патогенен для белых мышей, 50 составляет 840 млн микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 , от 2 до 10 С. Заявленный штамм бактерийКМИЭВ-38 - штамм-антиген выделен в 2000 году в колхозе им. Ленина Рогачевского района Гомельской области из фекалий одномесячного теленка, больного гастроэнтеритом. В результате отбора и проведения исследований был селекционирован штаммКМИЭВ-38, отличающийся наличием в антигенной структуре адгезивного антигена К 99 4. Штамм бактерийКМИЭВ-18 - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Морфологические признаки. Короткие, грамотрицательные палочки размером 0,2-0,72-4 мкм, спор и капсул не образуют. Культуральные признаки. Растет на МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды, иногда с образованием поверхностной пленки. Культуры на плотных питательных средах формируют круглые, сочные, блестящие, равномерно выпуклые колонии на среде Эндо образовывают колонии красного или малинового цвета с металлическим блеском. Биохимические признаки. Ферментируют глюкозу, лактозу, маннит, сорбит, арабинозу, мальтозу, ксилозу, манозу, галактозидазу и проявляют инертность в отношении адони 8 18460 1 2014.08.30 та, инозита, целлобиоза, оксидазы, продуцируют индол, не образуют сероводород, не разжижают желатин. Антигенные признаки. Имеет в антигенной структуре соматический антиген 18. Патогенность. Патогенен для белых мышей, 50 составляет 256 млн микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 , от 2 до 10 С. Заявленный штамм-антигенКМИЭВ-18 выделен из мозговой ткани теленка однодневного возраста, больного гастроэнтеритом, в 2001 году в колхозе им. Карла Маркса Воложинского района Минской области 5. Штамм бактерийКМИЭВ-44 - штамм-антиген обладает следующими свойствами. Морфологические признаки. Мелкие, грамотрицательные палочки (0,4-0,61-3 мкм),капсул и спор не образуют. Культуральные признаки. Растет на МПБ, в бульоне на основе перевара Хоттингера с интенсивным помутнением среды, с образованием поверхностной пленки. На МПА - характерный сливающийся рост без образования отдельных колоний, образование вуалеобразного налета. На средах с содержанием солей желчных кислот (среда Плоскирева,висмут-сульфит-агар, агар Мак-Конки) рост проявляется в -форме. На висмут-сульфитагаре через 48 ч культивирования колонии имеют грязно-коричневый цвет, а после их снятия на среде остается грязно-коричневая редукционная зона. Биохимические признаки. Не ферментирует лактозу, арабинозу, дульцит, не обладает декарбоксилазой лизина и дегидролазой аргинина, не утилизирует малонат, не сбраживает мальтозу и амигдалин и не образует индол. Патогенность. Патогенен для белых мышей, 50 составляет 195 млн микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 , от 2 до 10 С. ШтаммКМИЭВ-44 выделен в 2001 году в колхозе Гигант Бобруйского района Могилевской области из печеночной ткани теленка четырнадцатидневного возраста, больного гастроэнтеритом. Штамм получен путем посева на бульон на основе перевара Хоттингера с последующим выделением чистых культур, сбора коллекции штаммов и отбора из них активного в антигенном отношении штамма видаКМИЭВ-44, отличающийся тем, что он не сбраживает мальтозу и амигдалин и не образует индол 6. Штаммы депонированы и хранятся в музее культур микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского. В предлагаемой вакцине в качестве адъюванта используют гель гидроокиси алюминия, в качестве инактиванта - формалин, а в качестве иммуностимулятора - сапонин. Адъювант - вещество, неспецифически усиливающее иммунный ответ на антигены. Гидрат окиси алюминия - это минеральный адъювант, который наиболее часто используется при производстве вакцин. Он, как и другие минеральные адъюванты, стимулирует преимущественно гуморальный иммунитет, действуя на вспомогательные клетки и лимфоциты Тх 2. Иммуногенность антигенов, сорбированных на гидроокиси алюминия, повышается в сотни раз 7. Сапонин является мощным растительным иммуностимулятором. Наиболее активный препарат получают из южноамериканского дерева. Высокоочищенный сапонин обладает слабой токсичностью и способен усиливать действие Т-зависимых и Тнезависимых антигенов 8. Формалин - 37 -ный раствор формальдегида - широко применяется для инактивации различных видов микроорганизмов. Его инактивирующее действие возможно благодаря 9 18460 1 2014.08.30 высокой реакционной способности в отношении аминокислот и белков, нуклеотидов и нуклеиновых кислот 9. Способ получения вакцины ассоциированной инактивированной для профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота описан поэтапно согласно формуле изобретения (пример 5-8). Пример 5. Получение (экстрагирование) поверхностных антигенов бактерийштамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38. Бактерии выращивают на агаре Хоттингера при 36-38 С 18-20 ч, суспензируют 0,1-0,3 -ным раствором солянокислого гидроксиламина до концентрации 20-30 млрд/мл. Полученную суспензию выдерживают 24-48 ч при 20-25 С для экстрагирования поверхностных антигенов, после подвергают термической обработке 20-30 мин при температуре 60-65 С на водяной бане, охлаждают при 4 С не менее 4-6 ч и центрифугируют при 5000-1000020-30 мин, получают осадок и надосадок. В качестве источника антигенов используют надосадочную жидкость. Дополнительную инактивацию поверхностных антигенов проводят формалином в концентрации 0,4-0,5 при 37-56 С 24-96 ч. Пример 6. Получение (экстрагирование) поверхностных антигенов бактерийштамм КМИЭВ-В 115 иштамм КМИЭВ-В 128. Бактерии выращивают на агаре Хоттингера при 36-38 С 18-20 ч, суспензируют 0,1-0,3 -ным раствором солянокислого гидроксиламина до концентрации 10-15 млрд/мл. Полученную суспензию выдерживают 24-48 ч при 20-30 С для экстрагирования поверхностных антигенов, после подвергают термической обработке 20-30 мин при температуре 60-65 С на водяной бане, охлаждают при 4 С не менее 4-6 ч и центрифугируют при 5000-1000020-30 мин. В качестве источника антигенов используют надосадочную жидкость. Дополнительную инактивацию антигенов проводят формалином в концентрации 0,4-0,5 при 37-56 С 24-96 ч. Пример 7. Получение суспензий инактивированных бактерийштамм КМИЭВ В-132,штамм КМИЭВ-44 иштамм КМИЭВ-18. Штаммы-антигены выращивают на мясопептонном агаре при 35-38 С 18-20 ч. Бактериальные клетки смывают забуференным физиологическим раствором ( 7,2-7,4), доводят концентрацию микробных клеток до 1,0 млрд/мл для клебсиеллы и 0,6 млрд/мл для протея и кишечной палочки, инактивируют формалином в концентрации 0,4-0,5 при 37-56 С 72-120 ч. Пример 8. Приготовление вакцины ассоциированной инактивированной для профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота. Для приготовления вакцины используют поверхностные антигены бактерийштамм КМИЭВ-В 115,штамм КМИЭВ-В 128,штамм КМИЭВ-98,штамм КМИЭВ-39 А иштамм КМИЭВ-38, полученные согласно примерам 5 и 6, а также суспензии инактивированных бактерий штаммКМИЭВ В-132,штамм КМИЭВ-44,штамм КМИЭВ-18, полученные согласно примеру 7, адъювант гель гидроокиси алюминия и иммуностимулятор сапонин при следующем соотношении компонентов, мас.надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерийштамм КМИЭВ-В 115 9,0 штамм КМИЭВ-В 128 9,0 штамм КМИЭВ-98 9,0 штамм КМИЭВ-39 А 9,0 10 18460 1 2014.08.30 штамм КМИЭВ-38 9,0 суспензии в физиологическом растворе инактивированных бактерийштамм КМИЭВ В-132 9,0 штамм КМИЭВ 44 9,0 штамм КМИЭВ-18 9,0 гель гидроокиси алюминия 26,0 сапонин 2,0. Для получения однородной и стабильной вакцины поверхностные антигены, полученные согласно примерам 5 и 6, и суспензии инактивированных бактерий, полученные согласно примеру 7, смешивают в соотношении 11111111, добавляют иммуностимулятор в количестве 2,0 мас. , затем добавляют гель гидроокиси алюминия в количестве 26,0 мас.и тщательно перемешивают для того, чтобы произошла сорбция антигенов на адъюванте, причем перед сорбцией следят за тем, чтобысмеси антигенов, инактиванта и сапонина было 7,2-7,4. Пример 9. Контроль стерильности полученной вакцины. В посевах вакцины на питательные среды должен отсутствовать рост микроорганизмов. Материалы, инструменты и методы мясопептонный бульон (МПБ) ГОСТ 20 730-75 мясопептонный агар (МПА) по действующему НД среда Сабуро, ГФХ, вып. 2., стр. 193 среда Китт-Тароцци по НД термостат любой марки по НД пробирки стеклянные ГОСТ 25336-82 Е. Для проведения испытания на стерильность используют 5 единиц флаконов из выборки до получения объединенной пробы общим объемом 20 см 3. Посевы проводят в объеме 0,2 см в 2 пробирки с МПБ, МПА, средами Сабуро и Китт-Тароцци. Через двое суток из жидких питательных проводят пересев в объеме 0,2 см 3 на те же среды и в тех же объемах. Первичные посевы на среде Сабуро выдерживают при температуре 20-22 С, а на остальных средах - при температуре 36-38 С в течение 10 суток, вторичные - в течение 8 суток. Вакцина является стерильной, так как ни в одной из засеянных сред не наблюдается роста. Пример 10. Контроль безвредности и реактогенности вакцины ассоциированной инактивированной против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота. Безвредность вакцины определяли путем подкожного введения в область спины препарата 10-ти белым мышам массой 18-20 г в дозе 0,3 см 3. Наблюдение за животными вели в течение 10 дней. Все животные остались живы. Реактогенность вакцины устанавливали путем ее внутримышечного введения пяти клинически здоровым кроликам в дозе 5,0 см 3 с внутренней стороны бедра. Наблюдение за животными вели в течение 10 дней. В течение всего срока наблюдения общей реакции организма на введение препарата не установлено,на месте инъекции обнаружена небольшая гранулема. Пример 11. Способ применения вакцины ассоциированной инактивированной для профилактики колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протеоза крупного рогатого скота. Коровам вакцина вводится двукратно за 60-45 дней до отела внутримышечно в область шеи в дозе 2,0 мл/гол с интервалом 10-14 дней, телятам - двукратно на 20-25-й день после рождения внутримышечно в область шеи в дозе 1,0 мл/гол с интервалом 10-14 дней. 18460 1 2014.08.30 Источники информации 1. Бедоева, З.М. Тест-системы для иммунологического мониторинга и прогнозирования острых кишечных инфекций животных и усовершенствование средств специфической профилактики Автореф. дис.докт. биол. наук. - М., 2006. - 51 с. (прототип). 2. Патент 2083223, МПК 661 39/116, 39/02, 39/085,39/108, 1997. 3. Патент 10886, МПК 12 1/20, 2007. 4. Патент 10978, МПК 12 1/20, 2006. 5. Патент 10979, МПК 12 1/20, 2006. 6. Патент 10092, МПК 61 39/002, 2006. 7. Медуницин Н.В. Вакцинология. - М. Триада-Х, 1999. - С. 95. 8. Медуницин Н.В. Вакцинология. - М. Триада-Х, 1999. - С. 96. 9. Костина Т.И. К вопросу о механизмах химической инактивации микроорганизмов // ЖМЭИ. - 1981. -8. - С. 25-30. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 12