Вакцина инактивированная эмульгированная для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота и способ ее получения

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ВАКЦИНА ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬГИРОВАННАЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА И СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Амосова Любовь Александровна Ломако Юрий Васильевич Гусев Анатолий Алексеевич Опарина Ирина Владимировна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(57) 1. Способ получения вакцины инактивированной эмульгированной для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота, заключающийся в том, что получают надосадочные жидкости, содержащие инактивированные поверхностные антигены бактерий- штамм КМИЭВ-В 115 и- штамм КМИЭВ-В 128, для чего бактерии раздельно культивируют на агаре Хоттингера при температуре 36-38 С 1618 ч, смывают с агара раствором 0,1-0,3 -ного солянокислого гидроксиламина с 7,47,6, доводя их концентрации в смывах до 10-15 млрд. клеток/мл, выдерживают 24-48 ч при температуре 20-25 С, 20-30 мин при температуре 60-65 С и 4-6 ч при температуре 4 С,центрифугируют при 8000-1000020-30 мин, отбирают надосадочные жидкости, содержащие поверхностные антигены, добавляют формалин до концентрации 0,4-0,5 и выдерживают 24-96 ч при температуре 37-56 С, после чего смешивают надосадочные жидкости, содержащие инактивированные поверхностные антигены, в соотношении 11,добавляют 30-38 мас.смеси к масляному адъюванту 70 и гомогенизируют 5-7 мин при 3000-4000 об/мин. 2. Вакцина инактивированная эмульгированная для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота, полученная способом по п. 1, которая содержит надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерийштамм КМИЭВ-В 115 и- штамм КМИЭВ-В 128 и масляный адъювант 70 при следующем соотношении компонентов, мас.надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерий- штамм КМИЭВ-В 115 15,0-19,0- штамм КМИЭВ-В 128 15,0-19,0 масляный адъювант 70 62,0-70,0. 18470 1 2014.08.30 Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления вакцины и в ветеринарии для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота. Сальмонеллез крупного рогатого скота, как правило, вызывается серовариантами сальмонелламии, имеющими различную антигенную структуру. Поэтому в заявляемой вакцине присутствуют антигены указанных штаммов. Так, известна живая сальмонеллезная вакцина, содержащая живые аттенуированные иммуногенные вакцинные штаммы сальмонелл 3 и 6 1. Недостатком вакцины является то, что при определенных условиях (ослабление естественной резистентности организма) препарат может спровоцировать вспышку заболевания либо привести к тому, что привитое животное будет являться носителем сальмонеллеза. Так, известна вакцина формолквасцовая концентрированная для профилактики сальмонеллеза телят, представляющая собой жидкость желтоватого цвета с серо-белым осадком, содержащая инактивированные штаммы 373 и 371 2. Вакцина имеет недостаток, стельным коровам препарат вводят в объеме 10,0 см 3 подкожно,что создает трудности при использовании препарата в промышленном животноводстве. В ветеринарной микробиологии известна инактивированная эмульсин-вакцина для профилактики сальмонеллеза телят, включающая штаммы сальмонелл 1449 и 159, в качестве иммуностимулятора - взвесь клеток 2, в качестве адъюванта - маслоланолиновую смесь. Инактивация компонентов осуществляется 0,4-0,5 -ным формалином 3. Недостатком данной вакцины является то, что антигены штаммов сальмонелл представлены в виде цельной клетки, что повышает ее реактогенность. Известные способы получения вакцины не позволяют получить заявляемую вакцину ввиду того, что для ее изготовления используют бактериальные клетки штаммов в высокой концентрации, что уменьшает выход получаемого продукта, также антигены штаммов сальмонелл представлены цельной бактериальной клеткой, что повышает реактогенность препаратов. Так, известен способ приготовления инактивированной эмульсин-вакцины против сальмонеллеза телят, заключающийся в использовании штамма-антигена сальмонелл 1449 в объеме 285 мл, штамма-антигена 159 95 мл на физиологическом растворе, концентрация клеток штаммов 90 млрд/мл, инактиванта формалина в концентрации 0,4-0,5 , взвеси клеток 2 в объеме 95 мл на физиологическом растворе, содержащей 200 млрд. микробных клеток в 1 мл,адьюванта в соотношении 83-871713 4. Недостатком указанного способа является то, что при использовании данной концентрации бактериальных клеток (90 млрд./мл), невозможно получить высокий выход продукта, что повышает его стоимость. Задачей заявляемого изобретения является конструирование и получение высокоиммуногенной и слабореактогенной вакцины инактивированной для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота, обеспечивающей надежную защиту от указанного заболевания, а также разработка способа ее получения, повышающего выход продукции. Поставленная задача достигается тем, что способ получения вакцины инактивированной эмульгированной для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота заключается в том, что получают надосадочные жидкости, содержащие инактивированные поверхностные антигены бактерийштамм КМИЭВ-В 115 иштамм КМИЭВ-В 128, для чего бактерии раздельно культивируют на агаре Хоттингера при температуре 36-38 С 16-18 ч, смывают с агара раствором 0,1-0,3 -ного солянокислого гидроксиламина с 7,4-7,6, доводя их концентрации в смывах до 10-15 млрд. клеток/мл, выдерживают 24-48 ч при температуре 20-25 С, 20-30 мин при температуре 60-65 С и 4-6 ч при температуре 4 С, центрифугируют при 8000-100020-30 мин, отби 2 18470 1 2014.08.30 рают надосадочные жидкости, содержащие поверхностные антигены, добавляют формалин до концентрации 0,4-0,5 и выдерживают 24-96 ч при температуре 37-56 С, после чего смешивают надосадочные жидкости, содержащие инактивированные поверхностные антигены, в соотношении 11, добавляют 30-38 мас.смеси к масляному адъюванту 70 и гомогенизируют 5-7 мин при 3000-4000 об/мин. Кроме того, вакцина инактивированная эмульгированная для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота, полученная вышеописанным способом, содержит надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерийштамм КМИЭВ-В 115 иштамм КМИЭВ-В 128 и масляный адъювант -70 при следующем соотношении компонентов, мас.надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерий- штамм КМИЭВ-В 115 15,0-19,0- штамм КМИЭВ-В 128 15,0-19,0 масляный адъювант -70 62,0-70,0. В предлагаемой вакцине в качестве продуцента антигенов используют штамм-антигенКМИЭВ-В 115 и штамм-антигенКМИЭВ-В 128. Таким образом, включение в вакцину поверхностных антигенов штаммов сальмонелл,взятых в соотношении 11, экстрагированных солянокислым гидроксиламином, и отделение бактериальных клеток путем центрифугирования позволяет получить слабореактогенный препарат, обладающий высокими протективными свойствами. Использование штаммов, выделенных в хозяйствах республики, повышает эффективность вакцины, а также применение небольших концентраций бактериальных клеток 10-15 млрд./мл позволяет удешевить производство вакцины. В заявляемой вакцине для инактивакции применяли формалин. Эффект инактивации основан на высокой реакционной способности в отношении аминокислот и белков, нуклеотидов и нуклеиновых кислот 5. В качестве адъюванта взят масляный адъювант -70 фирмы . Адъювантность обусловлена совместным проявлением нескольких механизмов предотвращением быстрого распространения антигена от места инъекции, его дренированием через лимфатические узлы, улучшением связи антигена с макрофагами и их активацией, стимуляцией и задержкой Т-лимфоцитов в лимфатических узлах 5. Пример 1. Приготовление вакцины инактивированной эмульгированной для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота. На первом этапе приготовления вакцины получают поверхностные антигены бактерий- штамм КМИЭВ-В 115 и- штамм КМИЭВ-В 128. Бактерииштамм КМИЭВ-В 115 и- штамм КМИЭВ-В 128 выращивают на агаре Хоттингера при 36-38 С 16-18 ч. Бактериальные клетки штаммов смывают с агара 0,1-0,3 -ным раствором солянокислого гидроксиламина 7,4-7,6, достигая концентрации бактериальных клеток 10-15 млрд./мл. Концентрацию определяют, используя . Полученную суспензию выдерживают 24-48 ч при 20-25 С для экстрагирования поверхностных антигенов, после подвергают термической обработке 20-30 мин при температуре 60-65 С на водяной бане, охлаждают при 4 С не менее 4-6 ч и центрифугируют при 8000-1000020-30 мин. В результате получают осадок бактериальных клеток и надосадок или декант, содержащий поверхностные антигены. Дополнительную инактивацию деканта проводят формалином в концентрации 0,4-0,5 при 37-56 С 24-96 ч. Для приготовления вакцины используют надосадочные жидкости, содержащие поверхностные антигены бактерийштамм КМИЭВ-В 115 и- штамм КМИЭВ-В 128, инактивированные формалином. Смешивают инактивированные антигены в соотношении 11, затем добавляют масляный адъювант -70. Для получения однородной стабильной эмульсии к масляному адъюванту постепенно добавляют инактивированные антигены при скорости гомогенизации (перемешивания) 3 18470 1 2014.08.30 3000-4000 об/мин. Гомогенизацию осуществляют в стерильной емкости объемом до 1,0 л,перемешивание осуществляют в течение 5-7 мин, используя гомогенизатор 600. В итоге полученная вышеописанным образом вакцина включает следующее соотношение компонентов, мас.надосадочные жидкости с инактивированными поверхностными антигенами бактерий- штамм КМИЭВ-В 115 15,0-19,0- штамм КМИЭВ-В 128 15,0-19,0 масляный адъювант -70 62,0-70,0. Пример 2. Контроль стерильности полученной вакцины. В посевах вакцины на питательные среды должен отсутствовать рост микроорганизмов. Материалы, инструменты и методы мясопептонный бульон (МПБ) ГОСТ 20 730-75 мясопептонный агар (МПА) по действующему НД среда Сабуро, ГФХ. Вып. 2. - С. 193 среда Китт-Тароцци по НД термостат любой марки по НД пробирки стеклянные ГОСТ 25336-82 Е. Для проведения испытания на стерильность используют 5 единиц флаконов из выборки до получения объединенной пробы общим объемом 20 см 3. Посевы проводят в объеме 0,2 см 3 в 2 пробирки с МПБ, МПА, средами Сабуро и КиттТароцци. Через двое суток из жидких питательных сред проводят пересев в объеме 0,2 см 3 на те же среды и в тех же объемах. Первичные посевы на среде Сабуро выдерживают при температуре 20-22 С, а на остальных средах - при температуре 36-38 С в течение 10 суток, вторичные - в течение 8 суток. Рост микроорганизмов на всех питательных средах должен отсутствовать. Пример 3. Контроль безвредности и реактогенности вакцины инактивированной для профилактики сальмонеллеза крупного рогатого скота. Безвредность вакцины определяли путем подкожного введения в область спины препарата 10 белым мышам массой 18-20 г в дозе 0,3 см 3. Наблюдение за животными вели в течение 10 дней. Все животные остались живы. Все иммунизированные животные оставались живыми и клинически здоровыми. Реактогенность вакцины устанавливали путем ее внутримышечного введения 5 клинически здоровым кроликам в дозе 5,0 см 3 с внутренней стороны бедра. Наблюдение за животными вели в течение 10 дней. У кроликов возможно образование олеогранулемы. Источники информации 1. Шустер Б.Ю., Малахов Ю.А., Кириллова В.В. Специфическая профилактика сальмонеллеза животных // Ветеринария. - 1994. -2. - С. 11-14. 2. Вакцина формолквасцовая концентрированная против сальмонеллеза телят. Каталог продукции, 2009. - С. 12. 3. Патент 2154495, МПК 61 39/112,12 1/20, 2000. 4. Патент 2154495, МПК 61 39/112,12 1/20, 2000. 5. Костина Г.И. К вопросу о химической инактивации микроорганизмов // ЖМЭИ. 1981. -8. - С. 25-30. 6. Шемельков Е.В., Федоров Ю.Н., Верховский О.А. Антигенная активность вакцины против инфекционных болезней свиней при включении в ее состав адьвантов // Сельскохозяйственная биология. - 2008. -4. - С. 101-105. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4