Пептид, способный модулировать пролиферацию клеток

ПЕПТИД, СПОСОБНЫЙ МОДУЛИРОВАТЬ ПРОЛИФЕРАЦИЮ КЛЕТОК(71) Заявитель ИММУНОТЕХ ДЕВЕЛОПМЕНТС ИНК.(72) Авторы Дейгин Владислав Исакович Коротков Андрей Марксович(73) Патентообладатель ИММУНОТЕХ ДЕВЕЛОПМЕНТС ИНК.(57) 1. Пептид общей формулы ,где Х представляет собой водород, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, -валин,пролин, тирозин, фенилаланин, триптофан, -аланин, -лейцин, -изолейцин, -валин,валин, -пролин, -тирозин, -фенилаланин, -триптофан, -аминомасляную кислоту или -аминокапроновую кислоту А представляет собой -глутаминовую кислоту или -глутаминовую кислоту ипредставляет собой глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, -валин, пролин,тирозин, фенилаланин, триптофан, -аланин, -лейцин, -изолейцин, -валин, -валин, -пролин, -тирозин, -фенилаланин, -триптофан, -аминомасляную кислоту,-аминокапроновую кислоту, гидроксил или амид, замещенный С 1-С 3-алкилом. 2. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что Х представляет собой водород, -аланин, -лейцин, -изолейцин, -валин, валин,-пролин, -тирозин, -фенилаланин или -триптофан ипредставляет собой -аланин, -лейцин, -изолейцин, -валин, валин, пролин, -тирозин, -фенилаланин, -триптофан, гидроксил или амид, замещенный С 1 С 3-алкилом. 3. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что Х представляет собой водород А представляет собой -глутаминовую кислоту ипредставляет собой гидроксил или амид, замещенный С 1-С 3-алкилом. 4. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что представляет собой последовательность . 5. Пептид по п. 1, отличающийся тем, что представляет собой последовательность . 7720 1 2006.02.28 6. Пептид по п. 1, обладающий способностью модулировать пролиферацию клеток. 7. Пептид общей формулы ,где Х представляет собой водород, глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, -валин,пролин, тирозин, фенилаланин, триптофан, -аланин, -лейцин, -изолейцин, -валин,валин, -пролин, -тирозин, -фенилаланин, -триптофан, -аминомасляную кислоту или -аминокапроновую кислоту А представляет собой -глутаминовую кислоту или -глутаминовую кислоту ипредставляет собой глицин, аланин, лейцин, изолейцин, валин, -валин, пролин,тирозин, фенилаланин, триптофан, -аланин, -лейцин, -изолейцин, -валин, -валин, -пролин, -тирозин, -фенилаланин, -триптофан, -аминомасляную кислоту,-аминокапроновую кислоту, гидроксил или амид, замещенный С 1-С 3-алкилом,обладающий способностью ингибировать пролиферацию клеток. Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ, обладающих иммунорегулирующими свойствами, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии. Предшествующий уровень техники. Актуальность разработки новых безвредных иммунорегулирующих пептидов, способных остановить прогрессирующий рост таких заболеваний, как злокачественные новообразования, сепсис, хронические и вялотекущие инфекции, развивающиеся на фоне иммунодефицитных состояний, подтверждается большим количеством исследований,проведенных в этой области. Наиболее распространенным способом выявления новых пептидов является выделение активных пептидных фракций из суммарных тканевых экстрактов, фракционированию и очистке вплоть до выделения индивидуального вещества и его идентификации 1600047,1638849,1737798. В практической медицине широко известны в качестве регуляторов иммунных процессов тимусные экстракты, в частности тимозин фракция 5,.,,,., тималин 659586. Эти экстракты состоят из комплекса веществ полипептидной природы и получение их из природных источников ограничено сложностью производства, малым выходом активных веществ и значительной вариабельностью их физико-химических характеристик и биологических свойств. Кроме того, из-за присутствия в природных препаратах тимуса балластных компонентов при их использовании у больных иногда возникают побочные явления. Последнее обстоятельство явилось стимулом для создания синтетических пептидных препаратов. В настоящее время осуществлен синтез ряда пептидов, обладающих иммунорегуляторными свойствами РСТ 089/06134,1541821,1518956, ЕР 230052, ЕР 406931,5021551,5013723. Каждый из полученных синтетических пептидов с ограниченным комплексом необходимых свойств обладает высокой активностью,низкой токсичностью, отсутствием побочных эффектов, которые определяют их возможное применение в медицине. Раскрытие изобретения. В основу изобретения положена задача создания нового синтетического биологически активного пептида, обладающего иммунорегулирующим свойством, формулы,где А - представляет собой - или- представляет собой водород, , , , , , , , , , , -,-. -. -, -, -, -, -, -, -аминомасляную кислоту или аминокапроновую кислоту 2 7720 1 2006.02.28- представляет собой , , , , , , , Т, , , -, -,-, -. -, -, -, -, -, -аминомасляную кислоту, -аминокапроновую кислоту, - или амид, замещенный С 1-С 3-алкилом. Целью изобретения было также создание принципиально нового технологического процесса получения вещества пептидной природы, который позволил бы при минимальном количестве и простоте стадий получать с высоким выходом продукт вышеприведенной формулы, что является определяющим при производстве фармацевтического препарата. Сущность нового способа состоит в синтезе глутамилсодержащих пептидов в растворе путем раскрытия внутреннего ангидрида третбутилокси-карбонил глутаминовой ( или ) кислоты соответствующим производным с последующим хроматографическим разделением - и -изомеров. Дальнейший синтез проводили путем наращивания пептидной цепи с помощью активированных эфиров третбутилоксикарбониламинокислот. Для ряда аналогов соединений пептида в табл. 1 приведены значения 1 в системе 0.34 Лучшие варианты осуществления изобретения. Изобретение иллюстрируется следующим примером. 4 и 1. Получение 14,7 (0.1 моля) растворяли 200 мм дистиллированной воды, одномолярным раствором КОН доводили рН до 10,2 и при интенсивном перемешивании добавляли раствор 33,0 г (0,3 моля) ВОС 2 О в диоксане. Следили за величиной рН на рН-стате. После окончания реакции смесь помещали в делительную воронку, экстрагировали из щелочной среды 3150 мм этилацетатом. Водную фазу медленно подкисляли 0,2 раствором серной кислоты до рН 3,0 и экстрагировали в органическую фазу (3 х 200 мм). Органический слой промывали 3200 мм насыщенным раствором 24 до нейтральной среды, сушили над 24. Упаривали в вакууме до маслообразного состояния. Выход 16,7 г (68 ). 2. Получение смеси и 16,7 г (0,068 моль) растворяли в 200 мл диметилформамида, охлаждали до 0 и при перемешивании добавляли раствор 20,6 г (0,1 моль) ,-дициклогексилкарбодиимида в 100 мл диметилформамида. Смесь перемешивали 4 ч при 4 С и оставляли на 8 ч при комнатной температуре. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, осадок промывали 250 мм диметилформамидом, фильтрат упаривали в вакууме до 1/2 объема и добавляли при охлаждении до 4 С и интенсивном перемешивании 24,3 (0,1 моль) . Раствор оставляли постепенно нагреваться до комнатной температуры. Об окончании реакции следили по ТСХ в системе (хлороформ этилацетат метанол 631) до исчезновения пятна внутреннего ангидрида кислоты. Остатки дициклогексил мочевины отфильтровывали, диметилформамид упаривали в вакууме. К маслообразному остатку добавляли 200 мм этилацетата и 200 мл 0.2 раствора серной кислоты. Органический слой отделяли, промывали до нейтральной среды насыщенным раствором 24, сушили над 24, этилацетатный раствор упаривали в вакууме. Полученный маслообразный осадок представлял собой смесь и . Общий выход масла составил 25.4 г (70 ). 3. Получение и 25,4 г (0,048 моля) смеси растворяли в 200 мл муравьиной кислоты, перемешивали при 40 С в течение 1 ч и упаривали в вакууме до маслообразного состояния. Разделение и очистку пептидов проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с Сефадексом в градиенте 0,01-0,2 М пиридинацетатного буфера. Выход 5.7 г (35 ) и 5,7 г (35 ) . В результате изучения физико-химических свойств пептида были получены следующие его характеристики Первичная структура- и Брутто формула - 162035 Молекулярный вес - 334.35 Внешний вид - белый с желтоватым оттенком или серый порошок. Растворимость - легко растворим в воде, умеренно в спирте, практически не растворим в хлороформе. У.Ф.- спектр в области 250-300 нм имеет максимум 2802 мм, плечо 2872 нм. Биологическая активность нового пептида изучалась на мышах линии /. Клетки селезенки мышей суспендировали в среде 1640 с 2 мм глутамина и 5 инактивированной фатальной сыворотки и вносили в плоскодонные планшеты в количестве 100 мкл. соответственно, 200.000 клеток на лунку. Исследуемый препарат вносили в начале культивирования. В качестве митогена использовали конканавалин А в конечной концентрации 2 мкг на лунку. Планшеты инкубировали при 37 С и 5 СО в течение 48 ч. Пролиферацию клеток оценивали по включению 3 Н-тимидина, вносимого за 24 ч до оконча 5 7720 1 2006.02.28 ния культивирования в дозе 5 мкг/мл с помощью сцинтилляционного счетчика, и выражали в количестве распадов в минуту (СРМ). Полученные результаты суммированы в табл. 2. Таблица 2 Препарат СРМ Доза препарата (мкг/мл) 5 10 63428 20043 2698 574 61467- среднее из трех определений. Установлено, что новый пептид обладает способностью ингибировать пролиферацию селезеночных клеток. С целью изучения безопасности пептида проводили изучение его острой токсичности. Изучение острой токсичности проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета РФ Требования к доклиническому изучению общетоксичного действия новых фармакологических веществ. - М., 1985. Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении 1000 кратной дозы пептид не оказывал острого токсичного действия, и при этих дозах оказалось невозможным достигнуть их 50. Тестирование синтезированных пептидов тимодепрессина. Новую серию пептидов тестировали,и в условиях, когда костный мозг подвергался облучению (1 ). Тимодепрессин и Тимодепрессин инъецировали мышам-донорам, 100 мкг/кг, в/в, за 48 ч до изъятия костного мозга. Костный мозг инкубировали в присутствии пептидов (0.02 мкг/мл суспензии) в течение 60 мин при 37 С, а затем, без предварительной промывки, инъецировали летально облученным реципиентам. Суспензию костного мозга облучали (1 ), а затем инъецировали летально облученным реципиентам. Через двадцать-тридцать минут после инъецирования суспензии тем же самым реципиентам внутрибрюшинно инъецировали пептиды (100 мкг/кг). Колонии считали на 9-й день. В табл. 3 представлены данные по влиянию новых пептидов на гемопоэтические клетки-предшественники, при облучении (1 )и при инкубациив присутствии костного мозга. Таблица 3 Влияние пептидов на колониеобразование (1) при облучении костного мозга ех(1 )(2) при их инъецировании донору ( ) (3) при инкубации костного мозгаГруппа КонтрольТимодепрессин Среднее число колоний 112,40,4 10,80,6 10,1 0,4 Все пептиды тимодепрессина обладали иммунорегуляторными свойствами. 6 7720 1 2006.02.28 Как с очевидностью следует из данных, приведенных в табл. 3, все пептиды тимодепрессина обладают иммунорегуляторными свойствами. Действие пептидов из группы с присоединенным -аминокислотным остатком (, , ) приводит к восстановлению колониеобразующей способности костного мозга после его облучения (1 ). Исключение составляет трипептид е-тимодепрессин инъекция этого пептида способствовала уменьшению количества колоний, образуемых облученным костным мозгом. Что касается пептидов с присоединенным -аминокислотным остатком, было показано, что Тимодепрессин оказывает стимулирующее действие на популяцию коммитированных колониеобразующих клеток интактного костного мозга, также как и облученных (1 ) клеток костного мозга. Инкубирование суспензии в присутствии пептида приводит к снижению числа колоний по сравнению с таковым при действии тимодепрессина. Тимодепрессин и Тимодепрессин обладают сходными свойствами (исключение составляет случай, когда костный мозг подвергают облучению). Результаты исследования. По своему действию на популяцию колониеобразующих клеток селезенки (-) пептиды были разделены на следующие группы 1. -дипептиды 2. -трипептиды Изучались следующие свойства какое действие оказывают пептиды, инъецированные интактным донорам за 2 дня до извлечения костного мозга, на популяцию клеток 8 (8) влияние пре-инкубации костного мозга с пептидами на популяцию клеток 8(8-инкубация) влияние пептидов на восстановление колониеобразующей способности костного мозга, облученного (1 )(8-1 ) влияние пептидов на процент клеток -, находящихся в -фазе клеточного цикла в костном мозге интактных доноров (пептид инъецировали донору, и через 48 ч определяли процент клеток -, находящихся в -фазе клеточного цикла (-интакт.) влияние пептидов на процент клеток -, находящихся в -фазе клеточного цикла в костном мозге облученных (4 ) доноров (пролиферирующие -) (-4 ). Обозначенияотсутствие эффектаповышениеснижение Таблица 4-содержащие -дипептиды способствуют уменьшению популяции клеток - в костном мозге интактных доноров ингибированию колониеобразующей способности костного мозга, преинкубированного с пептидами снижению пролиферации - как в быстро пролиферирующем, так и в интактном костном мозге. Замена - на - не изменяет характеристических свойств -содержащих дипептидов. Связываниес -дипептидами (-) способствует появлению новых свойств способности увеличивать популяцию клеток 8 в интактном костном мозге и стимулировать их пролиферацию в то же время трипептиды способствуют снижению процентав -фазе клеточного цикла в пролиферирующем костном мозге. Связываниеилине изменяет характеристических свойств -дипептидов (-). Пояснения Свойства трипептида проверяли по его способности ингибировать хронический(заболевание трансплантат против хозяина) в тесте на спленомегалию. Гибридных мышей первого поколения (571)1 инъецировали мышиными селезеночными клетками 571, дважды, с 7-дневным интервалом. Инъекции пептидов(100 мкг/кг),(100 мкг/кг) и преднизолона (5 мг/кг) начинали делать после первой инъекции клеток селезенки и продолжали в течение 20 дней. На 21-й день мышей и их селезенки взвешивали и определяли степень спленомегалиии процент ингибирования спленомегалии . Таблица 6 Влияние пептида на развитие хронического 7 5,40,40,04 59 Преднизолон 7 5,40,7 59 Интактн. 5 4,00,2 Таким образом, как инъекции дипептида, так и инъекции трипептида вызывали значительное снижение степени спленомегалии, а следовательно, способствовали торможению хронического . Следует подчеркнуть, что оба пептида обладают весьма интересным свойством они повышают процент - в -фазе клеточного цикла в интактном костном мозге, а в пролиферирующем костном мозге снижают его (табл. 6), т.е. они могут служить модуляторами пролиферации. Это предположение, однако, следует тщательно проверить на различных клеточных популяциях. Таблица 7 Влияние пептидов на процент - в -фазе клеточного цикла в интактном и в пролиферирующем (последующее облучение, 4 ) костном мозге Пептид- в -фазе в интактном- в -фазе в пролиферикостном мозге рующем костном мозге Контроль 9,1 4 66,2 7720 1 2006.02.28 Как показано методом проточной цитофлуориметрии, в костном мозге мышей, предварительно обработанных пептидомза 48 ч до анализа, процент клеток, несущих маркер 25 (показатель фактора роста -2), был увеличен (18.1 против 11.0 в контроле),а процент клеток, несущих маркер 69, являющийся показателем активации Т-лимфоцитов, был снижен (0.26 против 0.78 в контроле). Это предполагает, что пептид стимулирует клеточную пролиферацию и в то же время снижает число активированных Т-лимфоцитов. Далее, проверяли способность новых пептидов В- и усиливать образование колоний в селезенке, когда их инъецируют донору костного мозга за 48 ч до экстракции костного мозга. Было обнаружено, что оба пептида статистически значимо снижают количество колоний в костном мозге. Таблица 8 Пептид Счет колоний Контроль 10,40,5 7,20,60,0009-6,40,50,00006 Тестирование иммуносупрессивных свойствна модели локального . Мышам-реципиентам (1) инъецировали 20 млн. клеток селезенки мышей СВА под апоневротическую пластинку с тыльной стороны лапки (опытная задняя лапа) другую лапу (контрольная задняя лапа) инъецировали таким же количеством сингенных клеток.вводили реципиентам в дозе 100 мкг/кг, в/б, 4 раза, причем первую инъекцию производили через 1 ч после инъекции клеток селезенки, а затем ежедневно. Контрольные мыши получали физиологический раствор. На 6-й день извлекали подколенные лимфатические узлы, получали суспензии и собирали нуклеированные клетки. О тяжестисудили по соотношению между счетом клеток в лимфатических узлах опытной задней конечности к таковому в лимфатических узлах контрольной задней конечности (увеличение отношения . Наличиедостоверно определяли при 1.2. Как видно из данных, представленных в табл. 8, обработка реципиентовспособствует элиминации . Ни у одного из обработанных пептидом тестированных животныхне превысило 0.85, что указывает на отсутствие заболевания трансплантатпротив-хозяина Таблица 9 Влияниена манифестацию локальногоОбработка реципиента 6 Повышение соотношения между лимфатическими узламиКонтроль В этой тест-системевызывает супрессию развитияв значительно большей степени, чем . Комбинированное действиеи Неогена или Тимогена на образование колоний в селезенке. Постановка эксперимента была такой же, как и в предшествующем преднизолоновом тесте. Мышей-доноров инъецировали пептидом , 100 мкг/кг, в/б, за 48 ч до изъятия костного мозга. Неоген или Тимоген (10 мкг/кг, в/б) инъецировали летально облученным реципиентам за 30-40 мин до инъекции суспензии костного мозга. 9 7720 1 2006.02.28 Как видно из табл. 10, инъекции тимогена реципиентам статистически значимо снижали число колоний - доноров, обработанных пептидом . Неоген на этот параметр никоим влиял. Таким образом, при такой постановке эксперимента комбинированное действие пептидаи тимогена оказалось почти таким же, как и действие преднизолонатимогена. Таблица 10 Влияние комбинациии Неогена или Тимогена на образование колоний в селезенке Средний счет колоний 10.20.6 14,1 0.5 0.0001 14.2 0.7 0.0001 11.9 0.5 0.009- по сравнению с контролем /значимость вычислена против контроля- по сравнению с . / значимость вычислена противПромышленная применимость. Пептид, обладающий биологической активностью, может найти широкое применение в медицине и ветеринарии. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.