Бивалентная вакцина против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота, способ ее получения и способ ее применения

39/15, 39/295, 12 7/00 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ БИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО РИНОТРАХЕИТА И ВИРУСНОЙ ДИАРЕИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Красочко Петр Альбинович Ковалев Николай Андреевич Красочко Ирина АлександровнаЖидков Станислав АлександровичБелявская Татьяна Васильевна Колоницкая Елена ГригорьевнаНовиков Олег Георгиевич Грибко Станислав Михайлович Кашко Леонид Степанович(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Бивалентная вакцина против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота, включающая культуральную вируссодержащую жидкость аттенуированных штаммов инфекционного ринотрахеита и диареи крупного рогатого скота,отличающаяся тем, что она содержит вируссодержащие жидкости штаммовКМИЭВ-6 с инфекционным титром 5,0-5,5 ТЦД 50/мл и-КМИЭВ-7 с инфекционным титром 5,0-6,0 ТЦД 50/мл в соотношении 11 и дополнительно содержит пенициллин, стрептомицин и в качестве защитной среды - сахарозу, желатин и воду при следующем соотношении компонентов культуральная вируссодержащая жидкость, об.80,0-90,0 сахароза, об.5,0-7,5 желатин, об.2,5-5,0 вода дистиллированная, об.до 100 пенициллин, мкг/мл 100-150 стрептомицин, мкг/мл 100-150. 2. Способ получения бивалентной вакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота, отличающийся тем, что штаммы вируса инфекционного ринотрахеита КМИЭВ-6 с инфекционным титром 5,0-5,5 ТЦД 50/мл и вируса диареи крупного рогатого скота КМИЭВ-7 с инфекционным титром 5,0-6,0 ТЦД 50/мл выращивают на перевиваемой культуре клеток МДБК на 5 -ном гемогидролизате, полученные культуральные вируссодержащие жидкости штаммов смешивают в соотношении 5304 1 11, после чего добавляют защитную среду, состоящую из сахарозы, желатина и воды, пенициллин и стрептомицин. 3. Способ применения бивалентной вакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота, отличающийся тем, что вакцину вводят телятам интратрахеально в дозе 1-2 мл при инфекционном титре штаммов вируса инфекционного ринотрахеита КМИЭВ-6 и вируса диареи крупного рогатого скота КМИЭВ-7 5,0-5,5 ТЦД 50/мл, иммунизацию проводят двукратно с интервалом 21-28 дней.(56)0650734 1, 1995.3925544 , 1975.2059415 1, 1996. Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к области получения вакцин, и может быть использовано в профилактике вирусных респираторных инфекций телят. Известны моновакцины против инфекционного ринотрахеита 1 и вирусной диареи 2 крупного рогатого скота, которые изготовлены из аттенуированных штаммов ТК-А(ВИЭВ) и ВК-128. Накопление вирусов осуществляется на первично-трипсинизированных культурах клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) или тестикул бычка (ТБ) с использованием смеси питательных сред 0,5 -ного раствора лактальбумина гидролизата с 199. Иммунизация телят проводится путем интраназального и подкожного введения. Недостатками вышеуказанных вакцин является то, что культивирование вирусов проводится на первично-трипсинизированных культурах клеток, что затрудняет широкомасштабное изготовление из-за недостатка исходного материала (эмбрионов коровы или тестикул бычков). Кроме того, недостатком их применения являются различные пути введения вакцин - интраназальное (ИРТ) и подкожное (ВД), что приводит к затрудненному одновременному их использованию, а также удорожает профилактические обработки и вызывает дополнительное стрессирование телят. Также недостатком моновакцин при вакцинации одной из вакцин является создание иммунитета только против одного возбудителя,что ведет к снижению эффективности специфической профилактики вирусных инфекций. Задачей изобретения является разработка бивалентной вакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота, способа ее изготовления и применения. Поставленная задача достигается тем, что для конструирования вакцины использованы вирус инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота штамм КМИЭВ-6 с инфекционным титром 5,0-5,5 ТЦД 50/мл и вирус диареи крупного рогатого скота штамм КМИЭВ-7 с инфекционным титром 5,0-6,0 ТЦД 50/мл путем смешивания монокомпонентов в соотношении 11. Известен способ получения вакцин против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота. Для этого накопление вируссодержащей жидкости осуществляется на первичных культурах клеток почки эмбриона коровы (ПЭК) или тестикул бычка (ТБ) с культивированием их на питательных средах 199 и 0,5 -ном лактальбумина гидролизате 1, 2. В способе получения бивалентной вакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота накопление вируссодержащей жидкости осуществляется на перевиваемой культуре клеток МДБК, а в качестве питательной среды используется 5 -ный гемогидролизат на раствор Хэнкса. Известны способы применения вакцин против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота путем их интраназального или подкожного применения 1, 2. 2 5304 1 Однако недостатком применения данных вакцин является то, что при интраназальном их использовании вакцина недостаточно орошает слизистую оболочку верхних дыхательных путей и местный иммунитет имеет низкую напряженность, а подкожное введение вакцин не создает местный иммунитет и эффективность использования вакцин значительно снижается. Указанный недостаток устраняется тем, что вакцина вводится интратрахеально, что позволяет в значительной степени повысить контакт вакцинных штаммов со слизистой оболочкой и создать напряженный местный иммунитет. Пример 1. Накопление вируссодержащей жидкости вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота проводят на культуре перевиваемых клеток МДБК, выращенной на питательной среде - 5 -ном гемогидролизате с добавлением 10 сыворотки крови крупного рогатого скота. Заражение клеточного монослоя производят путем внесения расплодки маточной культуры вирусов не более 15 пассажа. При этом вирусы инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота культивируют отдельно. После 1,5-2-часового контакта вносят поддерживающую среду - 5 -ный гемогидролизат. ЦПД вирусов проявляется через 24-48 часов. После поражения свыше 75 клеток на матрасах с зараженным монослоем их подвергают замораживанию с последующим титрованием. Бивалентная вирусвакцина против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота готовится путем объединения в соотношении 11 монокомпонентов с инфекционным титром 5,5-6,0 ТЦД 50/мл. В дальнейшем вакцина хранится в замороженном состоянии при -10-25 С или лиофильно высушивается с среде следующего состава смесь вирусов инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи 80-90 крупного рогатого скота в соотношении 11, об.сахароза, об.5,0-7,5 желатин, об.2,5-5,0 пенициллин, мкг/мл 100,0-150 стрептомицин, мкг/мл 100,0-150 вода дистиллированная, об.до 100. Пример 2. Изучение оптимального соотношения монокомпонентов бивалентной вирусвакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота проводили на телятах. Для этого был проведен соответствующий опыт на 40 телятах, которых разделили на 8 групп по 5 голов в группе. Телята опытной группы 1 были иммунизированы бивалентной вирусвакциной при соотношении монокомпонентов ИРТВД - 11 (инфекционный титр каждого из монокомпонентов 5,5-6,0 ТЦД 50/мл) в дозе 2 мл интратрахеально двукратно с интервалом в 21 день. Телята опытной группы 2 - при соотношении компонентов ИРТВД - 21 в дозе 2 мл (инфекционный титр вирусов, кратность введения те же, что в группу 1). Телят опытной группы 3 иммунизировали в соотношении 31 в дозе 2 мл животных группы 4 - ИРТВД - 12 группы 5 - 13 группы 6 - моновакциной против ИРТ в дозе 2 мл при инфекционном титре вакцинного вируса 5,5-6,0 ТЦД 50/мл интратрахеально двукратно с интервалом в 21 день группы 7 - моновакциной против ВД в дозе 2 мл при инфекционном титре вакцинного вируса 5,5-6,0 ТЦД 50/мл интратрахеально двукратно с интервалом в 21 день. 8 группа - интактные животные (контроль). Для исследования у телят была взята кровь до иммунизации и через 10, 21, 30, 45 и 60 дней после иммунизации. В крови определяли титр антител в вирусам ИРТ и ВД крупного рогатого скота в РНГА. В табл. 1 представлены результаты изучения титров антител в зависимости от дозы монокомпонентов каждого из вирусов. 3 5304 1 Из представленных данных таблицы видно, что введение телятам бивалентной вакцины с различным соотношением монокомпонентов вызывает образование специфических антител. Так, при соотношении монокомпонентов ИРТВД - 11 уже начиная с 10-го дня наблюдения титры антител к вирусу ИРТ возрастали с 0,2 до 2,5 2 , а ВД - с 0,4 до 4,8 2. Титр поствакцинальных антител продолжал увеличиваться до 60-го дня наблюдения и составил соответственно 7,6 и 7,9 2. В группах, получавших различные соотношения монокомпонентов ИРТ и ВД, титр антител также увеличивался, но значительной разницы не было установлено. При этом уровень антител у телят 2-6 групп в изучаемые сроки был несколько ниже, чем у телят 1 группы. Разница между ними статистически недостоверна (Р 0,5). Таким образом, оптимальным соотношением монокомпонентов бивалентной вирусвакцины против ИРТ и ВД крупного рогатого скота является 11 при инфекционном титре вирусов 5,5,-6,0 ТЦД 50/мл. Пример 3. Напряженность иммунитета после введения телятам бивалентной вакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота проводили на телятах путем заражения иммунизированных телят эпизоотическими штаммами вирусов. Опыты проводились на 12 клинически здоровых телятах возрастом 2,5-3 месяца. При этом телят первой опытной группы в количестве 4-х голов иммунизировали вирусвакциной бивалентной живой культуральной против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота интратрахеальной в дозе 2 мл двукратно с интервалом в 21 день. Телят второй опытной группы в количестве 4-х голов заражали эпизоотическими штаммами вирусов инфекционного ринотрахеита (штамм 4016) и вирусной диареи(штамм ВЛУ 10). Четыре теленка служили контролем. Через 30 дней после второй иммунизации иммунизированных телят заразили эпизоотическими штаммами вирусов, за животными велось клиническое наблюдение с измерением температуры тела. Результаты изучения показали, что после первой вакцинации животные на 3-6 реагировали кратковременным повышением температуры тела на 0,2-0,5 С, аппетит сохранялся, отмечены незначительные слизистые истечения из носа. После второй вакцинации общее состояние было в пределах физиологической нормы. У телят, зараженных эпизоотическими штаммами вирусов ИРТ и ВД, отмечалось повышение температуры тела до 40,3-41,2 С в течение 4-6 дней. При серологическом исследовании сывороток крови в реакции нейтрализации (РН) и реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) у телят, привитых вирусвакциной бивалентной живой культуральной против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота, титры антител были приблизительно на одинаковом уровне (18-116 в РН и 132-164 в РНГА). У телят, зараженных эпизоотическими штаммами вирусов ИРТ и ВД, титры антител были несколько ниже - 14-18 в РН и 18-116 в РНГА. У контрольных телят титры антител были в пределах 0-12 в РН и 12-14 в РНГА. После контрольного заражения иммунизированные телята не заболели, температура тела была в пределах физиологической нормы. При серологическом исследовании титры антител у них повысились до 116-132 в РН и 164-1128 в РНГА. После завершения опыта зараженные и иммунизированные телята были убиты с целью изучения патологоанатомических изменений. При это установлено, что вакцинированные и затем зараженные телята в легких, на трахее, верхних дыхательных путях,внутренних органах патологических изменений не обнаружено. У зараженных эпизоотическими штаммами вирусов телят на верхушечных долях легких, трахее, половых органах отмечены воспалительные очаги, характерные для инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи. У контрольных незараженных телят на внутренних органах изменений не установлено. 4 5304 1 Пример 4. Иммунизация телят бивалентной вирусвакциной против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота сопровождается иммунологической перестройкой иммунной системы организма животных. Для этого были проведены исследования по изучению антигенной активности и иммунологической перестройки организма телят после иммунизации бивалентной вирусвакцины против ИРТ и ВД крупного рогатого скота при сравнении с моновакцинами против ИРТ и ВД. Соответствующие опыты проведены на 4-х опытных группах телят по 5-7 голов в группе. Телятам опытной группы 1 вводилась бивалентная вакцина против ИРТ и ВД КРС по 2 мл интратрахеально двукратно с интервалом в 21 день при инфекционных титрах вирусов по 5,5-6,0 ТЦД 50/мл. Телятам опытной группы 2 вводилась моновалентная вакцина против ИРТ в дозе 1 мл при инфекционном титре вируса 5,5-6,0 ТЦД 50/мл двукратно с интервалом в 21 день интратрахеально. Телятам опытной группы 3 вводилась моновалентная вакцина против ВД в дозе 1 мл при инфекционном титре вируса 5,56,0 ТЦД 50/мл двукратно с интервалом в 21 день интратрахеально. Для исследования была взята кровь до иммунизации, через 4, 10, 21, 30, 45 и 60 дней после иммунизации. В крови изучали титр антител в РНГА, антителаМ и-классов в ИФА, динамику иммуноглобулиновиМ-классов, антигенсвязывающих клеток, Т- и В-лимфоцитов,титр интерферона. В табл. 2 представлены результаты изучения динамики антител к вирусам инфекционного ринотрахеита и диареи в РНГА у опытных и контрольных животных. Из таблицы видно, что в результате иммунизации у телят происходило увеличение титров антител уже начиная с 10 дня. У контрольных животных отмечалось увеличение титров антител, однако он был значительно ниже, чем у иммунизированных животных. В табл. 3 представлены результаты исследования по изучению динамики антителМ и-класса к вирусам инфекционного ринотрахеита и диареи у телят, иммунизированных вышеуказанными вакцинами. Так, у телят, иммунизированных бивалентной и моновакцинами против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота, наиболее активно шел биосинтез антител, относящихся кМ-классу. На 10-й день после иммунизации их количество было максимальным. После этого отмечается перераспределение биосинтеза антителМ-класса на антитела-класса. В табл. 4 представлены результаты изучения динамики иммуноглобулиновМ и-классов в реакции Манчини после иммунизации телят бивалентной и моновакцинами против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что у телят после иммунизации различными вирусвакцинами отмечается значительный биосинтез иммуноглобулинов М-класса. Так, после вакцинации против ИРТ, ВД и ИРТВД иммуноглобулины М-класса увеличивались до 10 дня, а затем происходило их незначительное снижение. Хотя к концу наблюдения концентрация иммуноглобулинов М-класса была выше исходных данных. Концентрация иммуноглобулинов -класса также увеличивалась начиная с 4 дня и увеличение продолжалось до 42 дня наблюдения. У контрольных телят в биосинтезе иммуноглобулиновизначительных колебаний не отмечалось. В табл. 5 представлены результаты изучения динамики антигенсвязывающих клеток после иммунизации телят бивалентной и моновакцинами против ИРТ и ВД. В результате исследований установлено, что иммунизация телят вакцинами против ИРТ и ВД способствует значительной активизации клеточного иммунитета и увеличения количества клеток, имеющих рецепторы к антигенам вирусов инфекционного ринотрахеита и диареи. У контрольных телят также отмечено их увеличение, однако показатели содержания антигенсвязывающих клеток к вирусу диареи были значительно ниже. 5 5304 1 В табл. 6 представлены результаты динамики Т- и В-лимфоцитов после иммунизации телят бивалентной и моновакцинами против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота. Изучение динамики Т- и В-лимфоцитов у телят, иммунизированных бивалентной и моновакцинами против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота, показало, что наиболее активизировались Т-лимфоциты у телят, получавших все вакцины. Количество В-лимофцитов также после иммунизации повышалось, однако несколько в меньшей степени. В табл. 7 представлены результаты динамики интерферона, являющегося одним из основных показателей неспецифического гуморального иммунитета. Из таблицы видно, что вакцины против ИРТ и ВД обладают интерферогенной активностью. При иммунизации телят бивалентной и моновакцинами против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота возрастание интерферона продолжалось до 21 дня, а затем к 42 дню его титр снижался. Таким образом, проведенные исследования по изучению влияния бивалентной и моновакцин против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи крупного рогатого скота на клеточный и гуморальный иммунитет телят свидетельствует о их высокой антигенной и иммуногенной активности. Для подтверждения эффективности вакцины в производственных условиях послужило изучение ее профилактической эффективности. Для этого в ряде хозяйств (колхоз Острометчево Брестского района Брестской области и АПО Рассвет Кировского района Могилевской области) были проведены испытания бивалентной вакцины против инфекционного ринотрахеита и вирусной диареи. Результаты испытаний представлены в табл. 8. Как видно из таблицы, бивалентная вакцина против ИРТ и ВД обладает высокой профилактической эффективностью и может быть использована для широкого внедрения в животноводческих хозяйствах Республики Беларусь. Источники информации 1. Крюков Н.Н., Белкина Н.М., Семенихин А.Л. Получение модифицированного вируса ИРТ крупного рогатого скота и испытание его иммуногенных свойств // Бюлл. ВИЭВ. 1972. - В.14. - С. 5-8. 2. Жидков С.А. Вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота (характеристика возбудителя, диагностика и специфическая профилактика) Автореф.дис.д-ра вет.наук 16.00.03 / Всер.ин-т экс.ветеринарии. - М., 1994. - С. 45. Титры антител в сыворотках крови телят после иммунизации бивалентной вакциной с различным соотношением монокомпонентов 5304 1 Таблица 2 Изучение динамики антител к вирусам инфекционного ринотрахеита и диареи в РНГА при иммунизации моно- и бивалентной вакцинами Вакцины ИРТВД ИРТ ВД Контроль ИРТ ВД ИРТ ВД ИРТ ВД Титр антител вв после введения вакцин до иммуниза 10 дней 21 день 30 дней 45 дней ции 1,30,21 2,50,28 3,80,2 4,12,5 6,60,24 2,10,4 4,80,45 6,80,53 7,00,47 8,00,42 1,50,21 2,50,24 3,90,31 4,00,25 6,00,32 2,00,4 3,30,25 4,80,4 6,500,35 7,90,45 2,20,21 2,30,4 1,90,25 2,40,15 2,51,9 2,10,2 2,10,3 2,00,21 2,60,8 2,70,8 Таблица 3 Динамика антителМ и-классов у телят при иммунизации бивалентной и моновакцинами против ИРТ и ВД (Е) Дни после Принад иммуниза- лежность п/п ции антител 1. До иммуМ-класса низации ИРТВД ИРТВД Контроль Контроль ИРТ ВД ИРТ ВД 5304 1 Таблица 4 Динамика иммуноглобулинов М- и -классов при иммунизации телят бивалентной и моновакцинами против ИРТ и ВД (г/л) Дни после иммунизации Иммуног п/п Вакцины лобулин До иммуни- Через 4 дня Через 11 дней Через 21 день Через 28 дней Через 42 дня Через 65 дней зации 1. ИРТ М 5,680,13 6,60,8 5,960,17 6,00,17 6,20,17 5,380,15 6,80,13 14,340,24 14,90,21 14,60,11 14,20,41 15,10,47 14,60,21 14,60,21 Примечание достоверность Р 0,05 - жирный текст Р 0,05 - подчеркнутый текст Р 0,001 - курсив. Таблица 5 Динамика антигенсвязывающих клеток у телят при иммунизации бивалентной и моновакцинами против ИРТ и ВДп/п ИРТ ВД ИРТВД ИРТ ВД ИРТ ВД ИРТ ВД Количествоантигенсвязывающих клеток в дни после иммунизации До иммунизации 11 21 42 9,60,9 27,22,58 30,41,72 26,00,86 10,41,3 30,00,8 37,63,0 33,21,07 7,10,46 22,41,44 31,01,35 32,02,4 8,10,52 25,21,56 32,71,72 35,12,26 8,20,6 14,81,29 21,41,5 21,23,0 9,60,9 11,60,86 20,01,07 22,21,07 5304 1 Таблица 6 Динамика Т- и В-лимфоцитов у телят при иммунизации бивалентной и моновакцинами против ИРТ и ВДп/п 1. 2. 3. 4. Дни после Лимфоциты иммунизации До иммуниТ-лимфоциты зации В-лимфоциты 11 Т-лимфоциты В-лимфоциты 21 Т-лимфоциты В-лимфоциты 42 Т-лимфоциты В-лимфоциты Динамика интерферона у телят при иммунизации бивалентной и моновакцинами против ИРТ и ВД Примечание достоверность Р 0,05 - жирный текст Р 0,05 - подчеркнутый текст Р 0,001 - курсив. Таблица 8 Результаты производственных испытаний бивалентной вакцины против ИРТ и ВД Показатели Вакцинировано телят Заболело телят Колхоз Острометчево Единицы Опытная Контрольн. измерения группа группа АПО Рассвет Опытная Контрольн. группа группа Вынужденно убито и пало телят Профилактическая эффективность Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.