Штамм бактерии Pseudomonas fluorescens для получения препарата на основе бактериофагов против фитопатогенных бактерий рода Pseudomonas

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БАКТЕРИИДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ БАКТЕРИОФАГОВ ПРОТИВ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Рахуба Денис Викторович Новик Галина Ивановна Герасимович Александра Демьяновна Коломиец Эмилия Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Штамм бактерииБИМ В-582-Д для получения препарата на основе бактериофагов против фитопатогенных бактерий рода . Изобретение относится к биотехнологии, микробиологии и вирусологии и может быть использовано в сельском хозяйстве для производства биологических препаратов на основе бактериофагов фитопатогенных бактерий для использования в качестве средства борьбы с бактериозами культурных растений. Фитопатогенные бактерии родаявляются одними из наиболее широко распространенных в мире возбудителей бактериозов культурных растений. Микроорганизмы вида .вызывают заболевания большого количества дикорастущих и культурных растений, поражая надземные органы плодовых, зерновых, бахчевых и многих других хозяйственно ценных культур. Столь обширный круг растений-хозяев и связанная с этим возможность перекрестных заражений усложняют систему мер борьбы с бактериозами, вызываемыми бактериями .и . . Кроме того, бактерии данных видов обладают мощным защитным аппаратом, делающим их устойчивыми к действию многих химических соединений. Помимо этого, сложности, возникающие при борьбе с фитопатогенными бактериями, обусловлены тем, что микроорганизмы способны образовывать биопленки на поверхностях растений. Данный процесс сопровождается синтезом большого количества экзополисахаридов, которые одновременно выполняют структурную и защитную функции, а также в отдельных случаях служат хранилищем питательных веществ. При этом резко увеличивается резистентность бактерий в отношении химических пестицидов, дефицита питательного субстрата, а также повреждающих факторов окружающей среды - температуры, высыханию, ультрафиолетовому излучению и др. Использование биопрепаратов на основе бактериофагов в качестве профилактического и терапевтического средства борьбы с болезнями растений является перспективным,18709 1 2014.10.30 поскольку в структуре отростка бактериофагов обнаруживаются литические ферменты,которые способны деградировать экзополисахаридный матрикс биопленок и разрушать клеточную стенку самих бактерий. Благодаря этому вирус легко проникает внутрь клетки,размножается там, лизирует бактерию, выходит наружу и поражает соседние клетки. Ввиду специфичности воздействия бактериофагов исключительно на бактериальные клетки,можно избежать повреждающего действия на растения при применении подобных препаратов. Одной из важнейших задач, которую необходимо решать при разработке биопрепаратов на основе бактериофагов, является оптимизация процесса размножения бактериофагов в условиях производства. Поскольку вирусы бактерий являются облигатными внутриклеточными паразитами, то для решения этой задачи необходимо наличие бактериального штамма, обладающего определенными свойствами чувствительность к широкому спектру бактериофагов устойчивость к ряду антибактериальных антибиотиков (чтобы избежать контаминации чужеродными микроорганизмами в условиях производства и обеспечить стерильность конечного препарата) при лизисе бактериальной культуры должен достигаться высокий титр вируса в лизате высокая скорость роста бактериальной культуры низкая требовательность к условиям и среде культивирования высокая выживаемость при длительном хранении разными методами. Известны штаммы ..19, 6 и 3647, успешно используемые для выделения бактериофагов из природных источников 1. В описанной работе с использованием данных бактерий было выделено 25 бактериофаговых изолятов. Однако ни один из трех бактериальных штаммов не обеспечивал размножение всех выделенных бактериофагов. Кроме того, отсутствуют данные о скорости роста данных бактериальных штаммов, устойчивости к антибиотикам, требовательности к условиям культивирования и пр. Также известен штамм .27663, обеспечивающий высокую продуктивность при размножении бактериофага Ф 1 2. Однако не приведены данные относительно чувствительности данного штамма к другим видам бактериофагов. Целью данного изобретения является получение нового штамма, обладающего по сравнению с известными решениями свойствами, обеспечивающими его высокую технологичность при производстве препаратов на основе вирусов бактерий, а именно 1. Чувствительность к широкому спектру бактериофагов, потенциальных объектов для создания антибактериальных препаратов. 2. Устойчивость к антибиотикам для обеспечения стерильности производства. 3. Высокая скорость роста. 4. Высокая выживаемость при хранении с использованием современных методов(криоконсервация, лиофилизация). Новый штамм получен методом адаптивной селекции по резистентности к антибактериальным антибиотикам широкого спектра действия с последующей адаптацией к среде культивирования, содержащей антимикробные агенты в концентрации 10 мкг/мл. Селекция проводилась без использования химических и физических мутагенных факторов и генно-инженерных методов посредством длительной адаптации штамма к постепенно увеличивающимся концентрациям антибиотиков в среде культивирования. В качестве антимикробных агентов были взяты антибиотики нового поколения различной химической структуры 1. Кларитромицин (макролиды) блокирует биосинтез белков, связываясь с 50-субъединицей рибосом. 2. Азитромицин (азалиды) - угнетает пептидтранслоказу. 3. Ципрофлоксацин (хинолоны) - угнетает ДНК-гиразу, нарушая синтез ДНК. 4. Амоксициллин (пенициллины) - угнетает транспептид азу, вызывает лизис клетки. 2 18709 1 2014.10.30 Заявляемый штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (Научная коллекция типовых и промышленно-ценных непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси). Культурально-морфологические особенности штамма. БактерииБИМ В-582-Д представляют собой грамотрицательные, неспорообразующие, подвижные палочки. Имеют множественные полярно расположенные жгутики в качестве органоидов движения. При глубинном посеве в жидкую среду растут по всему объему культуры. При посеве последовательных разведений на чашки образуют желтоватые колонии среднего размера диаметром 3-6 мм. Штамм выращивают в жидкой среде на основе гидролизата кильки (панкреатический гидролизат кильки 10,05 г/л, хлорид натрия 4,95 г/л,7,40,2), а также на поверхности плотной питательной среды на основе гидролизата рыбной муки (панкреатический гидролизат рыбной муки 24,0 г/л, хлорид натрия 4,0 г/л,7,30,2) при 27 С в течение 16-20 ч в аэробных условиях. Физиолого-биохимические особенности штамма. ШтаммБИМ В-582-Д является облигатным аэробом, не способен размножаться в анаэробных условиях, дает положительную реакцию на оксидазу. Оптимальная температура культивирования 27 С, также способен расти в температурном диапазоне 16-32 С в диапазоне 6,8-7,6. Продуцирует термостабильные липазы и протеазы. Не расщепляет сахара. Штамм непатогенен, токсических метаболитов не образует. Изучение патогенности штамма проведено с использованием белых мышей массой 15-20 г, которых инфицировали взвесью микробных клеток в дозе 500 млн. м. к. внутрибрюшинно, и кроликов массой 2-3 кг, заражение которых проводили указанным материалом путем его внесения на скарифицированную кожу. Наблюдение за зараженными животными проводили в течение 15 суток. В указанный период времени не выявлено отклонений в их поведении, поедаемости корма, состоянии шерстного покрова, двигательной активности по сравнению с контрольными животными. С диагностической целью животные были подвергнуты убою. Патологоанатомическое исследование внутренних органов и тканей позволило констатировать отсутствие каких-либо аномалий и отклонений от нормы. В результате проведенных экспериментов установлено отсутствие патогенности у штаммаБИМ В-582-Д. Представленная культура микробов является непатогенной, лишена токсигенности. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами. Пример 1. АнтибиотикорезистентностьБИМ В-582-Д. Для получения антибиотикорезистентного штамма производили ряд последовательных пересевов бактерий с постепенным увеличением концентрации антибиотиков в среде культивирования от 2,5 до 10 мкг/мл. В случае полного ингибирования минимальной дозой антибиотиков осуществляли ряд последовательных пересевов культуры (до 10) в среду с концентрацией препарата 2,5 мкг/мл с целью адаптации штамма к минимальной концентрации, а затем начинали последовательно увеличивать концентрацию до 5, 7,5 и 10 мкг/мл. Далее штамм в течение длительного периода ежедневно пересевали в среды с максимальными концентрациями препаратов для закрепления признака антибиотикорезистентности. После многократных последовательных пересевов наблюдалось отсутствие ингибирования через 20-24 ч культивирования, что говорит о полной адаптации бактерий к максимальной концентрации препаратов. Пример 2. Чувствительность бактерий родак бактериофаговой инфекции. На газон испытываемого штамма наносят капли суспензии фаголизата с титром 108 БОЕ/мл. Чашки инкубируют сутки при 28 С, после чего исследуют на наличие лизиса. Используют 18 штаммов бактерий родаи 9 штаммов бактериофагов. 3- наличие зон полного лизиса- - отсутствие зон лизиса. Из представленных в табл. 1 данных видно, что среди исследованных штаммов только три культуры обладали чувствительностью ко всем бактериофагам .БИМ В 582-Д, .БИМ В-152 и Р.БИМ В-159. Пример 3. Скорость роста бактерий рода , чувствительных к бактериофагам. Бактериальную культуру вносят петлей в 50 мл свежей питательной среды, после чего инкубируют на качалке при 27 С при постоянном перемешивании. Каждый час отбирают равные аликвоты культуральной жидкости и измеряют оптическую плотность при 590 нм. О скорости роста судят по увеличению оптической плотности. Результаты, суммированные на фиг. 1, показывают, что из трех отобранных штаммов,чувствительных ко всем используемым бактериофагам, штамм .БИМ В-582 Д обладает наибольшей скоростью роста, что делает его наиболее удобным объектом для использования в производственных целях. Пример 4. Скорость лизиса бактериофагами бактерий рода . Бактерии культивируют на качалке при 27 С в течение 16 ч. Клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в свежей порции среды культивирования до достижения оптической плотности 0,5. Далее вносят вирус с множественностью заражения 0,5 и инкубируют на качалке при той же температуре. Каждые 10 мин отбирают по 2 мл культуральной жидкости и измеряют оптическую плотность при 590 нм. По снижению ОП судят о лизисе бактериальной культуры. Полученные результаты представлены на фиг. 2. Из представленных данных видно,что лизиз бактериальной культуры при инфицировании штамма .БИМ В-582-Д происходит быстрее, чем двух других отобранных штаммов. Исходя из этого можно сделать заключение, что с точки зрения оптимизации процесса размножения бактериофагов данный штамм предпочтительней к использованию в условиях производства. 4 18709 1 2014.10.30 Пример 5. Зависимость скорости размножения бактериофагов от возраста культуры. Бактерии культивируют на качалке при 27 С в течение 12, 24, 36 и 48 ч. Клетки осаждают центрифугированием и ресуспендируют в свежей порции среды культивирования до достижения оптической плотности 0,5. Далее вносят вирус с множественностью заражения 0,5 и инкубируют на качалке при той же температуре. Каждые 10 мин отбирают по 2 мл культуральной жидкости и измеряют оптическую плотность при 590 нм. По снижению ОП судят о лизисе бактериальной культуры. По окончании лизиса методом агаровых слоев определяют количество бактериофагов в образовавшемся лизате. Полученные результаты суммированы на фиг. 3 и в табл. 2. Из представленных данных следует, что наиболее оптимальным возрастом культуры для получения наиболее высокого титра бактериофагов а также для достижения наиболее быстрой скорости размножения бактериофага является 12-24 ч. Таблица 2 Титр фага (КОЕ/мл) Время-22 12 ч (7,432,58)109 (1,190,16)1011 (2,040,60)1010 (8,080,86)109 (3,751,76)109 24 ч (2,521,12)109 (2,500,39)1010 (5,511,67)109 (1,360,37)109 (2,000,89)109 36 ч (5,404,04)107 (4,791,87)109 (7,520,78)108 (6,382,94)108 (1,650,90)108 Пример 6. Зависимость скорости размножения бактериофагов от температурных параметров культивирования. Клетки .выращивают в течение 16-17 ч при температурах 23, 27 и 32 С при постоянном перемешивании. Далее клетки осаждают центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин и ресуспендируют в свежей порции среды культивирования до конечной оптической плотности 0,5. Концентрация бактерий при этом достигает 5-7108 КОЕ/мл. Далее в культуру вносят фаг с множественностью заражения 0,5 и инкубируют на качалке при тех же температурах, при которых культивировались бактерии. Каждые 10 мин отбирают по 2 мл культуральной жидкости и измеряют оптическую плотность при 590 нм. По снижению ОП судят о лизисе бактериальной культуры. По окончании лизиса методом агаровых слоев определяют количество бактериофагов в образовавшемся лизате. Результаты, полученные при исследовании влияния температуры на скорость лизиса культуры бактерий бактериофагами, суммированы на фиг. 4 и в табл. 3. Представленные данные свидетельствуют о том, что температура окружающей среды имеет значительное влияние на протекание вирусной инфекции в бактериальной клетке. Оптимальной температурой для культивирования бактерий .является 27 С. При данной температуре также наблюдалась самая высокая скорость лизиса бактерий и наиболее высокий титр бактериофагов в конечном лизате. Уменьшение температуры культивирования и инфицирования до 23 С приводило к уменьшению скорости лизиса, а также к уменьшению концентрации вирионов в фаголизате. При увеличении температуры до 32 С лизиса не происходило, а наблюдалось постепенное наращивание бактериальной биомассы. Таблица 3 9 Титр фага (КОЕ/мл), 10 Температура-22 23 С 2,270,47 4,850,61 3,190,58 5,700,70 2,690,66 27 С 4,331,12 6,350,75 5,300,98 7,801,23 4,320,78 Пример 7. Криоконсервация штамма .БИМ В-582-Д. Клетки .выращивают в течение 16-17 ч при температуре 27 С при постоянном перемешивании. Далее клетки осаждают центрифугированием при 3000 об/мин в те 5 18709 1 2014.10.30 чение 20 мин, после чего ресуспеидируют в стерильном растворе криопротектора, раскапывают по криопробиркам, охлаждают на ледяной бане до 0 С и замораживают в жидком азоте. В качестве криопротектора используют 10 сахарозу. Часть образцов оттаивают сразу же после заморозки и измеряют количество жизнеспособных клеток. Полученные показатели используются для оценки выживаемости клеток в результате действия физикохимических факторов в процессе замораживания, а также в качестве контроля для оценки выживаемости бактерий в процессе хранения. Оставшуюся часть клеток хранят при температуре - 80 С. Через 3 и 6 месяцев хранения определяют количество жизнеспособных клеток в замороженных образцах. При исследовании выживаемости бактерий непосредственно в процессе замораживания было показано, что при использовании 10 сахарозы в качестве криопротектора, а также сверхбыстрой скорости охлаждения, достигаемой при прямом погружении образцов в жидкий азот, выживаемость бактерий достигает уровня 94 . При дальнейшем хранении бактерий выживаемость после 3 и 6 месяцев хранения составила 95 и 84 соответственно(относительно контроля после замораживания). Суммарная потеря жизнеспособности клеток при консервировании в течение полугода, учитывая смертность клеток как на стадии замораживания, так и на стадии длительного хранения, не превышала 25 . Таким образом, полученный штамм обладает полным набором биотехнологических свойств, необходимых для использования в процессе производства препаратов на основе вирусов бактерий, а именно штамм обладает чувствительностью ко всем бактериофагам, которые могут быть использованы при создании препарата для лечения и профилактики бактериозов культурных растений штамм обладает антибиотикорезистентностью что позволяет обезопасить процесс производства от контаминации чужеродными микроорганизмами штамм обладает высокой скоростью роста и способен обеспечивать высокие темпы размножения бактериофагов штамм хорошо хранится при использовании метода криоконсервации. Источники информации 1.,,.//. - 2007. - . 61. - . 137-140. 2...Ф 1,//. . - 2004. . 241. - . 13-20. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9