Четвертичные аммониевые соли замещенных бифенилов, обладающие противомикробной активностью

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ЧЕТВЕРТИЧНЫЕ АММОНИЕВЫЕ СОЛИ ЗАМЕЩЕННЫХ БИФЕНИЛОВ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВОМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТЬЮ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт химии новых материалов Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Ольховик Вячеслав Константинович Матвеенко Юрий Вячеславович Василевский Дмитрий Александрович Калечиц Галина Викторовна Галиновский Николай Александрович Желдакова Римма Анатольевна Садрния Мариам Никитина Евгения Леонидовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт химии новых материалов Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Четвертичная аммониевая соль замещенного бифенила общей формулы 5 гдепредставляет собой , 1-6-алкокси, галоген или нитрогруппу 2 -или галоген 3 - 1-18-алкил, бензил или -22 обладающая противомикробной активностью. 2. Четвертичная аммониевая соль по п. 1, отличающаяся тем, что 2 представляет собой , 1 находится в положении 2 и представляет собой , 1-6-алкокси или галоген. 3. Четвертичная аммониевая соль по п. 2, отличающаяся тем, что 1 представляет собой , 3 - 817 или -22. 4. Четвертичная аммониевая соль по п. 2, отличающаяся тем, что 1 представляет собой 1-6-алкокси, 3 - 3, бензил, 817, 1837 или -22. 5. Четвертичная аммониевая соль по п. 2, отличающаяся тем, что 1 представляет собой фтор, 3 - 817 или -22. 6. Четвертичная аммониевая соль по п. 1, отличающаяся тем, что 1 находится в положении 2 и представляет собой фтор, 2 находится в положении 2 и представляет собой фтор, 3 - 817. 13645 1 2010.10.30 7. Четвертичная аммониевая соль по п. 1, отличающаяся тем, что 2 представляет собой , 1 находится в положении 3 и представляет собой нитрогруппу, 3 - 817 или-22. Изобретение относится к синтезу новых четвертичных аммониевых солей (ЧАС) замещенных бифенилов, обладающих противомикробной активностью, и может использоваться в медицине, промышленности и сельском хозяйстве. Наиболее близким и по структуре, и биологическому действию являются ЧАСы, содержащие в своей структуре незамещенный бифенил 1-6. Недостатком этих соединений является то, что они обладают ограниченным спектром действия на микроорганизмы и противомикробная активность их в отношении бактерий и дрожжей сравнительно невелика. Задачей изобретения является расширение спектра соединений, обладающих бактерицидным и/или бактериостатическим действием в действующих рабочих концентрациях для применения в клинической практике, промышленности, сельском хозяйстве в качестве дезинфицирующих средств. Поставленная задача достигается использованием предлагаемых четвертичных аммониевых солей замещенных бифенилов общей формулы 5 гдепредставляет собой -, 1-6-алкокси, галоген или нитрогруппу 2 -или галоген 3 - 1-18-алкил, бензил или -22 обладающие противомикробной активностью. Указанные соединения, их свойства и способ получения в литературе не описаны. Заявляемые четвертичные аммониевые соли бифенилов общей формулыполучают в результате взаимодействия замещенных по положению 2- или 2,2- или 3-бифенильного фрагмента 4,4-дихлорметилбифенилов с соответствующим ,-диметилалкиламином или,-диметилэтаноламином, или ,-диметилбензиламином в растворителе (этиловый спирт или ацетонитрил) при кипячении в течение 4-8 часов с последующим выделением заявляемых соединений известными приемами. Сущность изобретения иллюстрируется примерами.(А) Получение четвертичных аммониевых солей бифенилов общей формулы . Пример 1-(4-диметил(октил)аммонио)метил-2-гидрокси 1,1-бифенил-4-ил)-метил-,диметилоктиламмоний дихлорид (1). К 1,03 г (4 ммоль) 2-гидрокси-4,4 дихлорметилбифенила в 20 мл этанола прибавляют 1,57 г (10 ммоль) ,-диметилоктиламина. Кипятят 4-8 часов, контролируя ход реакции по ТСХ. Растворитель упаривают, остаток кипятят в 20 мл гексана в течение 20 минут, отфильтровывают, промывают гексаном. Повторяют обработку 2 раза, осадок высушивают в эксикаторе над 25. Получают 1,53 г (53 ) продукта (1). 13645 1 2010.10.30 бифенила в 50 мл сух. ацетонитрила и 1,57 г (10 ммоль) диметилоктиламина кипятят в течение 8 часов. Реакционную смесь упаривают, а остаток промывают дважды водой, гексаном и сушат в эксикаторе над 25, получают 2,24 г (94 ) соединения (5). Аналогично из 1,12 г (4 ммоль) 2-метокси-4,4-дихлорметилбифенила и 1,35 г (10 ммоль) диметилбензиламина получают 1,26 г (57 ) соединения (4). Аналогично пр.1 из 1,12 г (4 ммоль) 2-метокси-4,4-дихлорметилбифенила и 10 мл 33 раствора триметиламина получают 1,26 г (79 ) соединения (3). Пример 3-(4-диметил(октил)аммонио)метил-2-гексилокси 1,1-бифенил-4-ил)-метил-,диметилоктиламмоний дихлорид (6). Смесь 1,8 г 2-гексилокси-4,4-дихлорметилбифенила и 1,72 г диметилоктиламина в 50 мл ацетонитрила кипятят в течение 8 часов. Контроль по ТСХ. Реакционную смесь упаривают, а остаток кипятят с 30 мл гексана,фильтруют, промывают гексаном и сушат в эксикаторе над 25 и получают 2,2 г (63 ) соединения (6). Аналогично из 1,0 г 2-гексилокси-4,4-дихлорметилбифенила и 1,05 г додецилоктиламина получают 1,4 г (49 ) соединения (7). Аналогично из 1,0 г 2-гексилокси-4,4-дихлорметилбифенила и 0,5 г диметиламиноэтанола получают 0,95 г (61 ) соединения (8) в виде масла, которое при растирании кристаллизуется. Пример 4-(4-диметил(октил)аммонио)метил-2,2-дифтор 1,1-бифенил-4-ил)-метил-,диметилоктиламмоний дихлорид (11). Смесь 0,65 г 2,2-дифтор-4,4-дихлорметилбифенила и 0,4 г диметилоктиламина в 50 мл ацетонитрила кипятят в течение 5 часов. Продукт (11) выделяют аналогично примеру 3 и получают 0,88 г (65 ). Пример 6-(4-диметил(октил)аммонио)метил-3-нитро 1,1-бифенил-4-ил)-метил-,-диметил-октиламмоний дихлорид (12) получают аналогично пр.5. Из 1,19 г 3-нитро-4,4-дихлорметилбифенила и 1,57 г диметилоктиламина получают 1,78 г (73 ) продукта (12). Из 1,19 г 3-нитро-4,4-дихлорметилбифенила и 0,89 г диметилэтаноламина получают 1,31 г (69 ) продукта (13). ТСХ всех веществ проводили на пластинках-254 в системе толуол этилацетат в соотношении 51. ЧАС бифенилов (1-13) общей формулыпредставляли собой порошки белого, желтоватого или кремового цвета, хорошо растворимые в воде в концентрациях до 10 мг/мл. Структура, выход, протонный магнитный резонанс четвертичных аммониевых солей общей формулыпредставлены в табл. 1. Таблица 1 Структура, выход, протонный магнитный резонанс четвертичных аммониевых солей бифенилов общей формулы 5(Б) Методика проведения испытаний противомикробной активности 7. Пример 7 Изучение противомикробной активности заявленных четвертичных аммониевых солей бифенилов общей формулыпроводили на следующих штаммах бактерий из коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии Белорусского государственного 4 13645 1 2010.10.30 университета - грамотрицательные бактерии,01,,,103,100, грамположительные,,494,штаммах дрожжей из коллекции культур микроорганизмов Института микробиологии НАН Беларуси --154,,.,-147,-36,,-35,-29. Четвертичные аммониевые соли бифенилов общей формулырастворяли в стерильной дистиллированной воде и вносили в питательные среды для выращивания микроорганизмов до конечных концентраций от 500 до 5 мкг/мл. Для культивирования бактерий использовали жидкую питательную среду и полноценную питательную агаризованную среду ГРМ 1 - производства ГНЦ прикладной микробиологии г. Оболенск, Московской области, агаризованную глюкозо-солевую среду с добавлением 0,05 дрожжевого экстракта для бактерий. Для культивирования дрожжей дополнительно использовали питательную среду ГРМ 2 (среда Сабуро) производства ГНЦ прикладной микробиологии (г. Оболенск, Московской области) и минимальную агаризованную глюкозо-солевую среду с добавлением 0,05 дрожжевого экстракта. Определение противомикробной активности в жидкой питательной среде. В стерильные пробирки вносили питательную среду, содержащую исследуемое вещество в определенных концентрациях 200 100 50 25 12,5 и 6,25 мкг/мл. Посев бактерий проводили путем внесения 10 мкл суспензии в пробирки. Использовали ночные культуры бактерий, которые перед внесением разводили в 1000 раз физиологическим раствором. Пробирки инкубировали в термостате при 28 С. Учет результатов проводили через 48 часов. Определение противомикробного действия на полноценной питательной агаризованной среде ГРМ 1. На поверхность агаризованной среды в чашках Петри вносили путем накапывания 10 мкл исследуемых культур микроорганизмов. В качестве исходных культур использовали 24-часовые суспензии клеток, выращенные в жидкой полноценной среде при оптимальной для каждого штамма температуре (28 или 37 С). Перед накапыванием исходные суспензии разводили в 1 000 раз в физиологическом растворе. Чашки инкубировали в термостате и учитывали результаты через 24-48 часов инкубирования по наличию или отсутствию роста бактерий. Концентрации четвертичных аммониевых солей бифенилов общей формулыв агаризованной среде находились в диапазоне от 5 до 500 мкг/мл. Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) выражали в мкг/мл. Данные по противомикробной активности четвертичных аммониевых солей бифенилов общей формулыприведены в табл. 2. Таблица 2 МПК четвертичных аммониевых солей замещенных бифенила (1-13) в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий Минимальная ингибирующая концентрация веществ, мкг/мл 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 250 250 250 100 10 12,5 250 250 125 250 100 7. 250 250 10 10 5 12,5 250 12,5 12,5 12,58. 12,5 50 100 20 5 12,5 250 25 12,5 12,59.50 250 100 20 5 12,5 500 12,5 25 250494 10.250 250 10 5 5 250 12,5 12,5 12,5 125 Примечание 1) приведены данные трех независимых экспериментов 2) исследовался диапазон концентраций от 5 до 500 мкг/мл вещества в среде. 13645 1 2010.10.30 Из данных табл. 2 следует, что все соединения обладают антибактериальной активностью по отношению к проверенным бактериям в концентрации 5500 мкг/мл. Наиболее активными в отношении грамположительных бактерий (5-8) являются соединения 4, 5,8, 11 в диапазоне 512,5 мкг/мл. Пример 8 Определения противомикробной активности соединения 7 в зависимости от условий культивирования проводили по методике 4. Результаты определения противомикробной активности соединения 5 в зависимости от условий культивирования как состав питательной среды - полноценная или минимальная глюкозо-солевая жидкая или агаризованная - представлены в табл. 3. Таблица 3 Минимальные ингибирующие концентрации вещества 5 в различных по составу питательных средах Минимальная ингибирующая концентрация вещества, мкг/мл Штаммы бактерий МС ПС ПБ 1.6,3 12,5 6,3 2.01 100 100 100 3.100100 100 4.100 100 100 5.103 100 50 12,5 6.100 100 100 25 7.6,3 6,3 6,3 8.6,3 6,3 6,3 9.494 6,3 6,3 6,3 10.6,3 6,3 6,3 Примечание 1. Обозначения использованных сред МС - минимальная глюкозо-солевая с добавлением 0,05 дрожжевого экстракта ПС - полноценная агаризованная среда ПБ - питательный бульон. 2. Представлены усредненные данные трех независимых экспериментов. Грамположительные бактерии (5-8) проявляют одинаковую степень чувствительности к данному веществу независимо от состава среды, значения МИК для них составляют менее 6,3 мкг/мл. Для грамотрицательных бактерий (1-6) наблюдается разница в МИК. Для бактерийв ПС и МС МИК различаются в 2 раза. Тот же вывод очевиден и в отношении бактерийи. Пример 9 Определение характера действия вещества 5 при отмеченных МИК. Из пробирок с питательным бульоном с визуально отсутствующим ростом культур проводили высев на полноценную агаризованную среду. В случае гибели культуры, что фиксировалось по отсутствию формирования колоний, делали заключение о бактерицидном эффекте вещества при данной концентрации. При формировании отдельных колоний считали, что вещество действует бактериостатически. Результаты опытов приведены в табл. 4. 13645 1 2010.10.30 Таблица 4 Характер действия вещества 5 Концентрация (мкг/мл) и характер действия Штаммы бактерий вещества 5 1.6,3 бактерицидный 2.01 5.103 25 бактериостатический 6.100 12,5 бактерицидный 7.6,3 бактерицидный 8.6,3 бактерицидный 9.494 6,3 бактерицидный 10.6,3 бактерицидный Примечание- наличие роста при всех (от 100 мкг/мл) исследованных концентрациях Оказалось, что практически в 100 случаев действие веществ в определенных МИК носит бактерицидный характер. Исключением является бактериостатический характер действия данного вещества на бактерии 103. Пример 10 МИК веществ 3-5, 11 для штаммов дрожжей в различных условиях выращивания приведены в табл. 5. Таблица 5 Минимальная ингибирующая концентрация веществ для штаммов дрожжей в различных условиях выращивания Минимальная ингибирующая концентрация(мкг/мл) веществ 3-5,11 на среде Штаммы дрожжей 3 4 11 5 МС МС МС МС Сабуро-154 250 50 50 6,3 12,5250 500 250 100 50. 62,5 100 50 6,3 6,3- 147 250 100 100 6,3 25-36 500 100 50 12,5 50500 500 500 6,3 6,3-35 62,5 100 25 6,3 12,5-29 62,5 100 50 6,3 12,5 Примечание МС - минимальная среда Сабуро - полноценная среда Сабуро. Варьирование МИК на минимальной глюкозо-солевой среде с дрожжевым экстрактом и среде Сабуро (для соединения 5) является более выраженным и стабильно проявляется в отношении всех проверенных штаммов дрожжей (табл. 5). Полученные значения МИК различаются минимально в два раза, а в некоторых случаях и более. При этом отмечается та же общая тенденция на среде Сабуро ингибирующие рост концентрации являются более высокими. Таким образом, все заявляемые соединения на основании того, что ингибируют рост ряда грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также штаммов дрожжей,можно рассматривать как обладающие выраженной антимикробной активностью. Причем ряд соединений, например 5, обладают низкими значениями МИК в отношении бактерий, проявляя бактерицидный характер действия. Для большинства исследованных штам 8 13645 1 2010.10.30 мов грамотрицательных, а также всех грамположительных бактерий активность соединений сравнима с активностью такого известного антисептика, как хлоргексидин (ХГ). Антимикробная активность заявляемых соединений существенно не зависит от состава используемой питательной среды. Наиболее активными в отношении грамположительных бактерий являются соединения 3-5, 9-11. В отношении грамотрицательных бактерий к числу наиболее активных относятся соединения 5, 6, 9 и 11. Пример 11 Определение стабильности соединения 5. Водный раствор соединения 5 кипятили в течение 20 мин и проверяли активность в отношении всех штаммов бактерий и дрожжей. Во всех случаях МИК сохранялись в тех же пределах. Источники информации 1.2002/0061832 1. 2.2004- 203762 . 3.2004-331503 . 4.02/060856 1. 5.2004-331499 . 6.2004-331504 . 7. Красильников А.П. Справочник по антисептике.- Минск Высшая школа, 1995.367 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9