Способ обработки спермы осетровых рыб

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОБРАБОТКИ СПЕРМЫ ОСЕТРОВЫХ РЫБ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Плавский Виталий Юльянович Барулин Николай Валерьевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси(57) Способ обработки спермы осетровых рыб, отличающийся тем, что на сперму воздействуют поляризованным оптическим излучением с длиной волны 450-1270 нм, модулированным по интенсивности частотой 50-60 Гц при плотности мощности 0,5-100 мВт/см 2 в течение времени, обеспечивающего энергетическую дозу 60-180 мДж/см 2. Изобретение относится к рыбоводству, а именно к способам воспроизводства осетровых рыб, и может найти широкое применение как в технологии прудового, так и индустриального осетроводства. Известен способ обработки спермы рыб для ее стимуляции, основанный на воздействии на сперму перед оплодотворением лазерным излучением красной и/или инфракрасной спектральной области. Время экспозиции выбирают не менее 10 с при энергетической дозе 1 мДж/см 2-2,5 Дж/см 2 1. Как следует из описания 1, в аналоге в качестве источника излучения используется либо гелий-неоновый лазер красной области спектра с длиной волны 632,8 нм, работающий в непрерывном режиме, либо импульсный лазер Узор инфракрасной области спектра с длиной волны 890 нм. Недостатком известного способа является низкий стимулирующий эффект. Известен также способ обработки спермы рыб и животных 2, основанный на воздействии на сперматозоиды перед оплодотворением непрерывным оптическим излучением одного из источников белым светом светодиодного источника в спектральном диапазоне 400-800 нм при плотности мощности 40 мВт/см 2 в течение 1-15 мин 18585 1 2014.08.30 красным светом светодиодного источника с длиной волны 660 нм при плотности мощности 10 мВт/см 2 в течение 1-15 мин ультрафиолетовым излучением лампы с длиной волны 360 нм при плотности мощности 1,5 мВт/см 2 в течение 1-15 мин ультрафиолетовым излучением лампы с длиной волны 294 нм при плотности мощности 0,1 мВт/см 2 в течение 10-75 с. Недостатками известного способа являются ингибирование оплодотворяющей способности спермы при воздействии на сперматозоиды ультрафиолетового излучения. Во всем диапазоне воздействующих доз с длиной волны 294 или 360 нм наблюдается снижение ее активности по сравнению с контрольными (интактными) образцами, не подвергающимися действию излучения низкое стимулирующее действие на активность сперматозоидов непрерывного излучения видимой области спектра с длиной волны 660 нм (красный диапазон) или белого света в спектральном диапазоне 400 - 800 нм, а также необходимость длительного воздействия (5-10 мин) для получения оптимального стимулирующего эффекта, что снижает производительность процесса и увеличивает вероятность нарушения режима стерильности. Наиболее близким к заявляемому способу является способ обработки спермы для ее стимуляции, основанный на воздействии на сперматозоиды оптическим излучением в спектральном диапазоне 300-1000 нм при плотности мощности 1-1000 мВт/см 2 и времени воздействия 0,5-10 мин в непрерывном режиме 3. В качестве источника излучения в 3 используется любой нелазерный источник света (поляризованный или неполяризованный,монохроматический или полихроматический, когерентный или некогерентный) с указанными выше параметрами. Недостатком известного способа является низкий стимулирующий эффект, что позволяет лишь незначительно увеличить оплодотворяющую способность спермы по сравнению с контрольными (интактными) образцами, не подвергающимися световому воздействию. Задачей заявленного изобретения является повышение стимулирующего действия света на сперму рыб. Поставленная задача решается следующим образом. В способе обработки спермы осетровых рыб воздействие осуществляют модулированным по интенсивности излучением с длиной волны, расположенной в спектральном диапазоне от 450 до 1270 нм, частотой модуляции 50-60 Гц, плотностью мощности 0,5-100 мВт/см 2 в течение времени,обеспечивающего энергетическую дозу 60-180 мДж/см 2. Сущность предлагаемого способа заключается в том, что сперма осетровых рыб подвергается воздействию оптического излучения. Воздействие осуществляют модулированным по интенсивности поляризованным излучением лазерных или светодиодных источников в спектральном диапазоне от 450 до 1270 нм, плотностью мощности 0,5-100 мВт/см 2,частотой модуляции 50-60 Гц. Излучатель аппарата располагают таким образом, чтобы размер светового пятна соответствовал размеру слоя облучаемой спермы. Мощность излученияна выходе излучателя контролируют с помощью измерителя средней мощности ИМО-3 С. Плотность мощности (, мВт/см 2) излучения, воздействующего на слой спермы, определяют по формуле/, где- средняя мощность излучения в мВт- площадь светового пятна в см 2 на уровне слоя спермы. Энергетическую дозу (, мДж/см 2) определяют по формуле, где- время облучения в с. Отбор спермы осуществляют от самцов бестера 1 при помощи катетера и пластикового шприца Жане. Для стимулирования созревания применяют препарат нерестин 5-А в количестве 0,1 мл/кг. Средняя масса самцов составляет - 8,0 кг, средняя длина - 100 см. Средний объем эякулянта - 100 см 3. Температура воды в период взятия половых продуктов составляет 15,5 С. Вся отобранная сперма оценивается в 5 баллов по пятибалльной шкале Персова. 2 18585 1 2014.08.30 После воздействия на сперму оптическим излучением она помещается на хранение в прохладное затемненное место. Температура хранения не выше 4-5 С. По истечении 24 ч проводится определение времени активности сперматозоидов (время поступательного движения сперматозоидов после активации водой). Для определения активности пробу спермы (10 мкл) наносят на предметное стекло и при увеличении в 200 раз вначале исследуют без разбавления водой и определяют отсутствие (присутствие) примеси в пробах (форменные элементы крови, микроорганизмы и пр.). Затем наносят каплю воды на предметное стекло, перемешивают со спермой и на секундомере засекают начало активации сперматозоидов. При прекращении поступательного движения 90 сперматозоидов время останавливают. У каждой пробы время поступательного движения определяется не менее 3-х раз. По результатам полученных данных определяют величину стимулирующего действия физических факторов на время активности сперматозоидов(0/)100 , где 0 - время поступательного движения сперматозоидов после активации водой через 24 ч хранения после воздействия физических факторов (опытная группа),- время поступательного движения сперматозоидов после активации водой через 24 ч хранения без воздействия оптического излучения (контрольная группа). При этом увеличение (по сравнению с контролем) времени подвижности сперматозоидов в результате воздействия оптического излучения характеризует улучшение качества спермы, поскольку это приводит к более высокой вероятности успешного оплодотворения икры. И наоборот, снижение (по сравнению с контролем) времени подвижности сперматозоидов в результате воздействия оптического излучения отражает снижение качества спермы. Контрольные образцы икры выдерживают в тех же условиях, что и опытные образцы. Для статистической обработки данных вычисляют среднее значение и стандартную ошибку средней. Для определения нормальности распределения вычисляют медиану и процентили. В качестве границ нормы лабораторных показателей используют 5-й и 95-й процентили. Для проверки гипотезы о равенстве средних пользуются однофакторным дисперсионным анализом. Критическое значениеопределяют по зависимости внутригруппового числа степеней свободы от межгруппового. Для сравнения опытных групп с контрольной и определения уровня статистической значимости применяют метод множественного сравнения - критерий Даннета, основанный на критерии Стьюдента. Критическое значение и статистический уровень значимости определяют по зависимости числа степеней свободы от интервала сравнения. Для статистических расчетов используют пакеты компьютерных программи . Установлено, что воздействие на сперму самцов осетровых рыб модулированным оптическим излучением приводит к повышению активности сперматозоидов, что выражается в увеличении времени поступательного движения сперматозоидов после активации водой. Вышесказанное подтверждается данными, представленными в табл. 1-3. Из представленных данных следует, что воздействие непрерывного лазерного излучения в спектральном диапазоне от 450 до 1270 нм приводит к повышению качества половых продуктов, что проявляется в увеличении времени активности сперматозоидов после их активации водой. Увеличение длины волны воздействующего излучения свыше 1270 нм является нецелесообразным в связи с тем, что в области 1300 нм наблюдается поглощение излучения водой, что может приводить к термическому повреждению сперматозоидов. Использование излучения с длиной волны короче 450 нм является нецелесообразным,так как в этом случае стимулирующее действие слабо выражено и зачастую наблюдается ингибирование активности клеток спермы. Выполненные исследования (табл. 1-3) показали, что фотобиологическое действие на сперматозоиды зависит как от длины волны воздействующего излучения, так и от его плотности мощности, энергетической дозы и частоты модуляции. 3 18585 1 2014.08.30 Таблица 1 Влияние поляризованного оптического излучения с длиной волны 450 нм в различных энергетических дозах и режимах воздействия на время активности сперматозоидов самцов осетровых рыб Величина сти- СтатистичеВремя Плотность ЭнергетичеВремя Группы облуче- мощности, ская доза, , подвижно- мулирующего ский уровень ния, , с , мВт/см 2 мДж/см 2 сти, с действия, ,значимости,Контроль 0 0 0 1207,6 100 120 0,5 60 121,47,0 101,214,2 180 0,5 90 142,72,3 119,02,2 0,05 240 0,5 120 135,85,6 113,24,2 360 0,5 180 128,84,2 107,43,5 10 3,0 30 125,712,2 104,810,5 20 3,0 60 134,99,8 112,45,6 Непре 30 3,0 90 158,65,4 132,27,6 0,05 рывное 40 3,0 120 150,93,2 125,84,3 0,05 излучение 50 3,0 150 143,210,1 119,35,5 60 3,0 180 131,22,5 109,35,0 0,6 100 60 117,44,5 97,83,6 0,9 100 90 138,02,3 115,01,2 0,05 1,2 100 120 131,37,0 109,46,4 1,8 100 180 124,610,3 103,89,8 120 0,5 60 120,02,3 100,12,0 180 0,5 90 125,88,8 104,97,4 240 0,5 120 128,45,6 107,04,8 0,05 360 0,5 180 122,77,0 102,36,4 10 3,0 30 120,95,5 100,89,0 Излуче 20 3,0 60 133,412,3 111,212,4 0,05 ние, модулиро 30 3,0 90 139,810,4 116,510,1 ванное с 40 3,0 120 142,712,8 118,911,2 частотой 50 3,0 150 136,416,9 113,714,4 0,055 Гц 60 3,0 180 129,911,6 108,312,3 0,6 100 60 116,111,2 96,710,8 0,9 100 90 121,612,3 101,413,1 1,2 100 120 124,17,0 103,57,5 0,05 1,8 100 180 118,77,8 98,97,1 120 0,5 60 140,69,9 117,210,2 0,05 180 0,5 90 146,02,3 121,71,2 0,05 240 0,5 120 135,810,2 113,27,8 360 0,5 180 130,77,0 109,06,4 10 3,0 30 142,83,4 119,02,2 Излуче 20 3,0 60 156,31,1 130,33,3 ние, модулиро 30 3,0 90 162,32,3 135,31,3 0,05 ванное с 40 3,0 120 150,95,6 125,84,2 0,05 частотой 50 3,0 150 145,37,8 121,12,3 0,0550 Гц 60 3,0 180 140,14,5 116,84,3 0,6 100 60 136,015,5 113,312,2 0,9 100 90 141,25,6 117,74,5 1,2 100 120 131,32,3 109,42,6 1,8 100 180 126,47,8 105,36,8 4 18585 1 2014.08.30 Продолжение табл. 1 Время Плотность ЭнергетичеГруппы облуче- мощности, ская доза, ,ния, , с , мВт/см 2 мДж/см 2 120 0,5 60 180 0,5 90 240 0,5 120 360 0,5 180 10 3,0 30 Излуче 20 3,0 60 ние, модулиро 30 3,0 90 ванное с 40 3,0 120 частотой 50 3,0 15060 Гц 60 3,0 180 0,6 100 60 0,9 100 90 1,2 100 120 1,8 100 180 120 0,5 60 180 0,5 90 240 0,5 120 360 0,5 180 10 3,0 30 Излуче 20 3,0 60 ние, модулиро 30 3,0 90 ванное с 40 3,0 120 частотой 50 3,0 150100 Гц 60 3,0 180 0,6 100 60 0,9 100 90 1,2 100 120 1,8 100 180 Величина сти- СтатистичеВремя подвиж- мулирующего ский уровень ности, с действия, ,значимости,1355,6 112,55,2 143,75,5 119,85,0 0,05 132,613,5 110,612,5 126,314,5 105,314,9 138,71,7 115,61,0 150,02,3 125,02,4 159,73,3 133,13,8 0,05 147,411,2 122,810,5 140,47,0 117,06,4 137,22,2 114,32,1 130,53,3 108,82,8 138,92,3 115,81,2 0,05 128,27,0 106,96,4 122,17,5 101,87,0 133,06,6 110,96,2 137,64,8 114,74,2 0,05 134,05,6 111,75,2 126,07,0 105,06,4 138,512,0 115,410,8 147,85,0 123,24,6 0,05 152,912,3 127,414,3 0,05 148,910,1 124,19,5 0,05 140,08,9 116,77,6 139,37,5 116,14,6 0,05 128,63,3 107,22,5 133,01,5 110,91,9 129,511,0 108,010,5 121,87,0 101,55,5 18585 1 2014.08.30 Таблица 2 Влияние поляризованного оптического излучения с длиной волны 670 нм в различных энергетических дозах и режимах воздействия на время активности сперматозоидов самцов осетровых рыб Время Группы облучения, , с 10 20 Непре 30 рывное 40 излучение 50 60 10 Излуче 20 ние, модулиро 30 ванное с 40 частотой 505 Гц 60 120 180 240 360 10 Излуче 20 ние, модулиро 30 ванное с 40 частотой 5050 Гц 60 0,6 0,9 1,2 1,8 Излуче 30 ние, мо 120 дулиро 180 ванное с 240 частотой 36060 Гц 10 Излуче 20 ние, модулиро 30 ванное с 40 частотой 50100 Гц 60 18585 1 2014.08.30 Таблица 3 Влияние поляризованного оптического излучения с длиной волны 1270 нм в различных энергетических дозах и режимах воздействия на время активности сперматозоидов самцов осетровых рыб Время облучения, , с 10 20 Непре 30 рывное 40 излучение 50 60 10 Излуче 20 ние, модулиро 30 ванное с 40 частотой 505 Гц 60 120 180 240 360 10 Излуче 20 ние, модулиро 30 ванное с 40 частотой 5050 Гц 60 0,6 0,9 1,2 1,8 Излуче 60 ние, мо 0,6 дулиро 0,9 ванное с 1,2 частотой 1,860 Гц 10 Излуче 20 ние, мо 30 дулированное с 40 частотой 50100 Гц 60 Группы 18585 1 2014.08.30 Максимальное стимулирующее действие света на сперму рыб регистрируется при плотности мощности 0,5-100 мВт/см 2 и энергетической дозе 60-180 мДж/см 2. Снижение плотности мощности ниже 0,5 мВт/см 2 является нецелесообразным, так как в этом случае наблюдается снижение стимулирующего эффекта, а кроме того, для набора энергетической дозы 60-180 мДж/см 2 длительность воздействия может превышать 600 с (10 мин),что снижает производительность процесса и увеличивает вероятность нарушения режима стерильности. Повышение плотности мощности свыше 100 мВт/см 2 также является нецелесообразным, так как в этом случае можно вызвать термическое повреждение сперматозоидов, что приводит к эффекту ингибирования их активности. Установлено, что применение режима модуляции излучения в зависимости от ее частоты способно как повысить стимулирующий эффект, характерный для непрерывного излучения, так и снизить его. Как следует из табл. 1-3, при воздействии излучения,модулированного низкой частотой (5 Гц), стимулирующий эффект ниже, чем при непрерывном воздействии. При увеличении частоты модуляции происходит увеличение величины стимулирующего эффекта, который достигает своего максимума при 50-60 Гц. При дальнейшем увеличении частоты модуляции до 100 Гц эффект стимуляции светового воздействия мало отличается от такового при использовании непрерывного (немодулированного) излучения. Поэтому повышение или снижение частоты модуляции света за пределы 50-60 Гц является нецелесообразным. Установлено, что сперма, подвергнутая действию лазерного излучения при оптимальных параметрах (длина волны излучения в спектральном диапазон от 450 до 1270 нм,плотность мощности Р 0,5-100 мВт/см 2, энергетическая доза Е 60-180 мДж/см 2), обладает более высокой способностью к оплодотворению икры. Так, если в случае использования интактой (контрольный вариант) спермы процент оплодотворения икры осетровых рыб составляет 72 , то в случае использования спермы, обработанной заявляемым способом, процент оплодотворения икры достигает 82 . Таким образом, заявляемый способ позволяет увеличить время подвижности сперматозоидов после активации водой и повысить вероятность успешного оплодотворения икры. Заявляемый способ может использоваться в практике осетроводства с целью сохранения качества спермы самцов при длительном хранении без консервации в условиях, когда сбор спермы самцов уже осуществлен, а овуляции икры самок растягивается на продолжительное время. Источники информации 1. Патент Российской Федерации 2035858, 1995. 2. - .,.,.,.,.,.,. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8