Способ диагностики гепатоза крупного рогатого скота

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА(71) Заявитель Учреждение образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины(72) Авторы Ковалнок Юрий Казимирович Курдеко Александр Павлович Голубь Андрей Андреевич Богомольцев Александр Валерьевич Совейко Евгения Игоревна(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины(56)2029304 1, 1995. ИДРИСОВА Р.Р. Диагностика и коррекция иммунного и биохимического статуса продуктивных коров при гепатозе. Автореферат диссертации. - Екатеринбург, 2008. - С. 10-12, 19. ЩУРОВА Н.Ю. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак Почета государственная академия ветеринарной медицины. - Т. 42. Вып. 2. - Ч. 2. - 2006. - С. 245-246. СЕВРЮК И.З. Ученые записки Витебской ордена Знак Почета государственной академии ветеринарной медицины. - Т.36. - Ч. 2. - Витебск,2000. - С. 119-122.1674807 1, 1991.(57) Способ диагностики гепатоза крупного рогатого скота, включающий биохимическое исследование крови животного, отличающийся тем, что в сыворотке крови определяют активность аланинаминотрансферазы АЛТ в МЕ/л, гаммаглутамилтранспептидазы ГГТ в МЕ/л и концентрацию цинкав мг/л, рассчитывают коэффициент К по формуле АЛТГГТ и диагностируют гепатоз при значении К выше 20,88. Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для диагностики гепатоза крупного рогатого скота. Диагностика дистрофических поражений печени представляет значительные затруднения. Существующие на практике методы исследования печени не всегда дают объективную информацию о характере заболевания и стадии патологического процесса. Поэтому необходимо проведение комплексных исследований для установления диагноза. Они включают анализ анамнестических данных, клинические признаки и биохимические исследования, постановку функциональных проб, обзорную и контрастную рентгенографию, ультразвуковое сканирование (УЗИ). При необходимости проводят эндоскопию,пункционную биопсию и гистологические исследования тканей печени 5. 16521 1 2012.10.30 Определенное место в диагностических исследованиях занимает клинический метод. Однако его возможности ограничены можно получить ориентировочную информацию о топографии и состоянии органа, да и не у всех животных 2. Для ветеринарной практики предложен большой набор биохимических показателей углеводного, липидного, минерального, витаминного обменов и др. Действительно, можно получить ценную информацию о состоянии органа, но предлагаемые методы трудоемки и требуют высокой квалификации исследователей. В ветеринарии известны функциональные методы исследования печени, получившие название углеводных и липоидных нагрузок. Здесь также имеются определенные трудности, так как кровь необходимо брать до нагрузки, а затем в динамике, через определенное количество времени. Из лабораторных методов исследования печени одними из самых простых, доступных и информативных являются коллоидно-осадочные пробы. К сожалению, все они также неспецифичны в отношении патологического процесса в печени, а основаны на диспротеинемии 2. Биохимические исследования последних лет позволили выявить избирательные изменения ферментной активности сыворотки крови при некоторых заболеваниях. В ряде случаев изменения активности ферментных реакций настолько характерны и специфичны для того или иного заболевания, что могут служить надежным показателем скрытых патологических состояний организма. Однако использование биохимических тестов в диагностике как первичных, так и вторичных поражений печени затруднено их колебаниями в процессе роста, развития и в связи с изменениями физиологического состояния животного. Поэтому при интерпретации результатов исследования гепатоспецифического метаболического профиля сыворотки крови необходимо учитывать эти изменения 7. Известен органоспецифичный фермент уроканиназа, который является чувствительным тестом поражения гепатоцитов при гепатозе крупного рогатого скота на откорме и нередко обнаруживается раньше других биохимических показателей. В сыворотке крови здоровых животных уроканиназа отсутствует (или находятся ее следы). У больных гепатозом коров ее активность составляет 1,038 мкмоль 4. Однако в клинической практике врача имеют место случаи, когда традиционно принятые лабораторные тесты не дают однозначно интерпретируемого результата 3. Вместе с этим клинико-биохимические показатели, характеризующие состояние печени у крупного рогатого скота, изучены мало. Доминирующее значение в лабораторной диагностике гепатопатий занимают ферментные тесты. Это в основном так называемые индикаторные ферменты, которые в сыворотке крови здоровых животных содержатся только в малых количествах, а при поражении тех или иных органов и тканей (в том числе и печени) их содержание резко возрастает,являясь показателем степени и глубины повреждения. Для получения объективной картины целесообразно проводить определение группы ферментов, что во многом облегчит дифференциальную диагностику патологии того или иного органа. В литературе данные о гепатозависимых ферментах у крупного рогатого скота немногочисленны. Они не сопоставлены с физиологическим состоянием, продуктивностью, нередко с возрастом 6. Для оценки функционального состояния печени и для диагностики гепатозов у коров используется метод определения содержания мочевины в молоке. И при соответствующем показателе до 4,06 ммоль/л и наличии клинических признаков - гипотония преджелудков,увеличение области печеночного притупления (задняя граница печени за 13 ребром), болезненность печени при перкуссии - ставят диагноз на гепатоз. Точность способа около 88 . Способ прост в осуществлении, экономичен. Его применение позволяет повысить продуктивность животных на 3-5 , а производительность труда - на 75-808. Для экспресс-диагностики жирового гепатоза известен способ, включающий изучение излучения печени, отличающийся тем, что предварительно готовят биологический индикатор, состоящий из 0,1 водного раствора смеси аминокислот - аспарагиновой, глута 2 16521 1 2012.10.30 миновой, глицина, триптофана, валина, лейцина, пролина, аргинина, треонина, серина 0,5 водного раствора дофамина 0,25 водного раствора натриевой соли ДНК, 12 водного раствора сернокислой магнезии в соотношении 3115, который наносят на 6-7 стеклянных пластин, помещают их на поверхность кожи правого подреберья в зону проекции печени, выдерживают на протяжении 2-3 мин, сушат при Т 18-20 С, исследуют в поляризованном свете с кварцевым компенсатором и при наличии в препарате деформированных полигональных камер и/или округлых, и/или овалоидных, и/или ромбовидных, с отростками и без отростков включений пестрой окраски диагностируют жировой гепатоз 9. Известен способ диагностики гепатоза коров путем измерения электрического сопротивления кожи животного на симметричных участках в биологически активных точках,ответственных за состояние печени. По разнице электрического сопротивления на положительном и отрицательном потенциалах диагностируют наличие или отсутствие гепатоза 10. Несмотря на громадное количество методов исследования функции печени, в ветеринарии большинство из них широкого распространения не получили, так как требуют дорогостоящего оборудования, дефицитных реактивов, громоздки или трудновыполнимы. Кроме того, многие методы требуют много времени на освоение, для отдельных необходима специальная подготовка. Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ диагностики и определения степени тяжести гепатоза путем определения уровня сывороточной аспартатаминотрансферазы (АСТ) и аланинаминотрансферазы (АЛТ) с учетом коэффициента де Ритиса, отличающийся тем, что дополнительно определяют функцию Е 1 по формуле АСТ Е 13,813,61 ,АЛТ где АСТ - уровень сывороточной аспартатаминотрансферазы (Ед/л) АЛТ - уровень сывороточной аланинаминотрансферазы (Ед/л). Для определения степени тяжести гепатоза вычисляют функцию Е 2 по формуле АСТ Е 28,396,27 . АЛТ В связи с тем что данный способ диагностики гепатоза используется в медицине (диагностика и определение степени тяжести гепатоза у беременных), его применение в ветеринарии не корректно. Его недостатком является то, что метод является малоинформативным в связи с тем, что АСТ содержится в скелетных мышцах, сердце и многих паренхиматозных органах. В гепатоцитах большая часть АСТ (80 активности) обнаруживается в митохондриях и составляет митохондриальную изоформу, и лишь около 20 содержится в цитозольной фракции - цитозольная изоформа. Также АСТ находится в клетках крови - эритроцитах и лейкоцитах. Необходимо помнить, что результаты определения АСТ могут искажаться в сторону повышения если в сыворотку попадает АСТ из разрушенных эритроцитов, или в сторону понижения когда в результате хранения в течение нескольких дней происходит инактивация фермента. Незначительные и умеренные деструктивные процессы в гепатоцитах сопровождаются высвобождением АСТ из цитозоля, митохондриальные структуры повреждаются мало, поэтому общее количество попадающей в кровь АСТ невелико, в отличие от уровня АЛТ, которая целиком локализуется в цитозоле и переходит в кровь при повреждении последнего 1. Таким образом, дальнейший поиск новых или усовершенствование уже известных функциональных проб, которые бы кардинально решали вопросы диагностики заболеваний печени, является актуальным. В связи с вышеизложенным, целью данного изобретения является разработка способа диагностики гепатоза крупного рогатого скота, исключающего вышеперечисленные недостатки, обладающего высокой точностью постановки диагноза. Решение поставленной задачи достигается тем, что после клинического обследования животного и проведения биохимических исследований крови используются коэффициенты зависимости показателей АЛТ (сывороточной аланинаминотрансферазы), ГГТ (гамма 3 16521 1 2012.10.30 глутамилтранспептидазы) от концентрации цинка, достоверно изменяющихся при данной патологии. Следует подчеркнуть, что повышение активности ГГТ, которая используется в нашем коэффициенте, является одним из самых чувствительных биохимических тестов,указывающих на наличие поражения паренхимы печени и билиарной системы. АЛТГГТ Определение значения коэффициента является информативным, его зна чение, превышающее показатель 20,88, подтверждает развитие дистрофических изменений в печени у животного. Для определения новых критериев поражения печеночной ткани был проведен комплекс исследований, включающий изучение зависимости определенных показателей от концентрации цинка в крови, а также математическая подборка нового критерия, характеризующего поражение печени. Для изучения зависимости различных показателей под влиянием изменения концентрации в крови цинка использовали дисперсионный анализ по методу /. Были отобраны животные без изменения клинического статуса, а также имеющие неспецифические признаки гепатоза. Всего в эксперименте использовалось 200 голов крупного рогатого скота. У всех животных была взята кровь для биохимических исследований. Материалом для исследования служила сыворотка крови животных. Наиболее достоверными были зависимости АЛТ, АСТ и ГГТ от концентрации цинка. На фиг. 1 видно, что при увеличении концентрации цинка уровень АЛТ вначале немного возрастает, а затем достоверно снижается (4,430,007). Фиг. 1. График зависимости АЛТ от концентрации цинка При анализе зависимости активности АСТ и ГГТ от концентрации в крови цинка отмечается достоверное снижение активности ферментов при увеличении концентрации цинка (фиг. 2 и 3). Причем наиболее резкий спад активности ферментов наблюдался при достижении концентрации цинка в крови до 3,28 мг/л. Фиг. 2. График зависимости АСТ от концентрации цинка. 4 Фиг. 3. График зависимости ГГТ от концентрации цинка Таким образом, мы обозначили ряд показателей, имеющих зависимость от концентрации цинка. Далее, учитывая клинический и биохимический статусы, опытные животные были разделены на 2 группы животные, имеющие неспецифические признаки гепатоза (группа 1). У этих животных отмечалось угнетение, волосяной покров матовый, взъерошен, эластичность кожи понижена, температура тела в пределах нормативных значений, цвет слизистых не изменен,показатели АЛТ, АСТ, ГГТ и цинка находятся вне значений здоровых животных условно здоровые животные (группа 2). У животных данной группы клинический статус не изменен, биохимические показатели крови показатели АЛТ, ГГТ и цинка находятся в рамках нормативных значений. Для оценки различий уровней вышеназванных показателей между двумя выборками использовали критерий достоверности Манна-Уитни . Данные расчетов приведены в табл. 1. Таблица 1 Значения биохимических показателей опытных животных Показатели Группа 1 Группа 2, ммоль/л 120 2,320,328 2,340,483, мкмоль/л 106 5,511,205 5,150,962 Цинк, мг/л 11,5 2,810,237 3,750,4890,050,01- уровень значимости критерия достоверности показателей различий между двумя группами. Так было выявлено достоверное различие между двумя группами животных по уровню АЛТ, АСТ, ГГТ, СДГ, ГлДГ и концентрации цинка. При этом в 1 группе наблюдалась повышенная активность данных гепатоспецифических ферментов, что свидетельствует о поражении клеток печени. 5 16521 1 2012.10.30 Так, посредством проведенного анализа были выявлены показатели, наиболее значимые для диагностики гепатодистрофии. Далее, исходя из вышеизложенного, мы предположили, что для диагностики гепатоза можно использовать коэффициенты зависимости показателей, достоверно изменяющихся при данной патологии.АЛТАСТ Были проанализированы следующие коэффициенты АЛТ СДГ АЛТГГТ. Среди жиПри этом наиболее информативным оказался коэффициент вотных первой группы он колебался в пределах 20,08-28,48, а у животных второй опытной группы 12,45-20,88 (1,0,01) (табл. 2). Таблица 2 Значения расчетных коэффициентов в опытных группах Коэффициенты Группа 1 Группа 2 0,050,01 - уровень значимости критерия достоверности показателей различий между двумя группами. Таким образом, коэффициент является информативным при изменении функционального состояния печени. Так, если указанный коэффициент превышает значение 20,88,можно говорить о том, что имеет место повреждение плазматической мембраны и нарушение цитоскелета гепатоцитов, что сопровождается нарушениями их структуры с образованием разрывов в мембране и может непосредственно вести к гибели клетки, и как следствие возникновение различных заболеваний органов гепатобилиарной системы. Это подтверждается достоверной разницей между группами, а также характерной гистологической картиной. 16521 1 2012.10.30 Проведенные далее гистологические исследования печени животных первой группы свидетельствовали о развивающейся дистрофии печени, что полностью подтверждено морфологической картиной, которая характерна для гепатоза. В то время как гистоисследования печени животных второй группы показали картину физиологических процессов,происходящих в печени здоровых животных. Способ осуществляется следующим образом 1. Проводят клиническое исследование животного, при обнаружении неспецифических (угнетение, матовый волосяной покров, снижение эластичности кожи, упитанности и частоты сокращений рубца) или специфических (увеличение печени в объеме, слабо выраженная болезненность органа при пальпации, желтушность видимых слизистых оболочек и непигментированных участков кожи, расстройство пищеварения) признаков проводят биохимическое исследование крови. В сыворотке крови животного определяют активность аланинаминотрансферазы АЛТ в МЕ/л, гаммаглутамилтранспептидазы ГГТ в МЕ/л и концентрациюв мг/л. Используя значение указанных показателей, рассчитывают коэффициент К по формуле АЛТГГТ К, и диагностируют гепатоз при значении К выше 20,88. Пример выполнения способа. Бычок, 7 месяцев, черно-пестрой породы. При клиническом исследовании установлено температура тела, частота сердечных сокращений, дыхательных движений - в норме,отмечается понижение аппетита, гипотония рубца, увеличение и болезненность в области печеночного притупления, понижение эластичности кожи, цвет видимых слизистых не изменен. При биохимическом исследовании крови у животного установлено повышение активности АЛТ (39,62 МЕ/л) и ГГТ (35,0 МЕ/л), снижение уровня цинка (2,62 мг/л). Используя предлагаемую формулу, выводим расчетный коэффициент АЛТГГТ К 24,48 . Полученный коэффициент равен 24,48 и свидетельствует о нарушении функции печени и развивающемся гепатозе. Таким образом, по сравнению с прототипом, заявленный способ позволяет упростить,ускорить и повысить точность диагностики гепатоза у крупного рогатого скота, проводить обследование животного на базе биохимических лабораторий. Для персонала, проводящего исследования, не требуется специальной подготовки и применения. Источники информации 1.2002116941/15, 2004 2. Байматов В.Н. Морфофункциональная диагностика заболеваний печени у животных. Современные вопросы ветеринарной медицины и биологии. - Уфа, 2000. - С. 23-25. 3. Бокарев А.В., Стекольников А.А., Бокарева Е.В. -изоферментная диагностика и дифференциальная диагностика заболеваний костной и гепатобилиарной систем собак методом -преципитации. Исследование чувствительности и специфичности метода // Ветеринарная патология. - 2007. -2. - С.69-77. 4. Рахимжанова Д.Т. Активность фактической естественной резистентности и ее рефлекторная коррекция при гепатозе коров Автореф. дис.канд. вет. наук 08.00.10 / ВВИ.- Витебск, 1993. - 15 с. 5. Сенько А.В. Диагностика дистрофических поражений печени у свиней. - Ученые записки Сб. научн. трудов / Научно-практический журнал. Витебская государственная 7 16521 1 2012.10.30 академия ветеринарной медицины. Ред. А.И.Ятусевич и др. - Витебск УО ВГАВМ.- 2000. Т. 36. - Ч. 2. - С. 123-126. 6. Соболева, Ю.Г. Клинико-биохимическое значение гепатозависимых ферментов. Ученые записки Учреждение образования Витебская государственная академия ветеринарной медицины. - Витебск, 2003. - Т. 39. - Ч. 2. - С. 97-100. 7. Холод В.М., Соболева Ю.Г. Рекомендации по использованию в диагностике патологии печени гепатоспецифического метаболического профиля сыворотки крови крупного рогатого скота. - Витебск УО ВГАВМ, 2008. - 31 с. 8.2029304 С 1, 1995. 9.2305840 С 1, 2007. 10.2054284 С 1, 1996. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8