Средство для фотодинамической терапии

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СРЕДСТВО ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ(71) Заявитель Республиканское унитарное производственное предприятие Белмедпрепараты(72) Авторы Трухачева Татьяна Викторовна Дунец Людмила Николаевна Шляхтин Сергей Владимирович Громова Татьяна Валентиновна(73) Патентообладатель Республиканское унитарное производственное предприятие Белмедпрепараты(57) Средство для фотодинамической терапии, включающее фотосенсибилизатор и поливинилпирролидон, отличающееся тем, что в качестве фотосенсибилизатора содержит тринатриевую соль хлорина Е 6, дополнительно содержит диметилсульфоксид, макрогол 1500, макрогол 400 и макроголглицерина гидроксистеарат при следующем соотношении компонентов, г тринатриевая соль хлорина Е 6 0,5-10,0 поливинилпирролидон 0,5-10,0 диметилсульфоксид 5,0-50,0 макрогол 1500 30,0-70,0 макрогол 400 10,0-30,0 макроголглицерина гидроксистеарат 0,1-2,0,и выполнено в форме мази. Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине и является средством, используемым в фотодинамической терапии (ФДТ). Анализ современных тенденций развития новейших методов диагностики и лечения в онкологии показывает, что на первое место в терапии онкологических больных выходят методы, минимизирующие инвазивность, фармахимизм и другие экологически нежелательные воздействия на организм пациента. Этим требованиям в полной мере отвечает лазерный метод диагностики и лечения метод фотодинамической терапии, основанный на использовании светового повреждения опухолевых клеток в ходе фотохимических реакций. 16102 1 2012.08.30 В качестве биологически активных веществ, применяемых в ФДТ, используют,например, диметилглюкаминовую соль хлорина Е 6 под торговым названием Фотодитазин 1. Фотодитазин используют в виде инъекционного раствора внутривенно, капельно, из расчета 1 мг/кг. Через 1,5-2 часа после введения фотосенсибилизатора проводят сеанс локального облучения опухоли. При введении препарата возможны повышение температуры тела, боли, повышение артериального давления, могут развиваться гиперемия и отек. Известно применение в ФДТ препарата Фотосенс, содержащего смесь натриевых солей ди-, три- и тетрасульфофталоцианина гидроксиалюминия 2. Фотосенс используется в виде инъекционного раствора в дозе 0,8 и 0,5 мг/кг. Применение препарата вызывает болевые ощущения различной степени выраженности (от чувства жжения до резких болей) в зоне облучения, которые могут сохраняться от нескольких часов до суток после ФДТ, а также могут наблюдаться выраженные реакции в виде гиперемии и сильного отека. Прототипом заявляемого средства является препарат Фотолон 3, который вводят больному внутривенно. Препарат в терапевтической дозе обладает слабовыраженной системной фототоксичностью. Однако применение Фотолона может вызвать повышение температуры тела и боли в зоне облучения, а также могут развиться гиперемия и отек. Препарат Фотолон содержит следующие компоненты, мас.фотосенсибилизатор 40,0-90,0 поливинилпирролидон 10,0-60,0. Применение инъекционных форм фотосенсибилизаторов приводит к выраженным сдвигам окислительно-антиокислительного баланса, который клинически проявляется в виде воспалительной реакции, нередко сопровождающейся отеком ткани. Наличие подобных осложнений указывает на необходимость разработки новых лекарственных форм фотосенсибилизаторов для использования в медицинской практике при проведении ФДТ. Проблема фоточувствительности является главной причиной выбора эффективного и универсального способа введения фотосенсибилизатора. Задачей настоящего изобретения является создание средства в виде мази для фотодинамической терапии, предназначенного для местного применения, способного исключить системное (общее) воздействие фотосенсибилизатора на организм пациента и минимизировать риск развития фототоксических реакций, снизить стоимость препарата и расширить ассортимент лекарственных средств для ФДТ. Это достигается тем, что средство для фотодинамической терапии включает фотосенсибилизатор, содержащий тринатриевую соль хлорина Е 6, поливинилпирролидон и дополнительно содержит диметилсульфоксид, макрогол 1500, макрогол 400 и макроголглицерина гидроксистеарат при следующем соотношении компонентов, г 0,5-10,0 тринатриевая соль хлорина Е 6 поливинилпирролидон 0,5-10,0 диметилсульфоксид 5,0-50,0 макрогол 1500 30,0-70,0 макрогол 400 10,0-30,0 макроголглицерина гидроксистеарат 0,1-2,0,при этом средство изготовлено в виде мази. Средство получают следующим образом. Пример 1 Макрогол 1500 в количестве 30 г расплавляют при температуре (702) С, перемешивают, а затем охлаждают до температуры (552) С и добавляют к расплаву макрогол 400 в количестве 10 г и макроголглицерина гидроксистеарат в количестве 0,1 г. Полученную основу охлаждают до комнатной температуры. Фотосенсибилизатор в виде тринатриевой соли хлорина Е 6 в количестве 0,5 г, поливинилпирролидон в количестве 0,5 г растворяют в 5,0 г диметилсульфоксида и прибавляют к основе, гомогенизируют, а затем передают на фасовку. Получают готовую мазь. 2 16102 1 2012.08.30 Пример 2 Отличается от примера 1 тем, что макрогол 1500 в количестве 50 г расплавляют при температуре (702) С, перемешивают, а затем охлаждают до температуры (552) С и добавляют к расплаву макрогол 400 в количестве 17 г и макроголглицерина гидроксистеарат в количестве 1 г. Полученную основу охлаждают до комнатной температуры. Фотосенсибилизатор в виде тринатриевой соли хлорина Е 6 в количестве 1 г, поливинилпирролидон в количестве 1 г растворяют в 30 г диметилсульфоксида и прибавляют к основе, гомогенизируют, а затем передают на фасовку. Получают готовую мазь. Пример 3 Отличается от примеров 1 и 2 тем, что макрогол 1500 в количестве 70 г расплавляют при температуре (702) С, перемешивают, а затем охлаждают до температуры (552) С и добавляют к расплаву макрогол 400 в количестве 30 г и макроголглицерина гидроксистеарат в количестве 2 г. Полученную основу охлаждают до комнатной температуры. Фотосенсибилизатор в виде тринатриевой соли хлорина Е 6 в количестве 10 г, поливинилпирролидон в количестве 10 г растворяют в 50 г диметилсульфоксида и прибавляют к основе, гомогенизируют, а затем передают на фасовку. Получают готовую мазь. Исследование местнораздражающего, аллергизирующего и кожно-резорбтивного действия заявляемого средства выполнено на 24 половозрелых кроликах обоего пола породы шиншилла. Для оценки местнораздражающего действия заявляемого средства в условиях однократной и многократной (в течение 10 суток) аппликации его наносили кроликам на выстриженный участок тела размером 22 см на правом боку. В качестве контроля на симметричный выстриженный участок тела того же размера на левом боку кроликов наносили плацебо. Учет реакции кожи проводили ежедневно до аппликации, непосредственно после аппликации, через 15 мин, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч и 4,5 ч после аппликации средства на протяжении 10 суток. Визуально оценивали состояние кожи животных (наличие признаков локальной ирритации, шелушения, образование мелких корочек, расчесов, пигментации кожи, признаков некроза ткани). Сопоставляли состояние обследуемых участков кожи на правом боку (нанесение заявляемого средства) с состоянием кожи на левом боку кроликов (нанесение плацебо). Установлено, что заявляемое средство при однократной и субхронической (в течение 10 суток) аппликации на кожу не оказывает местнораздражающего действия. Состояние кожных покровов, подвергнутых экспозиции заявляемого средства в течение 0,25-4,5 ч и 1-10 суток не отличалось от такового, подвергнутого воздействию плацебо в течение аналогичного времени. Дополнительно было изучено потенциальное местнораздражающее действие заявляемого средства при аппликации на слизистые оболочки периодонта. Эксперименты выполнены на половозрелых крысах обоего пола линии Вистар. Заявляемое средство наносилось ежедневно, в течение 10 дней, на слизистую десны в области нижних резцов, а также слизистую нижней губы. Оценка состояния слизистой оболочки проводилась путем ежедневного визуального осмотра в течение всего периода наблюдения. При осмотре регистрировались такие патологические признаки, как отечность, гиперемия, кровоточивость слизистой оболочки, наличие элементов поражения (пятна, эрозии, язвы, очаги гиперкератоза и др.). В результате исследования ни в одном из случаев патологических изменений со стороны слизистой оболочки десны и нижней губы зарегистрировано не было. Таким образом, было сделано заключение о том, что заявляемое средство не обладает местно-раздражающим действием на слизистую оболочку полости рта. Аллергизирующее действие заявляемого средства было оценено в тесте кожной сенсибилизации. Сенсибилизацию животных осуществляли путем нанесения средства на выстриженные участки кожи на боку и бедре кролика. Через 10 дней осуществляли повторное нанесение средства на аналогичные участки кожи на противоположном боку и бедре животного (разрешающая проба). Состояние кожного покрова, а также общее со 3 16102 1 2012.08.30 стояние животного оценивали через 5-15 мин, 1 ч (реакция гиперчувствительности немедленного типа) и через 24 ч (реакция гиперчувствительности замедленного типа). Показано, что заявляемое средство не оказывает сенсибилизирующего действия при аппликации на кожу экспериментальных животных. Через 10 дней накожных аппликаций каких-либо видимых изменений со стороны кожных покровов в виде гиперемии, инфильтрации, шелушения не возникало. Нанесение разрешающей дозы заявляемого средства на 10-й день сенсибилизации на неповрежденную и скарифицированную кожу не вызвало явлений гиперемии у кроликов как в опыте, так и в контроле. Температура кожи, число лейкоцитов в периферической крови соответствовали нормальным физиологическим значениям. Кожно-резорбтивное действие заявляемого средства было оценено путем анализа динамики гематологических и биохимических показателей крови кроликов при его субхронической аппликации на участки кожи, а также путем анализа содержания активного вещества заявляемого средства в сыворотке крови через 0,5 1 3 12 и 24 ч после аппликации методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Показано, что при локальной аппликации на интактные кожные покровы экспериментальных животных активное вещество заявляемого средства (комплекс тринатриевой соли хлорина Е 6 и низкомолекулярного поливинилпирролидона) не проникает в системный кровоток в детектируемых количествах (0,017 мкг/мл). На хроматограммах экстрактов из образцов сыворотки крови экспериментальных животных отсутствуют пики, соответствующие времени удерживания хлорина Е 6 в заданных условиях хроматографического анализа. При наблюдении в течение 10 дней за общим состоянием и поведением животных, их выживаемостью, потреблением пищи, кожным покровом, рефлекторной возбудимостью каких-либо отклонений от возрастных норм для данного вида животных отмечено не было. Также не было зафиксировано каких-либо патологических изменений в биохимических и гематологических показателях крови. Таким образом, было сделано заключение о том, что заявляемое средство не обладает кожно-резорбтивным действием при аппликации на интактные кожные покровы животных. Экспериментальная оценка фотодинамической активности заявляемого средства была выполнена на 40 белых беспородных крысах с перевитой подкожно саркомой М-1 (Са М-1). Средство наносили местно на поверхность перевивной опухоли. Время экспозиции составляло 15 30 45 60 120 180 240 и 300 мин. Контроль за динамикой накопления фотосенсибилизатора в ткани перевивной опухоли Са М-1 крыс и нормальной ткани (кожа противоположного бедра) осуществлялся методом прижизненной компьютеризированной флуоресцентной спектрофотометрии на лазерно-волоконном спектроанализаторе с гелийнеоновым диагностическим лазером. После экспозиции заявляемое средство смывали с поверхности перевивной опухоли и осуществляли фотооблучение опухоли при помощи лазера с длиной волны 662 нм при суммарной дозе света 100 Дж/см 2. Эффективность ФДТ оценивали через 24 часа после облучения путем вычисления суммарной площади некроза опухоли, используя прижизненное окрашивание тканей 0,6 -ным раствором синьки Эванса. Для этого удаленные опухоли фиксировали и делали поперечные срезы по наибольшему диаметру образования, числом 25-30, которые регистрировали фотокамерой. Для расчета площади некрозов были использованы метод компьютерного сканирования цветовых оттенков гистотопографических срезов опухолей и соответствующее программное обеспечение, в котором реализован алгоритм распознавания жизнеспособных зон опухоли, окрашенных синим цветом. Зоны опухоли, погибшие из-за прямого цитотоксического эффекта либо в результате структурно-функциональных нарушений микроциркуляции, в синий цвет не окрашивались. На фигуре показана динамика накопления фотосенсибилизатора в ткани перевивной опухоли Са М-1 крыс и при локальной аппликации заявляемого средства (А) и внутривенном введении раствора ФС по прототипу в дозе 2,5 мг/кг массы тела (Б). 16102 1 2012.08.30 Максимальный уровень накопления фотосенсибилизатора в Са М-1 крыс был отмечен спустя 3 ч после аппликации заявляемого средства (6295 усл. ед.) с последующим незначительным снижением на 4-5 ч. Интенсивность флуоресценции ФС в опухолевой ткани в десятки раз выше, чем в нормальной ткани (интенсивность флуоресценции в нормальных тканях не превышала 100 усл. ед.). Уровень флуоресценции в опухоли возрастал с увеличением времени аппликации заявляемого средства. При внутривенном введении ФС по прототипу в дозе 2,5 мг/кг максимальная интенсивность флуоресценции опухолевой ткани наблюдалась на 3-4 ч наблюдения, затем уровень сигнала падал. Контрастность накопления фотосенсибилизатора в опухоли по сравнению с нормальными тканями достигала 2,08. Установлено, что уровень накопления фотосенсибилизатора в тканях при использовании заявляемого средства позволяет проводить как флуоресцентную диагностику, так и фотодинамическую терапию поверхностно расположенных злокачественных опухолей. В табл. 1 приведены значения площади некрозов в гистотопографических срезах Са М-1 крыс после внутривенного введения ФС по прототипу, дозе 2,5 мг/кг и фотооблучения в дозе 100 Дж/см 2. Полученные данные свидетельствуют, что фотооблучение Са М-1 крыс в дозе 100 Дж/см 2 через 3 ч после внутривенного введения ФС по прототипу в дозе 2,5 мг/кг сопровождалось возникновением некроза в 60,6 срезов опухолей. Таблица 1 Площади некрозов в гистотопографических срезах перевивной опухоли Са М-1 после ФДТ при в/в введении ФС по прототипу в дозе 2,5 мг/кг Площадь некроза к исВремя после в/в ввеПлощадь среза опухоходной площади Число срезов дения ли, см 2 см 2 3 ч 30 3,590,13 2,150,09 60,602,53 В табл. 2 приведены значения площади некрозов в гистотопографических срезах Са М-1 крыс после аппликации заявляемого средства с экспозицией от 15 мин до 5 ч и последующим фотооблучением в дозе 100 Дж/см 2. При изучении противоопухолевого эффекта отмечена прямая зависимость между временем экспозиции заявляемого средства и площадью некрозов в гистотопографических срезах опухолей. Выраженный противоопухолевый эффект фотодинамической терапии получен при аппликации средства на Са М-1 крыс с экспозицией 3 ч. Площадь некрозов в гистотопографических срезах опухолей животных в этой группе составила 77,8 . Полученные в эксперименте данные о противоопухолевом эффекте ФДТ с заявляемым средством свидетельствуют о возможности его клинического применения для лечения опухолей поверхностной локализации. Показано, что противоопухолевая эффективность ФДТ с локальным применением заявляемого средства не уступает таковой при системном введении ФС по прототипу. Таблица 2 Площади некрозов в гистотопографических срезах перевивной опухоли Са М-1 после ФДТ при локальной аппликации заявляемого средства Площадь некроза к исходной плоЧисло среПлощадь среза щади Время экспозиции зов опухоли, см 2 2 см 16102 1 2012.08.30 В отдельной серии экспериментов исследовано антибактериальное действие ФДТ с заявляемым средством при его аппликации на слизистую периодонта. Модель экспериментального периодонтита была реализована у 100 крыс породы Вистар путем наложения шелковых лигатур на передние резцы. Острый периодонтит развивался у экспериментальных животных в течение 7-10 суток после наложения лигатур. После этого на пораженную слизистую десны наносили заявляемое средство. После экспозиции в течение 710 мин осуществляли облучение тканей периодонта лазером с длиной волны 662 нм при плотности мощности 125 мВт/см 2 и дозе облучения 50 Дж/см 2. Процедуру ФДТ проводили дважды с интервалом 3 дня. Оценка эффективности базировалась на детальном исследовании состояния тканей периодонта с использованием клинических, гистологических и микробиологических методов. Проведены клинические испытания эффективности и безопасности заявляемого средства, применяемого для ФДТ у больных базально-клеточным раком кожи. В испытание было включено 30 больных (8 мужчин и 22 женщины) с морфологически подтвержденным диагнозом базально-клеточного рака кожи (100). Средний возраст больных составил 62,111,9 лет. У всех пациентов были диагностированы первичные опухоли кожи,локализовавшиеся в области головы и шеи. Заявляемое средство наносили локально на поверхность опухоли за 3 ч до облучения опухолей светом лазера. Непосредственно перед облучением остатки средства аккуратно смывались с поверхностей опухолей 96 -ным раствором этанола. Для облучения использовали терапевтический лазер с длиной волны 665 нм и мощностью излучения 100-400 мВт/см 2. Общая поглощенная доза света варьировала в диапазоне 200-400 Дж/см 2 в зависимости от размеров опухоли и числа очагов опухолевого роста в зоне облучения. Оценку эффективности ФДТ с местным применением заявляемого средства осуществляли на основании результатов клинического осмотра и данных прицельной биопсии, выполненных у каждого больного через 3 и 6 месяцев после лечения. Объективный терапевтический эффект через 3 месяца после ФДТ был отмечен у 93,4 больных и был подтвержден через 6 месяцев после лечения. Объективный эффект включал полную регрессию опухолей (26,7 ), частичную регрессию (50,0 ) и стабилизацию (16,6 ). Прогрессирование опухолевого роста было отмечено через 3 месяца у 6,7 больных. Проведенное сравнение полученных результатов с ретроспективными данными об эффективности лечения базально-клеточного рака кожи хирургическим путем и методами короткофокусной рентгенотерапии и ФДТ с системным (внутривенным) введением ФС по прототипу позволило установить, что хирургическое лечение обеспечивает объективный терапевтический эффект в 96,7 случаев, короткофокусная рентгенотерапия и ФДТ с внутривенным введением ФС по прототипу - в 86,6 и 95,5 случаев соответственно. Отмечена хорошая переносимость лечения с применением заявляемого средства. В процессе испытания не было зарегистрировано каких-либо серьезных местных и системных побочных реакций. Кроме того, локальное применение заявляемого средства позволяло избежать системной фотосенсибилизации больного и снизить риск развития реакций фототоксичности после проведенного лечения. Существенное достоинство заявленного средства, применяемого местно, путем аппликации, - это исключение риска развития фототоксических реакций из-за отсутствия накопления препарата в нормальных тканях без системного воздействия на организм пациента, что существенно отличает его от препарата для внутривенного введения. Это дает возможность использования его в амбулаторных условиях и значительно снижает стоимость лечения. Проведено клиническое испытание эффективности и безопасности заявляемого средства, применяемого для ФДТ у больных хроническим маргинальным гингивитом и хроническим периодонтитом. В испытание было включено 60 больных (14 мужчин и 46 женщин) с хроническим маргинальным гингивитом и хроническим периодонтитом. Заявляемое средство наносили локально на поверхность слизистой периодонта, формируя 6 16102 1 2012.08.30 равномерный тонкий слой на поверхности пораженной десны. Время экспозиции мази составляло 7-10 мин. Непосредственно перед облучением остатки средства аккуратно смывались с поверхности десны. Для облучения использовали терапевтический лазер с длиной волны 670 нм и мощностью излучения 125 мВт/см 2. Общая поглощенная доза света составляла 50 Дж/см 2. Оценку эффективности ФДТ с местным применением заявляемого средства осуществляли на основании данных клинического осмотра и бактериоскопического исследования, а также на основании оценки индексных показателей -, , , , выполненной через 7, 12 дней и 1 месяц после лечения. Кроме того, учитывались данные о локальных и системных побочных реакциях и субъективная оценка качества жизни пациента в процессе лечения (данная как самим больным, так и врачом-исследователем). Установлено, что у пациентов с маргинальным гингивитом выполненная процедура ФДТ приводила к полному исчезновению таких симптомов, как кровоточивость при чистке зубов и неприятный запах, а также к восстановлению цвета, формы, консистенции периодонтальных тканей и целостности межзубных сосочков. У больных с хроническим периодонтитом в результате проведенной ФДТ дополнительно уменьшалась подвижность зубов, происходила регрессия застойной гиперемии межзубной и альвеолярной десны. Процедура ФДТ вызывала как минимум 2-кратное снижение уровня микробной обсемененности периодонтальных тканей и зубодесневых карманов. ФДТ также способствовала нормализации всех индексных показателей тканей периодонта. Полученный терапевтический эффект был стабилен в течение как минимум 6 месяцев после лечения. ФДТ с местным применением заявляемого средства является эффективным и безопасным подходом к лечению маргинального гингивита и хронического периодонтита, который обеспечивает выраженное антибактериальное действие и стимулирует восстановление пораженных тканей периодонта и их функций. Таким образом, разработанное средство для фотодинамической терапии позволяет эффективно использовать его в качестве препарата для местного и наружного применения для терапии как злокачественных новообразований, так и воспалительных заболеваний периодонта. Применение средства снижает побочные эффекты и упрощает методику проведения ФДТ. Это позволяет применять его в амбулаторных условиях, а также уменьшить количество фотосенсибилизатора, необходимого для лечения, и получить ощутимый фармакоэкономический эффект. Источники информации 1. РЛС России. Энциклопедия лекарств. - М. ООО РЛС-2001. - С. 289 284 982. 2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Т. 1. - М. Новая волна, 2002. 3. Патент РБ 5651. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8