Способ диагностики злокачественного новообразования молочной железы

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО НОВООБРАЗОВАНИЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Скорняков Иван Васильевич Толсторожев Георгий Борисович Бутра Виктор Александрович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физики имени Б.И.Степанова Национальной академии наук Беларуси(56)5596992 , 1997. Диагностика рака молочной железы. М. Медицинское информационное агентство, 2005.- С. 30-41. ПРИХОДЧЕНКО В.В. и др. Онкология.- 2007.- Т. 9.-2.- С. 115-119. ПУТЫРСКИЙ Л.А. и др. Новости лучевой диагностики.- 1999.-3.- С. 9-10. ПРОХОРОВА В.И. и др. Актуальные проблемы онкологии и медицинской радиологии. Сборник научных работ.Минск, 1998.- С. 77-81. ИСМАГИЛОВ А.Х. и др. Вопросы онкологии.- 2001.- Т. 47.- 3.- С. 348-355. ЧИСТЯКОВ С.С. Справочник фельдшера и акушерки.- 2007.-10.- С. 23-31.5292 1, 2003.2249216 1, 2005.1681204 1, 1991.(57) Способ диагностики злокачественного новообразования молочной железы, отличающийся тем, что регистрируют в интервале 1720-1600 см-1 инфракрасный спектр обезвоженного среза ткани, предварительно промороженной до -10 С, которая взята из патологического очага, осуществляют деконволюцию полученного спектра, в интервалах 1700-1680 см-1 и 1670-1650 см-1 определяют значения оптических плотностей в максимумах полос поглощения и, если отношение значения оптической плотности максимума полосы поглощения в интервале 1700-1680 см-1 к значению оптической плотности максимума полосы поглощения в интервале 1670-1650 см-1 больше 1,0 и максимум полосы поглощения смещен от значения 1684 см-1 на 6-15 см-1 в сторону возрастания волновых чисел, диагностируют злокачественное новообразование молочной железы. Изобретение относится к медицине, в частности к онкологии, и может использоваться для диагностики злокачественного новообразования молочной железы. Известные к настоящему времени диагностические способы, такие как визуальный,пальпаторный, ультразвуковой, рентгенологический (бесконтрастная и контрастная маммография), а также способ магнитно-резонансной томографии способны лишь выявить 13242 1 2010.06.30 опухолевидное образование. Полноценный онкологический диагноз опухолевидного образования устанавливается на основании морфологических (цитологических и гистологических) исследований с детальной характеристикой структуры опухоли во всех ее аспектах. Морфологический диагноз опухоли устанавливается на основании всего комплекса признаков цитологических характеристик, топографии клеток, их отношения к базальным мембранам, сосудам, состояния стромы, играющей роль посредника между новообразованиями и организмом и т.д. Несмотря на сходство, морфологические признаки злокачественности в каждом органе и ткани имеют особенности, которые порой могут существенно варьироваться. Поэтому при дифференциальной диагностике злокачественных опухолей и состояний, стимулирующих злокачественный рост, большое значение имеют клинические данные и данные лабораторных исследований. Сведения о локализации опухоли, темпах ее роста, возрасте пациента в ряде случаев при морфологической диагностике новообразований могут иметь определяющее значение 1. Тем не менее имеющихся морфологических данных в ряде случаев может быть недостаточно для точной верификации патологического (опухолевого) процесса и заключение о доброкачественности или злокачественности может оказаться предположительным 2. Ввиду того факта, что основополагающие процессы жизнедеятельности от одноклеточных организмов до человека реализуются на молекулярном уровне, для выявления признаков наличия в органе злокачественной опухоли, в добавление к перечисленным диагностическим способам, начата разработка спектральных способов, которые исследуют патологию органов на уровне строения и взаимодействий молекул 3. Известен способ диагностики рака молочной железы по анализу ИК спектров ДНК, выделенной из фрагментов диагностируемой ткани 4. Способ основан на анализе различий ИК спектров ДНК молочной железы в норме и при раке. Эти спектральные отличия обусловлены изменениями в структуре ДНК и увеличением количества гидроксильных радикалов при возникновении в тканях молочной железы злокачественной опухоли. Фрагмент исследуемой ткани молочной железы после иссечения мгновенно замораживается в жидком азоте и хранится при температуре -80 С. ДНК выделяют из каждого образца (70-100 мг) по модифицированной методике ионно-обменной экстракции Квиагена. Перед осаждением ДНК пропускают через 5,0 мкм 30 фильтр. Затем ДНК промывают в течение 3-х часов охлажденным до температуры льда 70 этанолом. Перед проведением ИК спектральных исследований выделенную ДНК растворяют в 10-40 мл особо очищенной дистиллированной воды. 0,2 мл водного раствора ДНК наносят на поверхность окна из 2, размазывают по поверхности окна и высушивают при комнатных условиях, получая размеры пятна не менее 100 мкм по ширине. Затем пластинки из 2 с нанесенными на них образцами ДНК в течение 1 часа подвергают дополнительной лиофильной сушке в струе чистого сухого азота. После осушки образцы ДНК на пластинках помещались в вакуумированные запаянные ампулы и хранились при температуре -80 С. ИК Фурье-спектры ДНК получали с помощью инфракрасного микроскопа-приставки в интервале 2000-700 см-1. Для диагностических целей использовали интервал спектра 1750700 см-1. Каждый спектр нормализировался по интенсивности и по положению базовой линии. Для каждого образца ДНК регистрировалось не менее 2-х спектров, которые затем усреднялись. Усредненный и нормализированный по интенсивности и по положению базовой линии спектр образцов ДНК использовался для дальнейшего статистического анализа. Проведенная статистическая обработка давала совпадение результатов в 8 случаях из 10 для морфологического и спектрального анализов. Таким образом, данный способ достаточно сложен и длителен по времени проведения и обладает малой диагностической эффективностью при сравнении с морфологическим исследованием. 13242 1 2010.06.30 Известен также способ исследования и диагностики рака по инфракрасным спектрам образцов тканей, взятых из патологического очага, при регулируемом высоком давлении 5-7. Способ основан на различиях в инфракрасных спектрах злокачественных опухолей и тканей в норме, получаемых при различных давлениях на срез исследуемой ткани в кювете высокого давления. С помощью спектрофотометра регистрируются ИК спектры при нормальном давлении и при повышении давления внутри кюветы вплоть до 27 килобар (1 бар 1,02 ат.). Наблюдаемые при повышении давления спектральные изменения в интервале 1350-950 см-1 позволили диагностировать некоторые разновидности злокачественных новообразований. Данному способу присущ ряд недостатков. Для создания высокого давления в кювете, его поддержания, управления и регулирования требуются специальные устройства, которым необходимы значительные энергетические затраты и квалифицированное обслуживание. Блок с образцами тканей, которые находятся под регулируемым высоким давлением, необходимо поместить в кюветное отделение спектрофотометра. Для этого такой блок должен иметь специальную конструкцию с соответствующими окнами,пропускающими инфракрасное излучение и выдерживающими высокое давление. При этом блок должен быть достаточно герметичным и удобным для того, чтобы размещать в нем образцы для исследования, не ухудшая герметичности. Без такого устройства диагноз рака по известному способу не представляется возможным. Кроме того, необходимо еще приспособление, регулирующее высокое давление в блоке с образцами исследуемых тканей, а размеры блока лимитируются кюветным отделением спектрофотометра и его оптической системой. Поэтому блок высокого давления не может быть универсальным, а должен изготавливаться для конкретного типа спектрофотометра. Таким образом, известный способ диагностики рака весьма сложен и требует уникальной аппаратуры. Известен способ диагностики рака, который основан на регистрации ИК спектров поглощения обезвоженных срезов исследуемой и здоровой тканей одного и того же вида и диагностировании ракового заболевания по спектральным различиям между ними 8. Способ состоит в приготовлении среза исследуемой ткани толщиной 10-20 мкм, помещении его на пластинку, прозрачную в инфракрасном интервале длин волн, удалении из среза ткани воды любым известным способом и регистрации спектра в интервале 3400-1100 см-1. При этом диапазон волновых чисел 34003200 см-1 и (или) 17001600 см-1 используется для быстрого диагностирования рака. Разность значений для волновых чисел максимумов полос поглощения ИК спектра исследуемого образца и нормальной здоровой ткани того же вида в данных диапазонах является диагностическим параметром рака. Если эта разность волновых чисел в пределах погрешности определения прибором волнового числа равна нулю, то исследуемая ткань в норме, при любом неравенстве нулю диагностируется рак исследуемой ткани. Наблюдаемые спектральные изменения исследуемой ткани по сравнению со здоровой в диапазоне 3400-1100 см-1 используются для определения стадии развития ракового заболевания. Они состоят из смещений максимумов некоторых полос поглощения, изменения их относительных интенсивностей, из появления новых полос поглощения. Несмотря на относительную простоту выполнения, в случае диагностирования рака молочной железы этому способу присущ ряд недостатков. Спектральные характеристики тканей могут изменяться как при злокачественных, так и при других видах патологических процессов в молочной железе, поэтому при реализации данного способа важен правильный выбор зоны, где будет браться контрольный образец. При неправильном выборе контрольного образца велика вероятность диагностирования любого патологического процесса в молочной железе как злокачественного. Наиболее близким к заявляемому является способ, включающий регистрацию и математическую обработку спектральных характеристик обезвоженных срезов из патологических очагов, помещенных на окна, прозрачные в ИК области спектра, и их сравнение с последующей классификацией образцов клеток и тканей на нормальные, гиперпластические и неопластические с обязательным использованием математических методов много 3 13242 1 2010.06.30 мерного анализа 9. Препараты для исследований изготавливались из материала, взятого из патологического очага при аспирации через тонкую иглу, а также брались мазкиотпечатки удаленных тканей. Приготавливались также препараты с нанесенными в один слой клетками (с использованием цитоспинового способа). Обезвоженные образцы помещались на прозрачные для ИК излучения окна из 2 (для спектров пропускания) и на покрытые золотом предметные стекла (для спектров отражения). Цитологические препараты исследовались без дополнительной обработки или после окраски части из них красителями. Гистологические срезы толщиной до 1 мкм изготавливались из залитой в парафин ткани и помещались на окна и покрытие из золота аналогичными способами. При этом одна часть образцов не подвергалась дополнительной обработке, другая фиксировалась в этаноле, третья часть из них фиксировалась и окрашивалась гематоксилином и эозином. Патоморфолог разделял препараты на нормальные, с гиперплазией (легкой, умеренной и выраженной) и опухолевые. Получение инфракрасных спектров осуществлялось на ИК Фурье-спектрометре со встраиваемым в него микроскопом-приставкой. Классификация клеток на нормальные, гиперпластические и неопластические по спектральным данным проведена в интервалах 3000-2800 см-1 и 1800-900 см-1. Ввиду незначительных, мало воспроизводимых различий между спектрами образцов, вне зависимости от способа их приготовления, для получения достоверных результатов разделения клеток на классы требовалось применение сложных математических способов обработки спектров на основе многомерного статистического анализа. При этом данный способ не дает прямого ответа о наличии или отсутствии онкологического заболевания. Такое заключение может быть сделано лишь после исследования полученной по данному способу информации о клеточном составе проверяемой биологической ткани. Этот подход аналогичен морфологическим исследованиям, когда по ряду качественных и количественных параметров клеток или тканей ставят диагноз онкологического заболевания. Это существенный недостаток способа. Данный способ имеет также ряд других недостатков. Для проведения классификации клеток одного органа необходим ряд образцов на оптически прозрачных окошках и зеркалах с золотым покрытием, в виде специально обработанных парафиновых срезов ткани, а также препаратов из материала пункции с расположением клеток в один слой, для чего необходима специальная технология. После регистрации спектров пропускания и отражения на спектральной аппаратуре,оборудованной приставками для микроанализа, необходима обработка спектральных данных с применением математических способов частичных наименьших квадратов, регрессии основных компонентов, статистической линейной классификации и других подобных способов многомерного анализа с использованием расстояния Махаланобиса в качестве критерия для классификации. Приготовление различных видов образцов для анализа одного органа, регистрация спектров в широком диапазоне длин волн с последующей их математической обработкой значительно снижают скорость процесса диагностики злокачественных новообразований. Задачей настоящего изобретения является упрощение реализации способа, сокращение времени проведения диагностирования, расширение возможностей диагностики злокачественного новообразования молочной железы на любой стадии заболевания. Поставленная задача решается тем, что в способе диагностики злокачественного новообразования молочной железы регистрируют в интервале 1720-1600 см-1 инфракрасный спектр обезвоженного среза ткани, предварительно промороженной до -10 С, которая взята из патологического очага, осуществляют деконволюцию полученного спектра, в интервалах 1700-1680 см-1 и 1670-1650 см-1 определяют значения оптических плотностей в максимумах полос поглощения и, если отношение значения оптической плотности максимума полосы поглощения в интервале 1700-1680 см-1 к значению оптической плотности максимума полосы поглощения в интервале 1670-1650 см-1 больше 1,0 и максимум поло 4 13242 1 2010.06.30 сы поглощения смещен от значения 1684 см-1 на 6-15 см-1 в сторону возрастания волновых чисел, диагностируют злокачественное новообразование молочной железы. Предлагаемый способ диагностики злокачественного новообразования молочной железы состоит во взятии фрагмента исследуемой ткани и ее замораживании до -10 С известными в медицине способами, в приготовлении среза из промороженной ткани, помещении его на пластинку, прозрачную в инфракрасном интервале длин волн, например пластинку из флюорита (2), удалении из среза ткани воды любым известным способом и регистрации спектра среза в интервале 1720-1600 см-1. Для разделения зарегистрированного спектрального контура на составляющие с помощью программного обеспечения осуществляется деконволюция спектральной кривой. При этом величину оптической плотности в максимумах поглощения и положения максимумов на спектральной кривой после ее математической обработки в интервалах 1700-1680 и 1670-1650 см-1 используют для диагностирования злокачественного новообразования в тканях молочной железы. Сущность предлагаемого изобретения поясняется чертежами, где На фиг. 1 приведены спектральные кривые срезов тканей молочной железы, взятых непосредственно из патологического очага при дисгормональных процессах (мастопатия) до(сплошная линия) и после их деконволюции (пунктирная линия). На фиг. 2 приведены спектральные кривые срезов тканей молочной железы, взятых непосредственно из доброкачественной опухоли (фиброаденома) до (сплошная линия) и после их деконволюции (пунктирная линия). На фиг. 3 приведены спектральные кривые обезвоженных срезов тканей молочной железы, взятых непосредственно из злокачественной опухоли (инфильтрирующий рак) до(сплошная линия) и после их деконволюции (пунктирная линия). Математически обработанный спектр среза из ткани молочной железы при мастопатии характеризуется тремя полосами поглощения с максимумами 1684, 1658 и 1639 см-1, среди которых наиболее интенсивная полоса находится в интервале 1670-1650 см-1 (фиг. 1). Вычисленная величина отношения оптической плотностив максимуме поглощения в интервале 1700-1680 см-1 к оптической плотности в максимуме поглощения интервала 16701650 см-1 меньше 1,0 и имеет, соответственно, числовое значение 0,32. В математически обработанном спектре среза из ткани молочной железы при фиброаденоме наблюдаются полосы поглощения с максимумами 1688, 1658 и 1639 см-1, среди которых наиболее интенсивная полоса также находится в интервале 1670-1650 см-1(фиг. 2). Измеренная величина отношения оптической плотности в максимуме поглощения в интервале 1700-1680 см-1 к оптической плотности в максимуме поглощения интервала 1670-1650 см-1 имеет, соответственно, числовое значение 0,65. Для математически обработанного спектра среза из злокачественной опухоли характерны сильная полоса поглощения с максимумом в спектральном интервале 1700-1680 см-1 и две полосы меньшей интенсивности с максимумами в спектральных интервалах 16701650 см-1, 1640-1625 см-1. При этом наблюдается смещение максимума полосы поглощения в интервале 1700-1680 см-1 в сторону возрастания волновых чисел от 6 до 15 см-1(фиг. 3). Наблюдается также изменение величины отношения оптических плотностей для анализируемых полос, которое превышает 1,0. Исследуя предложенным способом пробы,взятые из диагностируемой ткани молочной железы, определяют спектроскопическим методом наличие онкологической патологии. Установленная закономерность проявления спектральных признаков срезов из тканей молочной железы позволяет определить взаимно однозначное соответствие между наличием онкологического заболевания диагностируемого органа и принятыми в спектроскопии характеристиками, такими как волновое число, оптическая плотность, а также величинами отношений этих количественных характеристик. Данный способ может быть применен для диагностики злокачественного образования в тканях молочной железы на любой стадии заболевания. 5 13242 1 2010.06.30 Пример 1. Больная ЛМВ. Клинический диагноз фиброаденома молочной железы. Спектр среза из опухоли, помещенного на пластинку из Са 2, зарегистрирован на ИК спектрометрев интервале 4000-1200 см-1. В спектре зарегистрированы полосы поглощения с максимумами 3307, 2957, 2928, 1657, 1545, 1449, 1398 и 1235 см-1. После математической операции деконволюции в спектральном интервале 1700-1600 см-1 выделены три полосы поглощения с максимумами 1685, 1662 и 1635 см-1. Вычисленная величина отношения оптической плотности в максимуме поглощения в интервале 1700-1680 см-1 к оптической плотности в максимуме поглощения интервала 1670-1650 см-1 меньше 1,0 и имеет, соответственно, числовое значение 0,72. Смещение максимума полосы поглощения в интервале 1700-1680 см-1 на 1 см-1 и числовое значение 0,72 отношения оптических плотностей, которое меньше 1,0, свидетельствуют, что опухоль доброкачественная. Пример 2. Больная СЛН. Клинический диагноз инфильтрирующий рак молочной железы. Спектр среза из опухоли, помещенного на пластинку из 2, зарегистрирован на ИК спектрометрев интервале 4000-1200 см-1. В спектре злокачественной опухоли наблюдаются полосы поглощения с максимумами 3309, 2956, 2928, 1643, 1545, 1450, 1399 и 1239 см-1. После математической операции деконволюции в спектральном интервале 1700-1600 см-1 выделены три полосы поглощения с максимумами 1698, 1663 и 1636 см-1. Вычисленная величина отношения оптической плотности в максимуме поглощения в интервале 1700-1680 см-1 к оптической плотности в максимуме поглощения интервала 16701650 см-1 больше 1,0 и имеет, соответственно, числовое значение 1,46. Смещение максимума полосы поглощения в интервале 1700-1680 см-1 в высокочастотную область на 14 см-1 и возрастание в два раза величины отношения оптических плотностей показывают,что диагностируемая опухоль имеет злокачественный характер. Пример 3. Больная ДЕН. Клинический диагноз мастопатия молочной железы. Срез из патологического очага помещали на пластинку из 2 и регистрировали его спектр на ИК спектрометрев интервале 4000-1000 см-1. В спектре молочной железы при мастопатии наблюдаются полосы поглощения с максимумами 3295, 2959, 2925, 1656,1545, 1452, 1399 и 1240 см-1. После математической операции деконволюции в спектральном интервале 1700-1600 см-1 выделены три полосы поглощения с максимумами 1688,1658 и 1639 см-1. Вычисленная величина отношения оптической плотности в максимуме поглощения в интервале 1700-1680 см-1 к оптической плотности в максимуме поглощения интервала 1670-1650 см-1 меньше 1,0 и имеет, соответственно, числовое значение 0,32. Незначительное высокочастотное смещение максимума полосы поглощения на 3 см-1 в интервале 1700-1680 см-1 и числовое значение 0,32 отношения оптических плотностей свидетельствуют, что патологический процесс в тканях молочной железы носит не злокачественный характер. Пример 4. Больная БТИ. Клинический диагноз инфильтрирующий рак молочной железы. Спектр среза из опухоли, помещенного на пластинку из Ва 2, зарегистрирован на ИК спектрометрев интервале 4000-1200 см-1. В спектре наблюдаются полосы поглощения с максимумами 3330, 2958, 2934, 1637, 1547, 1453, 1401 и 1238 см-1. После математической операции деконволюции установлено, что в интервале 1700-1600 см-1 наиболее интенсивна полоса с максимумом 1694 см-1. Вторая по интенсивности полоса поглощения наблюдается в интервале 1640-1625 см-1. В спектральном интервале 1670-1650 см-1 поглощение минимально. Вычисленная величина отношения оптической плотности в максимуме поглощения в интервале 1700-1680 см-1 к оптической плотности в максимуме поглощения интервала 1670-1650 см-1 значительно больше 1,0 и имеет, соответственно,числовое значение 2,16. Смещение максимума полосы в интервале 1700-1680 см-1 в высо 6 13242 1 2010.06.30 кочастотную область на 10 см-1 и значительный рост величины отношения оптических плотностей показывают, что диагностируемая опухоль имеет ярко выраженный злокачественный характер. Пример 5. Больная ИСЕ. Клинический диагноз фиброзно-кистозная мастопатия молочной железы. Спектр среза из опухоли на пластинке из 2 получен на ИК спектрометрев интервале 4000-1200 см-1. В спектре зарегистрированы полосы поглощения с максимумами 3309, 2924, 2853, 1655, 1543, 1457, 1400 и 1236 см-1. После математической операции деконволюции установлено, что в интервале 1700-1600 см-1 наиболее интенсивна полоса с максимумом 1657 см-1. Вторая по интенсивности полоса поглощения наблюдается в интервале 1700-1680 см-1 с максимумом при 1676 см-1. В спектральном интервале 1640-1625 см-1 наблюдается полоса 1634 см-1. Вычисленная величина отношения оптической плотности в максимуме поглощения в интервале 1700-1680 см-1 к оптической плотности в максимуме поглощения интервала 1670-1650 см-1 меньше 1,0 и имеет, соответственно,числовое значение 0,52. Отсутствие смещения в высокочастотную область максимума полосы поглощения в интервале 1700-1680 см-1 и величина отношения оптических плотностей, которая меньше 1,0, свидетельствуют, что патологический процесс в опухоли не злокачественный. Сравнение математически необработанных спектров опухолевидных образований показало, что отличия в спектрах проявляются в смещениях максимумов полос поглощения,величина которых практически не зависит от типа патологии молочной железы. Все диагнозы, приведенные в примерах по предлагаемому способу, подтверждены гистологическими исследованиями. Предлагаемый способ по сравнению с прототипом обладает рядом преимуществ значительно упрощена процедура диагностики онкологического заболевания, поскольку предлагаемый способ является прямым диагностированием злокачественного новообразования и не требует дополнительного приготовления различных образцов и их спектральных исследований для проведения диагностики злокачественного новообразования не требуется сложная математическая обработка данных с применением способов многомерного статистического анализа найденные спектральные признаки диагностирования относятся к онкологическим заболеваниям человека. В результате упрощения способа диагностики злокачественного новообразования исключается использование многих дорогостоящих реактивов для приготовления препаратов из ткани и специальных методик подготовки проб, что приводит к снижению стоимости диагноза, сокращению времени диагностирования и расширению возможностей диагностики злокачественного новообразования молочной железы. Источники информации 1. Угляница К.Н., Луд Н.Г., Угляница Н.К. Общая онкология.- Гродно Гр ГМУ, 2007. 2. Патологоанатомическая диагностика опухолей человека / Под ред. Н.А. Краевского,А.В. Смельянникова, Д.С. Саркисова.- М. Медицина, 1993. 3.... . 5.-, 2002. 4., // . . . .- . 93.- 1996.- . 2557-2563. 5.. . , . 224 (.), 1992, 33-36. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8