Конъюгат фосфолипида с модифицированным нуклеозидом, фармацевтическая композиция и средство, повышающее устойчивость к действию панкреатической фосфолипазы А2

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ КОНЪЮГАТ ФОСФОЛИПИДА С МОДИФИЦИРОВАННЫМ НУКЛЕОЗИДОМ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СРЕДСТВО, ПОВЫШАЮЩЕЕ УСТОЙЧИВОСТЬ К ДЕЙСТВИЮ ПАНКРЕАТИЧЕСКОЙ ФОСФОЛИПАЗЫ А 2(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Литвинко Наталья Михайловна Калиниченко Елена Николаевна Жерносек Елена Владимировна Кучуро Светлана Викторовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Конъюгат фосфолипида с модифицированным нуклеозидом, полученный взаимодействием природного фосфатидилэтаноламина с 2,3-дидезоксицитидином или 9-(2 гидроксиэтокси)метилгуанозином в водном растворе трет-бутилового спирта в присутствии дициклогексилкарбодиимида. 2. Фармацевтическая композиция для повышения устойчивости к действию панкреатической фосфолипазы А 2, включающая конъюгат по п. 1. 3. Применение конъюгата по п. 1 в качестве средства, повышающего устойчивость к действию панкреатической фосфолипазы А 2. Изобретение относится к области биоорганической и фармацевтической химии, в частности к новым биологически активным веществам, а именно к конъюгатам фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот, проявляющих противовирусную и/или противоопухолевую активность, их получению и фармацевтическим композициям на их основе, и обладающим повышенной устойчивостью к панкреатической фосфолипазе А 2. В настоящее время интенсивно исследуется липосомальное наноструктурное инкапсулирование лекарственных средств для лечения ряда заболеваний 1. Эффективность 11905 1 2009.06.30 транспортировки лекарственных средств в таких липидных контейнерах зависит от устойчивости липосом к воздействию различных факторов внутренней среды организма, таких как липолитическая активность плазмы крови или клеточной поверхности, обмен или перенос липидов мембраны липосом на компоненты плазмы или клеточных мембран, воздействие липолитических ферментов лизосом в процессе эндоцитоза и др. 1. При прохождении липосом к органу-мишени через биологическое пространство возможно изменение устойчивости липидной капсулы к действию липолитических ферментов в результате взаимодействия различных белков с заряженной поверхностью фосфолипидов, в частности для фосфолипазы А 2(ФЛА 2, КФ 3.1.1.4) 2. Особый интерес представляют конъюгаты фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот, которые имеют фосфолипидный якорь, необходимый для образования липосомальных контейнеров при доставке нуклеотидов с противовирусными и противоопухолевыми свойствами к пораженным болезнью органам и последующего внедрения в клеточную мембрану. Известны биологически активные конъюгаты фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот 3-7. Описаны способы получения конъюгатов фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот на основе фосфатидовой кислоты 4, 5, 7, диацилглицерина 5 или моно- и диалкилглицерина 5, 6. Для фосфатидилнуклеозидов диалкильного типа 5 описан Н-фосфонатный 3-стадийный метод, состоящий в реакции 1,2-дигексадецилглицерина с треххлористым фосфором, последующей конденсацией с 3-азидо-3-дезокситимидином и 2,3 дидезоксиинозином в присутствии пивалоил хлорида с образованием фосфитдиэфиров,которые окисляются действием йода в пиридине до конечных продуктов. Известен также способ получения нуклеозидсодержащих производных фосфатидилхолина, модифицированных по холиновому фрагменту 4, который осуществляется в две стадии. На первой стадии проводится ферментолиз яичного фосфатидилхолина фосфолипазой . На второй стадии полученная фосфатидовая кислота конденсируется с 3-азидо 3-дезокситимидином в присутствии -толуолсульфохлорида с образованием фосфатидатов 3-азидо-3-дезокситимидина диацильного типа (прототип). Однако известные соединения не охарактеризованы на устойчивость к деградации под действием панкреатической фосфолипазы А 2, что не позволяет создать на их основе устойчивые к действию низкомолекулярных секреторных фосфолипаз А 2 фармацевтические композиции. Задачей настоящего изобретения являются новые конъюгаты природных фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот, способ их получения и фармацевтические композиции на их основе, которые могут проявлять противовирусную и/или противоопухолевую активность и обладают повышенной устойчивостью к панкреатической фосфолипазе А 2. Поставленная задача решается заявляемыми соединениями общей формулы ,а - 2,3-дидезоксицитидил, - 9-(2-гидроксиэтокси)метил-гуанозил (ацикловир). 1, 2 - алкильный остаток жирной кислоты. Указанные соединения представляют собой объединенные в единой молекуле модифицированный компонент нуклеиновой кислоты с противовирусным и противоопухолевым действием и липидную составляющую, что обусловливает их пониженную чувствительность по отношению к активности низкомолекулярных секреторных фосфолипаз А 2. Еще одним объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая конъюгат фосфолипида с модифицированным нуклеозидом, проявляющим противовирусное и/или противоопухолевое действие, в качестве средства,обладающего пониженной чувствительностью к активности панкреатической фосфолипазы А 2. Заявляемая композиция представляет собой новую липосомальную форму противовирусного и противоопухолевого средства нуклеиновой природы, устойчивую к действию секреторной фосфолипазы А 2 поджелудочной железы. Следующим объектом настоящего изобретения является получение заявляемых соединений, заключающееся в нагревании соединения формулы , содержащего первичную аминогруппу,с нуклеозидом, выбранным из 2,3-дидезоксицитидина, ацикловира, в водном растворе трет-бутилового спирта в присутствии дициклогексилкарбодиимида. В предпочтительном варианте осуществления заявляемого способа процесс ведут в интервале температур 30-100 С при 6,5-9 с использованием трет-бутилового спирта,содержащего 10-50 воды. Способ иллюстрируется нижеприведенной схемой. а - 2,3-дидезоксицитидил, - 9-(2-гидроксиэтокси)метил-гуанозил (ацикловир). 1, 2 - алкильный остаток жирной кислоты. Выходы целевых продуктов (, ) после хроматографического деления на силикагеле составляют 60 . Заявляемый способ позволяет легко вводить разнообразные нуклеозидные заместители в полярную часть молекулы фосфолипида и тем самым упростить получение конъюгатов фосфолипидов с компонентами нуклеиновых кислот. Приведенные ниже примеры получения заявляемых соединений подтверждают возможность осуществления изобретения, не ограничивая его объем. Пример 1 Конденсация 5-монофосфата 2,3-дидезоксицитидина (а) с фосфатидилэтаноламиномК суспензии 31 мг (0,107 ммоль) 2,3-дидезоксицитидин-5-монофосфата (а) в 7 мл смеси трет-бутиловый спиртвода (41, об) добавляют 65 мг (0,092 ммоль) фосфатидилэтаноламина , после чего к реакционной смеси прибавляют 50 мг (0,243 ммоль) дициклогексилкарбодиимида . Реакционную смесь перемешивают при нагревании до 6570 С в течение 6 часов, после чего добавляют еще 20 мг (0,028 ммоль) фосфатидилэтаноламина и 10 мг (0,049)и нагревают затем в течение 5 часов при той же температу 4 11905 1 2009.06.30 ре при перемешивании на магнитной мешалке. По окончании реакции реакционную смесь выпаривают, наносят на колонку с силикагелем и элюируют смесью хлороформметанолвода при соотношении 100100,5, 1061 и 1081. Фракции, содержащие продукт, выпаривают. Получено 23 мг (21,6 ). Пример 2 Конденсация 9-(гидроксиэтилоксиметил)гуанин монофосфата (ацикловир монофосфата)с фосфатидилэтаноламиномК суспензии 20 мг (0,066 ммоль) 9-(гидроксиэтилоксиметил)гуанин монофосфата в 4 мл смеси третбутиловый спиртвода (41) добавляют 50 мг (0,071 ммоль) фосфатидилэтаноламина , после чего к реакционной смеси добавляют 50 -й раствор триэтиламина до 7 и 30 мг (0,145 ммоль) дициклогексилкарбодиимида . Реакционную смесь перемешивают при нагревании до 65-70 С в течение 6 часов, после чего добавиляют еще 20 мг (0,028 ммоль) фосфатидилэтаноламина и 10 мг (0,049)и нагревают затем в течение 5 часов при той же температуре при перемешивании на магнитной мешалке. По окончании реакции реакционную смесь выпаривают, наносят на колонку с силикагелем и элюируют смесью хлороформметанолвода при соотношении 100100,5,1061 и 1081. Фракции, содержащие продукт, выпаривают. Получено 18 мг (24 ) 9(гидроксиэтилоксиметил)гуанин монофосфат фосфатидилэтаноламин -фосфорамидата . Структуры химерных соединений 1, 1, подтверждены (таблица) совокупностью физико-химических данных (УФ, ПМР, ЯМР Р 31). Таблица 1 Физико-химическая характеристика соединений ,Шифр 1 а Биологическое действие заявляемых соединений подтверждено тестированиемс использованием панкреатической ФЛА 2, результаты которого приведены в разделе Исследование антифосфолипазной биологической активности. Исследование биологической активности При проведении реакции липолиза максимальная доступность субстрата для фермента обеспечивается в случае использования фосфолипидов в мицеллярной фазе, сформированной детергентами, которые рассматриваются как неизменная матрица, поскольку не гидролизуются фосфолипазами 9. В связи с этим для определения устойчивости синтезированных химерных субстратов к атаке ФЛА 2 используют мицеллярную фазу, сформированную конъюгатами и детергентами. Смешанные мицеллы получают солюбилизацией раствором детергента пленки, образующейся после удаления растворителя из раствора фосфатидилэтаноламина, ФЭА (или конъюгата) в хлороформе. Смешанные мицеллы готовят включением ФЭА (или конъюгата) в фазу поверхностно-активных веществ - дезоксихолата натрия (ДОХ, анионный детергент при оптимальном соотношении 12) и тритона-Х-100 (ТХ, неионный детергент при оптимальном соотношении 18). Диметилсульфоксид (ДМСО) добавляют к 0,05 М трис-,7,4 - 110 соответственно. Соединения 1(,) вносят в виде раствора в хлороформе и упаривают. Реакционная смесь содержала субстрат (0,51 мкмоль), 2 мМ 2 и 0,05 М трис-,7,4. Реакцию гидролиза смешанных мицелл фосфолипида или конъюгата 1(,) начинают добавлением 5 11905 1 2009.06.30 в среду при 37 С раствора ФЛА 2 поджелудочной железы (0,06 ед./мл) и останавливают добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ, упаривали пробу при 40 С. Продукты реакции анализируют с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей хлороформ/метанол/вода 1061. Пластины проявляют реагентом на фосфолипиды 10, пятна фосфолипида, конъюгата и их лизопроизводных выскребают и анализируют в них содержание фосфора по методу, описанному в работе 10. За единицу активности фермента принимают количество ФЛА 2 поджелудочной железы, катализирующее образование 1 мкмоль продукта / мин 37 С. На основе изменения скорости гидролиза ФЭА или конъюгатов 1(а) , (мкмольмин-1 мг-1) в мицеллярной фазе под действием ФЛА 2 обнаружено, что на всем временном интервале скорость гидролиза конъюгата 1 по сравнению с ФЭА была существенно ниже за три часа ФЛА 2 яда змеи гидролизует 80 ФЭА и 305 этил-2-(1,2-диацилглицеро 3-фосфо)-фосфоамидат-2,3-дидезоксицитидина (1 а), скорость гидролиза (мкмольмин-1 мг-1) составила соответственно 0,11, и 0,04 (таблица 2). Таблица 2 Гидролиз под действием ФЛА 2 яда змеи фосфатидилэтаноламина и конъюгата 1(а) Общий гидроСкорость гидролиза,Субстрат Относительная скорость лиз,мкмольмин-1 мг-1 ФЭА 80 0,11 1 30 0,04 0,31 1 На фиг. 1 представлена зависимость скорости гидролиза под действием ФЛА 2 поджелудочной железы свиньи фосфатидилэтаноламина в мицеллярной фазе, сформированной дезоксихолатом натрия (ось ординат, , мкмольмин-1 мг-1), от времени (ось абсцисс, ,мин). Скорость гидролизавыражена в количестве образовавшегося продукта реакции(мкмоль) в единицу времени (мин) на мг белка. Изменение во времени скорости гидролиза(, мкмольмин-1 мг-1) природного субстрата ФЭА (верхняя кривая) и модифицированного фосфолипида 5 этил-2-(1,2-диацилглицеро-3-фосфо)-фосфоамидат-ацикловира(1, нижняя кривая) в условиях насыщения фермента субстратом показывает, что относительная скорость реакции модифицированного субстрата в сравнении с природным ФЭА для последовательных временных точек 2,5 и 10 мин в среднем составляет 0,33, 0,34 и 0,24 соответственно. Таким образом, модифицированный субстрат разрушается ферментом втрое с более низкой скоростью, чем природный фосфолипид. Общий объем реакционной смеси 1 мл. Учитывая то, что степень гидролиза модифицированного субстрата 1 за исследованный промежуток времени до 24 час практически не меняется и составляет не более 30 от исходного, 5 этил-2-(1,2-диацилглицеро-3-фосфо)-фосфоамидатацикловир используют для формирования липосом, как примера создания формы лекарственного средства нового поколения, которая сочетает одновременно компонент нуклеиновых кислот, обладающий противовирусными свойствами (ацикловир), с липидной составляющей новой лекарственной формы. Создание липосом из 5 этил-2-(1,2-диацилглицеро-3-фосфо)фосфоамидат-ацикловира Для получения липосом из конъюгата пуриновых нуклеозидов с фосфолипидами (2,6 мкмоль) хлороформ, в котором растворяют фосфолипиды, упаривают на роторном испарителе. Остатки растворителя удаляют в течение 30 мин с помощью вакуумного насоса. К образовавшейся фосфолипидной пленке добавляют 0,05 М трис- буфер 7,4 до получения конечной концентрации субстрата 1,3 мМ. Полученную эмульсию обрабатывают ультразвуком 5 раз по 0,5 мин с перерывом в 1 мин с помощью УЗДН-2 Т (22 к, 20). К полученным липосомам добавляют 2 до концентрации 2 мМ. 6 11905 1 2009.06.30 На фиг. 2 представлены электронные микрофотографии липосом (обозначены темным цветом), полученные с помощью электронного микроскопа -100 без контрастного вещества методом нанесения препарата на пленку-подложку форм-вара. Размеры липосом, представленных на фиг. 2, составляют 180-200 нм. Исследование устойчивости липосом из 5 этил-2-(1,2-диацилглицеро-3 фосфо)-фосфоамидат-ацикловира к действию панкреатической ФЛА 2 Устойчивость конъюгатов пуриновых нуклеозидов с фосфатидилэтаноламином к ферментативной деградации устанавливают их обработкой ФЛА 2 поджелудочной железы в течение от 5 мин до 3 часов, что моделирует воздействие липолитических ферментов при прохождении таких химерных липосом через биологическое пространство. Реакцию гидролиза липосом из 5-Оэтил-2-(1,2-диацилглицеро-3-фосфо)фосфоамидат-ацикловира под действием панкреатической ФЛА 2 начинают внесением в реакционную среду 12,75 мкг/мл фермента и проводят при 37 С. Реакцию останавливают добавлением раствора ЭДТА до конечной концентрации 5,4 мМ. Продукты реакции упаривают при 40 С. Конъюгат и его лизо-форму разделяют методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) в системе хлороформ-метанол-вода 1061. Фосфолипиды проявляют с помощью реактива Васьковского 10. Конъюгат ацикловир-5-монофосфата с фосфатидилэтаноламином в виде липосом практически не гидролизуется ФЛА 2 поджелудочной железы в течение 30 мин. На фиг. 3 представлены результаты выявления устойчивости липосом, сформированных из конъюгата (светлые столбики), по сравнению с липосомами из природного фосфатидилэтаноламина (темные столбики), при атаке ФЛА 2 поджелудочной железы в течение часа (левые два столбика) и трех часов (правые два столбика). Устойчивость определяют как степень гидролиза, выраженную в(ось абсцисс), во времени (ось ординат, час) гидролиз конъюгата 1 за 60 мин происходит на 184 , в то время как деградация липосом из фосфатидилэтаноламина к этому времени достигает максимально возможной - 608 за 3 часа ферментативный гидролиз конъюгата ( 7,4,37 С) осуществляется на 30 . Источники информации 1. Грегориадис Г. Липосомы в биологических системах. - М. Медицина, 1983. - С. 3693. 2. Литвинко Н.М., Шумилина Т.А., Наубатова М.К., Ахрем А.А. Изучение устойчивости липосом как потенциальных переносчиков лекарственных веществ к действию фосфолипазы А 2 // Прикладная биохимия и микробиология. - 1993. - Т. 29, вып 3. - С. 478-484. 3..,,Т. Т.. -3.151,2 151,2- // - 1982. - . 25. - . 1322-1329. 4. Водовозова Е.Л., Павлова Ю.Б., Полушкина М.А., Ржанинова А.А., Гараев М.М.,Молотковский Юл.Г. Новые фосфолипиды - ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека. Синтез и антивирусная активность //Биоорг. химия.- 1996. - Т.32,6. С. 451-457 (прототип). 5..,.,.,Т.,.92-// - 1999. - 7. - . 1195-1200. 6. Фещенко Л.Л, Барай В.Н., Кисель М.А., Зинченко А.И., Михайлопуло И.А. Субстратные свойства модифицированных нуклеозидов в реакции трансфосфатидилирования,катализируемой фосфолипазой/ //Материалы Межд. Конференции 7 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8