Способ количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов в корневищах с корнями синюхи

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММЫ ТРИТЕРПЕНОВЫХ САПОНИНОВ В КОРНЕВИЩАХ С КОРНЯМИ СИНЮХИ(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Голяк Юрий Альбертович Хишова Ольга Михайловна Кухарева Лидия Васильевна(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(57) Способ количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов в корневищах с корнями синюхи, заключающийся в том, что навеску измельченного сырья с размером частиц не более 1 мм очищают путем двукратной экстракции хлороформом, очищенное сырье дважды экстрагируют 40 -ным этиловым спиртом при соотношении сырья и экстрагента 1(30-100), полученное извлечение очищают от гидрофильных веществ элюированием через колонку с обращенно-фазовым сорбентом Диасорб-100-С 16, полученный элюат упаривают досуха, к остатку добавляют концентрированную серную кислоту, термостатируют при 70 С в течение 60 мин, охлаждают, измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 321 нм и рассчитывают содержание суммы тритерпеновых сапонинов по формуле А 10025 10 100,Х 1 Е 1 см 1 2(100) где Х - содержание суммы тритерпеновых сапонинов,А - оптическая плотность исследуемого раствора, , 1 см - удельный показатель поглощения продукта взаимодействия -эсцина с концен 1 трированной серной кислотой, равный 421, - масса навески сырья синюхи, г, - содержание влаги в сырье синюхи, . 12568 1 2009.10.30 Изобретение относится к области фармации, а именно к способу количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов (ТС) в корневищах с корнями синюхи. Химическая структура некоторых ТС выражается формулой 30 Корневища с корнями синюхи включены в Государственную фармакопею одиннадцатого издания (ГФвып. 2, ст. 74). Действующая нормативная документация на корневища с корнями синюхи предусматривает определение экстрактивных веществ,извлекаемых водой 1. Постоянно повышающиеся требования к качеству растительного сырья и лекарственных средств на его основе вызывают необходимость количественной оценки содержания основных биологически активных веществ (БАВ). Основными БАВ корневищ с корнями синюхи, отвечающими за отхаркивающее действие и седативный эффект, являются ТС 2. 12568 1 2009.10.30 Прототипа предлагаемого способа определения суммы ТС в корневищах с корнями синюхи не выявлено. Задачей изобретения является количественная оценка содержания суммы ТС в корневищах с корнями синюхи. Данная задача решается предварительной очисткой корневищ с корнями синюхи от сопутствующих гидрофобных веществ с помощью хлороформа, двукратным извлечением ТС спиртом этиловым 40 , очисткой полученного извлечения от сопутствующих гидрофильных веществ твердофазной экстракцией на колонке с обращенно-фазовым сорбентом Диасорб-100-С 16, проведением реакции очищенного извлечения с концентрированной серной кислотой и измерением оптической плотности при длине волны 321 нм. Расчет со держания суммы ТС проводят, используя удельный показатель поглощения ( 1 см ) 1 продукта взаимодействия -эсцина с концентрированной серной кислотой, значение которого составляет 421. В качестве стандарта при разработке использован спиртовой раствор рабочего стандартного образца (РСО) -эсцина, так как максимумы поглощения эсцина и суммы ТС корневищ с корнями синюхи после реакции с концентрированной серной кислотой одинаковы и соответствуют 3212 нм. Данные расчета удельного показателя поглощения продукта взаимодействия -эсцина с концентрированной серной кислотой представлены в табл. 1. Таблица 1 Концентрация раствора,Оптическая плотность рас- Удельный показатель по твора (А) глощения ( 1 см ) 1 0,000116 0,062 362 0,000232 0,084 362 0,000348 0,149 428 0,000464 0,188 405 0,000696 0,289 415 0,000928 0,376 405 0,001160 0,486 419 0,001392 0,573 412 0,001620 0,687 424 0,001856 0,776 418 Среднее значение удельного показателя поглощения продукта взаимодействия эсцина с концентрированной серной кислотой составляет 421. Способ количественного определения суммы ТС в корневищах с корнями синюхи осуществляется следующим образом 1,0 г (точная навеска) измельченных корневищ с корнями синюхи, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 50 мл хлороформа. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Горячее хлороформное извлечение процеживают через вату так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Вату помещают в колбу для извлечения, прибавляют 50 мл хлороформа и извлекают ТС на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Извлечение процеживают через вату, не допуская попадания частиц сырья на фильтр. Хлороформное извлечение отбрасывают. Вату помещают в колбу для извлечения, прибавляют 30 мл спирта этилового 40 и извлечение ТС продолжают в течение 30 мин. Извлечение процеживают через вату в мерную колбу на 100 мл так, чтобы частицы сырья не попадали на фильтр. Вату помещают в колбу для извлечения и прибавляют 30 мл спирта этилового 40 . Процесс извлечения повторяют еще раз в описанных выше условиях, процеживая извлечение в ту же мерную 12568 1 2009.10.30 колбу. После охлаждения объем извлечения доводят спиртом этиловым 40 до метки и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят водой очищенной до метки (раствор Б). Готовят колонку с сорбентом 0,2 г сорбента Диасорб-100-С 16 с диаметром частиц сорбента 63-200 мкм (ТУ 2641-003-49299217-01) вносят в полипропиленовый патрон с внутренним диаметром 10 мм, в нижнюю часть которого помещают стекловату. Добавляют 0,3 мл спирта этилового 96 . Оставляют на 15 мин, промывают 5 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Скорость регулируют при помощи вакуумной системы. 2 мл раствора Б наносят на колонку, заполненную Диасорб-100-С 16. Промывают под вакуумом 5 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Водный элюат отбрасывают. Сумму ТС элюируют 2 раза по 0,5 мл спирта этилового 96 в пробирку с притертой пробкой вместимостью 20 мл. Спиртовой элюат упаривают досуха, к остатку добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты. Термостатируют при 70 С в течение 60 мин и после охлаждения измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 321 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм на фоне контрольного опыта. Контрольный опыт проводят следующим образом подготовленную колонку с сорбентом Диасорб-100-С 16 промывают под вакуумом 5 мл воды очищенной со скоростью 1 мл/мин. Водный элюат отбрасывают и колонку промывают 1 мл спирта этилового 96 в пробирку с притертой пробкой вместимостью 20 мл. Спиртовой элюат упаривают, добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты. Термостатируют при температуре 70 С в течение 60 мин. Охлаждают. Содержание суммы ТС в пересчете на -эсцин и абсолютно сухое сырье в процентах вычисляют по формуле А 10025 10 100,Х 1 Е 1 см 12(100) где А - оптическая плотность исследуемого раствора, , 1 см - удельный показатель поглощения продукта взаимодействия -эсцина с концен 1 трированной серной кислотой, равный 421, - масса навески сырья синюхи, г, - содержание влаги в сырье синюхи, . В табл. 2 приведены результаты определения суммы ТС в корневищах с корнями синюхи в 5 сериях сырья и статистическая обработка полученных результатов. Таблица 2 Результаты количественного определения ТС в корневищах с корнями синюхи(5,95 ) Серия Содержание суммы ТС Статистическая обработка 10,7410,87 20,0598 11,170,2445 10,78 10,1093 10,580,3 11,072,7910,8910,45 20,1685 10,020,4105 2 10,760,1836 10,570,51 10,024,884 11,83 12,09 Примечание.- средний результат определения 2 - дисперсия- величина стандартного отклонения- стандартное отклонение среднего результата- полуширина доверительного интервала среднего результата- относительная ошибка среднего определения. Отсутствие систематической ошибки разработанной методики доказано опытами с добавками эсцина к испытуемому раствору, результаты которых представлены в табл. 3. Таблица 3 Результаты опытов с добавками (5,95 ) Найдено Добавлено Рассчитанное коОшибка Найдено сумсуммы ТС, -эсцина, личество суммы Абсолютная, Относительмы ТС, мкг мкг ТС, мкг мкг мкг ная,74,5 37,12 112,62 108,74-1,00 74,5 74,24 148,74 152,83 4,09 2,75 Изучено влияние времени и температуры термостатирования на оптическую плотность (А) продуктов реакции суммы ТС с концентрированной серной кислотой. Результаты представлены в табл. 4. Таблица 4 Условия реакции суммы ТС корневищ с корнями синюхи с концентрированной серной кислотой (3) Оптическая плотность (А) Время, мин 60 С 70 С 80 С 90 С 20 0,153 0,219 0,278 0,309 40 0,273 0,317 0,342 0,337 60 0,304 0,362 0,358 0,358 80 0,332 0,358 0,342 0,331 100 0,325 0,365 0,344 0,309 120 0,325 0,359 0,336 0,308 5 12568 1 2009.10.30 Как видно из данных, представленных в табл. 4, значение оптической плотности достигает максимума в течение 60 мин при температурах 70 С, 80 С, 90 С. Минимальная температура, при которой наблюдается максимальное значение оптической плотности через 60 мин, составляет 70 С. Поэтому оптическую плотность анализируемого раствора измеряют после термостатирования в сушильном шкафу при 70 С в течение 60 мин. Для выбора оптимальных условий извлечения проводят исследование по определению влияния на полноту извлечения таких факторов, как 1. Природа экстрагента (вода очищенная, спирт этиловый 20 , спирт этиловый 40 ,спирт этиловый 70 , спирт этиловый 96 ) 2. Размер частиц сырья (0,5-1,0 мм, 1,0-2,0 мм, 2,0-3,0 мм, 3,0-5,0 мм) 3. Соотношение сырье экстрагент (1100, 150, 130, 115) 4. Влияние числа экстракций (1, 2, 3, 4 раза). Таблица 5 Зависимость полноты извлечения суммы ТС от природы экстрагента (5, Р 95 ) Природа экстрагента,Вода очищенная 10,290,62 Спирт этиловый 2010,880,46 Спирт этиловый 4011,800,51 Спирт этиловый 7010,440,44 Спирт этиловый 964,840,38 Как видно из данных, представленных в табл. 5 эффективность извлечения наибольшая при использовании спирта этилового 40 . Поэтому в методике количественного определения ТС извлекают спиртом этиловым 40 . Таблица 6 Зависимость влияния полноты извлечения суммы ТС от размеров частиц сырья(5,95 ) Степень измельчения, мм,0,5-1,0 11,940,50 1,0-2,0 11,800,51 2,0-3,0 11,420,48 3,0-5,0 10,780,57 Как видно из данных, представленных в табл. 6, с увеличением размера частиц выход суммы ТС уменьшается. Поэтому в методике количественного определения исследуемое сырье измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм. Таблица 7 Зависимость полноты извлечения суммы ТС от соотношения сырье экстрагент(5,95 ) Соотношение сырье экстрагент,115 7,960,34 130 9,770,44 150 9,950,32 1100 9,990,42 Как видно из данных, представленных в табл. 7, при соотношении сырье экстрагент 130, 150, 1100 выход суммы ТС максимален. 12568 1 2009.10.30 Таблица 8 Зависимость полноты извлечения суммы ТС от кратности извлечения (5,95 ) Число экстракций Извлечено тритерпеновых сапонинов,,1 9,740,42 74,4 2 2,410,18 18,5 3 0,640,04 4,9 4 0,290,03 2,2 Из данных, представленных в табл. 8, следует, что при двукратном извлечении выход ТС составил 92,9 , третье и четвертое извлечения оказались менее эффективными, так как выход ТС составляет 7,1 . Поэтому в методике количественного определения ТС извлекают дважды. Предлагаемый способ количественного определения позволяет определять основные биологически активные вещества - сумму ТС в корневищах с корнями синюхи с малой затратой реактивов и сорбента, хорошей воспроизводимостью, не требует применения дорогих стандартных образцов для его выполнения, так как расчет суммы ТС проводят, ис пользуя удельный показатель поглощения ( 1 см ) продукта взаимодействия -эсцина с 1 концентрированной серной кислотой. Источники информации 1. Государственная фармакопея СССРиздания В 2 т. / МЗ СССР. - М. Медицина,1987. - Вып. 2 Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. - 400 с. 2. Соколов С.Я., Замотаев И.П. Справочник по лекарственным растениям. - 3-е изд. М. Медицина, 1990. - 464 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7