Смесь дефибротида и G-CSF и ее применение для активирования гематопоэтических предшественников

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СМЕСЬ ДЕФИБРОТИДА И - И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ АКТИВИРОВАНИЯ ГЕМАТОПОЭТИЧЕСКИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ(57) 1. Композиция для увеличения количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клеток-предшественников в периферической крови млекопитающего, содержащая в качестве активных ингредиентов дефибротид и гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники. 2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, представляет собой -. 3. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что представляет собой водный раствор. 4. Композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что содержит фармацевтически приемлемый эксцепиент и/или адъювант. 5. Комбинированный препарат для увеличения количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клеток-предшественников в периферической крови млекопитающего,содержащий в качестве активных ингредиентов дефибротид и гематопоэтический фактор,обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники,для одновременного или раздельного последовательного введения указанных активных ингредиентов. 6. Препарат по п. 5, отличающийся тем, что гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, представляет собой -. 7. Препарат по п. 5 или 6, отличающийся тем, что содержит фармацевтически приемлемый эксцепиент и/или адъювант. 8. Применение дефибротида и гематопоэтического фактора, обладающего способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, для получения композиции, способной увеличить количество стволовых клеток и/или гематопоэтических клетокпредшественников в периферической крови млекопитающего. 9. Применение по п. 8, отличающееся тем, что гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, представляет собой -. 10111 1 2007.12.30 10. Способ увеличения количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клетокпредшественников в периферической крови млекопитающего, отличающийся тем, что млекопитающему вводят дефибротид в комбинации или в непосредственной временной близости с гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники. 11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что в качестве гематопоэтического фактора,обладающего способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники,используют -. 12. Способ по п. 10 или 11, отличающийся тем, что - вводят в количестве от 5 до 24 мкг/кг, а дефибротид вводят путем непрерывной инфузии в количестве от 5 до 15 мг/кг в час в течение 2-7 суток. Настоящее изобретение относится к области медицины и, в частности, композиции,способной увеличивать количество стволовых клеток и клеток-предшественников в циркуляции периферической крови у млекопитающих. Предложенная композиция отличается тем, что она содержит дефибротид в комбинации, по меньшей мере, с одним гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтические клеткипредшественники, предпочтительно -. Возможность получения повышенного количества стволовых клеток и клеток-предшественников в циркуляции периферической крови у млекопитающих, и, в частности, у человека, в течение многих лет была предметом интенсивных исследований. Доступность стволовых клеток и/или клеток-предшественников является очень важной в таких областях,как аутогенная трансплантация циркулирующих клеток-предшественников, аллотрансилантация циркулирующих клеток-предшественников и генная терапия циркулирующих гематопоэтических клеток. Хотя после рождения стволовые клетки и клетки-предшественники находятся почти исключительно в костном мозге, тем не менее, они обладают миграционными свойствами то есть иными словами, в физиологических условиях они мигрируют через полости костного мозга и вовлекаются в циркуляцию. Этот процесс, обычно известный как активация,может быть усилен у млекопитающих за счет различных обработок, таких как например,введение цитокинов, и в особенности фактора роста колоний гранулоцитов (-). Обратный процесс, известный как хоминг, происходит, например, у облученных реципиентов после трансплантации гематопоэтических клеток. Однако механизм, лежащий в основе активации и хоминга, остается еще неясным. ( .4--// . - . 90. -12. - 1997. - . 4779-4788. .4// . . . - . 101. -11. - 1998. - . 2456-2467. .. - . - . 92. -3. - 1998. - . 894-900). Фактор - (регистрационный номер 143011-2-7/ , 1996, стр. 4558) представляет собой гематопоэтический фактор роста, который незаменим при пролиферации и дифференциации клеток-предшественников гранулоцитов. Он является гликопротеином с молекулярной массой 18-22 кД и обычно образуется в ответ на специфическую стимуляцию под действием множества клеток, включающих моноциты, фибробласты и эндотелиальные клетки. Термин дефибротид(регистрационный номер 83712-60-1) означает полидезоксирибонуклеотид, полученный экстракцией ( 3770720 и 3899481) животных и/или растительных тканей. Обычно этот полидезоксирибонуклеотид применяется в виде соли щелочного металла, обычно натрия. Дефибротид обычно используют в связи с его антитромботической активностью ( 3829567), хотя его можно применять и в 2 10111 1 2007.12.30 других областях например при лечении острой почечной недостаточности ( 4694134) и острой ишемической болезни миокарда ( 4693995). Наконец, в 4985552 и 5223609 описан способ получения дефибротида, который обеспечивает получение продукта с постоянными и хорошо определенными физико-химическими свойствами, не обладающего каким-либо побочным эффектам. В контексте настоящего изобретения термин дефибротид означает любой олигонуклеотид и/или полинуклеотид, полученный экстракцией животных и/или растительных тканей,в частности органов млекопитающих. Предпочтительно дефибротид получают в соответствии со способами, описанными в указанных выше патентах, которые, таким образом,необходимо рассматривать как составную часть настоящего изобретения. Еще более предпочтительно дефибротид получают согласно способам, описанным в патентах США 4985552 и 5223609. В настоящем изобретении неожиданно было обнаружено, что активацию стволовых клеток и клеток-предшественников можно увеличить путем введения дефибротида в комбинации и/или в непосредственной временной близости с гематопоэтическим фактором,обладающим способностью активировать гематопоэтически клетки-предшественники. Как можно будет оценить из примеров, введение дефибротида в комбинации и/или в непосредственной временной близости с гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, позволяет достичь гораздо более высокой степени активации, чем в случае введения одного гематопоэтического фактора. Следовательно, предмет настоящего изобретения включает композицию, содержащую в качестве активных ингредиентов дефибротид в комбинации, по меньшей мере, с одним гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, предпочтительно -. В предпочтительном варианте осуществления предложенная композиция представляет собой водный раствор для инъекции альтернативно композиция может представлять собой два различных раствора, один из которых содержит дефибротид, а другой гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники. Поэтому композиция, согласно настоящему изобретению, имеет форму объединенного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения указанных выше активных ингредиентов для увеличения количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клеток-предшественников в циркуляции в периферической крови млекопитающих. Второй аспект настоящего изобретения включает применение дефибротида в комбинации, по меньшей мере, с одним гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, для получения композиций,способных увеличить количество стволовых клеток и/или гематопоэтических клетокпредшественников в циркуляции в периферической крови млекопитающих, в частности человека. Наконец, еще один предмет настоящего изобретения включает способ увеличения количества стволовых клеток и/или гематопоэтических клеток-предшественников в циркуляции в периферической крови млекопитающих, заключающийся в введении - дефибротида в комбинации и/или в непосредственной временной близости, по меньшей мере, с одним гематопоэтическим фактором, обладающим способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники. В качестве гематопоэтического фактора, используемого при разработке настоящего изобретения, был использован другими -. Однако не исключено, что аналогичные результаты могут быть получены с гематопоэтическими факторами, отличающимися от -, которые тем не менее обладают способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, например, такими как фактор роста колоний гранулоцитов и макрофагов (-), 3 лиганд 3 , фактор стволовых клеток , тромбопоэтин (ТРО), интерлейкин 8 (-8), и другие, что без сомнения ясно для специалистов в этой области техники. 3 10111 1 2007.12.30 В качестве дефибротида, применяемого в комбинации с - на первой экспериментальной стадии, был использован дефибротид, выпускаемый фирмойпод товарным знаком , полученный согласно способу, описанному в 4985552 и 5223609. Что касается способов введения этих двух активных компонентов, они не ограничиваются для задач настоящего изобретения. Иными словами, дефибротид и гематопоэтический фактор, обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники, можно вводить млекопитающим (и, в частности, человеку) в соответствии со способами и позологией, которые известны в этой области техники. Обычно их вводят перорально, внутримышечно, внутрибрюшинно, подкожно или внутривенно, причем последний способ является предпочтительным. Кроме того, эти два активных ингредиента могут быть введены одновременно или последовательно. Иными словами, в первом случае их вводят в виде простой композиции,которая содержит оба активных ингредиента и в которую необязательно, но можно добавить обычные лекарственные эксцепиенты и/или адъюванты, известные в этой области. Альтернативно, оба активных компонента можно вводить последовательно, а именно в виде двух различных композиций, одна из которых содержит гематопоэтический фактор,обладающий способностью активировать гематопоэтические клетки-предшественники,предпочтительно -, а другая содержит дефибротид. Обычно - вводят подкожно в количестве от 5 до 24 мкг/кг, в то время как дефибротидвводят путем непрерывного вливания в количестве от 5 до 15 мг/кг в час в течение 2-7 суток. Как можно будет оценить из приведенных примеров, которые следует рассматривать только как иллюстрации, не ограничивающие это изобретение, введение - в комбинации с дефибротидом мышам, которые являются наиболее распространенной экспериментальной моделью млекопитающих, и обезьянам позволяет достичь гораздо более высокой степени активации, чем в случае введения одного -, с четкими преимуществами для всех тех областей терапии, где желательным является высокий уровень активации. На фиг. 1 показана кинетика числа лейкоцитов . На фиг. 2 показано число клеток, образующих колонии , в периферической крови. На фиг. 3 показана частота клеток, образующих колонии , в периферической крови. На фиг. 4 показаны уровнина 5 сутки терапии. На фиг. 5 показана доляна 5 сутки терапии. На фиг. 6 показана кинетика клеток, стимулирующих колонии с высокой пролиферативной активностью (-). Пример 1. Этот эксперимент проводят для того, чтобы оценить влияние от введения - и/или дефибротида на число лейкоцитов , присутствующих в крови мышей. Мышам / в возрасте от 6 до 8 недель с массой тела от 20 до 25 г внутрибрюшинноинъекцировали - (5 мкг/мышь в сутки), дефибротид (1 мг/мышь в сутки) или - (5 мкг/мышь в сутки) в комбинации с возрастающими дозами дефибротида(1, 10, 15 мг/мышь в сутки). Контрольной группе мышей, не получавший - или дефибротид, внутрибрюшинно инъецировали , содержащий до 1 мышиного сывороточного альбумина (/). Мышей обрабатывают в течение 5 суток и умерщвляют через 3 или 5 суток обработки, или через 3 суток после прекращения терапии. Результаты этого эксперимента приведены на фиг. 1. Для представления каждой группы мышей использованы следующие символы -(24), дефибротид 1 (о) (3),-дефибротид 1(13), -дефибротид 10(6), -дефибротид 15(23). Среднее число лейкоцитов для контрольной группы мышей (/) со 4 10111 1 2007.12.30 ставляло 2,870,2106/мл крови данные выражены как средняя величинастандартная ошибка среднего . Пример 2. Кинетика активации клеток, образующих общие колонии , в 1 мл крови мышей из примера 1. Среднее число клетокв / для контрольной группы мышей составляло 3912 на 1 мл крови данные приведены на фиг. 2 и выражены как средняя величинастандартная ошибка среднего , которые получены из дублированных культур на образцах для каждого животного в данный момент времени. Пример 3. Изменения частоты суммарного количества клеток, образующих общие колонии(----) на 105 клеток, покрытых слоем кровяного сгустка периферической крови, у мышей, упомянутых в примере 1. Среднее число клетокв / для контрольной группы мышей составляло 3,51 данные приведены на фиг. 3 и выражены как средняя величинастандартная ошибка среднего , которые получены из дублированных культур на образцах из каждого животного в данный момент времени. Пример 4. Суммарное число клеток, образующих общие колонии (---) на 1 мл крови через 5 суток обработки мышей из примера 1 данные приведены на фиг. 4 и выражены как средняя величинастандартная ошибка среднего, которые получены из дублированных культур на образцах из каждого животного. Пример 5. Частота суммарного количества клеток, образующих общие колонии (---) для 105 клеток, покрытых слоем кровяного сгустка периферической крови, у мышей, упомянутых в примере 1 данные приведены на фиг. 5 и выражены как средняя величинастандартная ошибка среднего , которые получены из дублированных культур на образцах из каждого животного. Пример 6. Этот эксперимент проводят для того, чтобы оценить влияние от введения - и/или дефибротида на количество гематопоэтических клеток-предшественников/стволовых клеток(клетки, стимулирующие колонии с высокой пролиферативной активностью или -) в циркуляции в периферической крови обезьян. Исследование проводили на макак-резусах(Масаса ) в возрасте 4-6 лет, имеющих хорошее здоровье и нормальные показатели гематологии и клинической химии. Фактор - вводили подкожно, 100 мкг/кг, в течение 5 суток, в двух циклах. Дефибротид вводили со скоростью 15 мкг/кг в час с помощью системы непрерывной инфузии в течение 5 суток, на втором цикле. Животных подвергали анестезии для забора крови, введения - и смены пакета лекарств. Результаты этого эксперимента приведены на фиг. 6, из которой можно оценить, что введение - в комбинации с дефибротидом обеспечивает уровень активации - у обезьян, который приблизительно в 8 раз выше, по сравнению с уровнем, достигаемым при введении одного-. Из данных, приведенных на фиг. 1, следует, что введение - в комбинации с дефибротидом приводит к существенному увеличению количества лейкоцитов в циркулирующей крови мышей. В частности, следует отметить, что введение одного дефибротида не влияет на количество лейкоцитов в циркуляции крови. Следовательно, комбинацияи дефибротида обладает неожиданным эффектом (зависящим от дозы) - приводит к увеличению числа лейкоцитов, причем этот эффект не является простой суммой двух откликов, не зависящих друг от друга. 5 10111 1 2007.12.30 Фиг. 2-5 ясно демонстрируют, что введение - в комбинации с дефибротидом обеспечивает уровень активации у мышей, который гораздо выше (от 10 до 100 раз), чем уровень активации, полученный при введении одного -. Наконец, фиг. 6 подтверждает, что введение - в комбинации с дефибротидом обеспечивает уровень активации стволовых клеток (-) у обезьян, который приблизительно в 8 раз выше, по сравнению с уровнем, достигаемым при введении одного -. Эффект совместного введения двух активных ингредиентов зависит от дозы, поскольку уровень активации возрастает пропорционально количеству введенного дефибротида во всех случаях пик наивысшей активации достигается приблизительно на пятые сутки после введения. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7