Способ оценки влияния соединений с Р-витаминной активностью на проницаемость микрососудов различных органов крыс

(51)01 33/50 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ СОЕДИНЕНИЙ С Р-ВИТАМИННОЙ АКТИВНОСТЬЮ НА ПРОНИЦАЕМОСТЬ МИКРОСОСУДОВ РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНОВ КРЫС(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Бовкун Александра Сергеевна Солодков Александр Петрович Шелюто Владимир Лукьянович Кузьмичева Наталья Алексеевна(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(56) Киселева А.В. и др. Биологически активные вещества лекарственных растений Южной Сибири. - Новосибирск Наука, 1991. - С. 102-104.2154408 С 2, 2000.(57) Способ оценки влияния соединений с Р-витаминной активностью на проницаемость микрососудов различных органов крыс путем создания искусственной повышенной проницаемости микрососудов с последующим внутривенным введением синьки Эванса, отличающийся тем, что повышенную проницаемость микрососудов создают при содержании крыс в течение семи дней на диете, обедненной по витамину Р, затем животных делят на 2 группы и первую группу животных продолжают содержать на диете, а второй группе внутрижелудочно в течение 5 дней вводят водную суспензию рутина в количестве 20 мг/кг массы тела, затем животным 7859 1 2006.02.28 обеих групп в бедренную вену вводят из расчета 30 мг/кг массы тела 3 раствор синьки Эванса, через 30 мин животных забивают, забирают печень, почки и сердце, гомогенизируют в смеси 30 раствора 24 и 70 ацетона, взятых в соотношении 110, гомогенаты центрифугируют при 4000 об/мин и температуре -5 С в течение 15 мин, отделяют надосадочные жидкости,измеряют их оптические плотности при 620 нм, по калибровочной кривой определяют концентрации красителя в органах и по разнице концентраций синьки в печени, почках и сердце,соответственно, первой и второй групп животных судят о влиянии соединений с Р-витаминной активностью на проницаемость микрососудов. Изобретение относится к области медицины и фармации и касается нового способа определения влияния соединений с Р-витаминной активностью на проницаемость микрососудов различных органов крыс. Известны способы определения влияния соединений с Р-витаминной активностью на проницаемость микрососудов кожи крыс, заключающиеся в создании повышенной их проницаемости с помощью различных химических веществ, таких как гистамин, хлороформ 14, скипидар 9, 19, ксилол 6, 15. Количественная оценка проницаемости микрососудов кожи с помощью данных способов основывается на определении времени выхода в ткани красителей трипановый синий 9, 14, 15, 19, синька Эванса 6, либо на определении времени исчезновения флюоресценции после подкожного введения флюоресцирующих веществ 8. В способах 6, 9, 14, 15, 19 оценка результатов проводится визуально,что приводит к субъективному анализу получаемых данных, а следовательно, к невысокой воспроизводимости способов. Кроме того, некоторые из способов требуют наличия специального, дорогостоящего оборудования и реактивов 8. Прототипом предлагаемого изобретения является способ, основанный на искусственном повышении проницаемости микрососудов кожи крыс с помощью ксилола, подкожном введении испытуемого препарата (рутин), внутривенном введении синьки Эванса и визуальной оценке проницаемости микрососудов кожи, заключающейся в определении времени от начала введения ксилола до появления первых признаков посинения кожи 6. Недостатками прототипа является то, что оценка результатов проводится визуально,что приводит к субъективному анализу получаемых данных испытуемый препарат (рутин) вводится подкожно, что не позволяет ему проявить своего естественного биологического влияния на микрососуды повышенная проницаемость микрососудов создается с помощью химического вещества (ксилол), что не является естественным физиологическим явлением способ не позволяет оценить влияние исследуемых препаратов на проницаемость микрососудов внутренних органов (в частности, сердце, печень, почки), что с медицинской точки зрения очень важно при поиске лекарственных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, а также некоторых заболеваний печени и почек. Задачей предлагаемого изобретения является создание объективного, воспроизводимого способа по определению влияния соединений с Р-витаминной активностью на проницаемость микрососудов различных органов крыс, позволяющего приблизить условия эксперимента к естественным и дающего возможность оценить влияние исследуемых соединений с Р-витаминной активностью на проницаемость микрососудов жизненно важных органов (сердце, печень, почка). В основе предлагаемого изобретения лежит методика Е. -. по определению влияния селена и витамина Е на проницаемость микрососудов различных органов крыс 18. Предлагаемый способ заключается в следующем. Для исследования отбирают самцов крыс линии Вистар массой 200-300 г. Животных выборочно разделяют на 2 равные группы (контроль и группа диетарутин). Контрольную группу животных в течение семи дней содержат на диете, бедной витамином Р. Состав диеты, бедной витамином Р, подбирают на основании данных о содержании белков, жиров, углеводов, мине 2 7859 1 2006.02.28 ральных веществ и витаминов в пищевых продуктах с учетом суточной потребности крыс в данных веществах 1, 2, 3, 5, 7, 11, 13, 16, 17. Состав использованной дефицитной по витамину Р диеты представлен в табл. 1. В течение всего экспериментального периода животные получают достаточное количество воды. Таблица 1 Состав диеты, бедной витамином Р, для крыс массой 200-300 г Состав диеты Продолжительность диеты, необходимой для создания дефицита витамина Р в организме крысы, исследуют на дополнительной группе животных, получающих только диету, бедную витамином Р. Крыс данной группы разделяют на 3 подгруппы (5). В 1-й подгруппе определяют содержание синьки Эванса через два дня после начала диеты, во 2-й через четыре дня, в 3-й - через семь дней. Исследования проводят по сравнению с контрольной группой животных (5), которая содержится на стандартном пищевом рационе вивария, состав которого представлен в табл. 2. Таблица 2 Стандартный пищевой рацион вивария для крыс Состав стандартного пищевого Количество, г на 1 кры- Количество, г на 1 крысу масрациона вивария су массой 130-240 г сой 240-350 г 1. Овес 14,0 15,0 2. Хлеб белый 4,0 6,0 3. Крупа 2,5 4,0 4. Творог 2,0 2,5 5. Морковь 8,0 10,0 6, Масло растительное 0,1 0,2 7. Дрожжи кормовые 0,1 0,15 8. Комбикорм 1,64 2,12 9. Соль поваренная 0,15 0,2 Результаты исследования обрабатывают статистически с использованием критерияСтьюдента с поправкой Бонферрони. Значимость различий считают достоверной при р 0,05. В табл. 3 указаны, где- среднее изизмерений,- стандартная ошибка среднего. Таблица 3 Содержание синьки Эванса в органах крыс до диеты и через 2, 4, 7 дней после начала диеты Содержание синьки Эванса, мкг/г ткани органа Орган Контроль 1 подгруппа 2 подгруппа 3 подгруппа Печень 76,612,83 98,692,52 113,022,79 115,312,77 Почка 90,442,99 121,114,94 145,713,24 144,312,77 Сердце 38,812,28 46,021,19 52,221,44 51,0211,12 Примечание- различия статистически достоверны при р 0,05 в сравнении с контрольной группой животных. 3 7859 1 2006.02.28 Из табл. 3 следует, что содержание синьки Эванса в печени и почках контрольной группы животных наибольшее и составляет 76,612,83 и 90,442,99 мкг/г ткани соответственно. В тканях сердца красителя меньше - 38,812,28 мкг/г ткани. После двух дней диеты, бедной витамином Р, содержание синьки Эванса в органах по сравнению с контролем увеличивается (следовательно, увеличивается проницаемость микрососудов этих органов) в печени на 29 , почках - 34 , сердце - 19 . На четвертый день происходит дальнейшее увеличение проницаемости микрососудов органов по сравнению с контролем,которое составляет для печени 48 , почек - 61 , сердца - 35 . После семи дней содержания животных на диете количество красителя практически не изменяется и составляет для печени, почек и сердца 115,312,77, 144,312,77, 51,021,12 мкг/г ткани соответственно. Таким образом, оптимальным периодом, необходимым для создания дефицита витамина Р в организме крыс, является период продолжительностью 7 дней. В течение последующих пяти дней опыта контрольной группе животных на фоне диеты, бедной витамином Р, внутрижелудочно вводят 1 мл воды очищенной, группе диетарутин - водную суспензию рутина в количестве 20 мг/кг массы тела крысы. Количество вводимого препарата выбирают на основании данных литературных источников 9,12, 15. В конце экспериментального периода животным под уретановым наркозом (20 уретан внутрибрюшинно в количестве 1 г/кг массы тела крысы 4) в бедренную вену вводят 3 раствор синьки Эванса в количестве 30 мг/кг массы тела 18. Концентрацию синьки Эванса, вводимой в бедренную вену крыс, рассчитывают таким образом, чтобы объем красителя значительно не увеличивал объем циркулирующей крови у крысы и позволял создать такое содержание синьки в органах, которое можно определить спектрофотометрически. Через 30 мин под наркозом животных забивают декапитацией 10 и для исследования забирают печень, почки и сердце. Органы гомогенизируют в смеси 30 раствора 24 и 70 ацетона в экспериментальво подобранном соотношении, равном 110. Исследуемые условия представлены в табл. 4. Таблица 4 Определение оптимального соотношения смеси 30 раствор 24 70 ацетон Исследуемые соотношения смеси 30 раствор 24 70 ацетон 1 2 1 5 1 7,5 1 10 Наблюдаемый эффект Мутный раствор Мутный раствор Мутный раствор Прозрачный раствор Гомогенат центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при температуре - 5 ,4000 оборотах в минуту, в течение 15 мин. Условия центрифугирования, представленные в табл. 5, подбирают экспериментально. Таблица 5 Определение оптимальных условий центрифугирования Исследуемые параметры центрифугированияКоличество оборотов в Время, мин Температура,минуту 1 2000 5 0 2 2000 15 Наблюдаемый эффект Мутный раствор Мутный раствор Мутный раствор Мутный раствор Продолжение табл. 5 Взвесь Прозрачный раствор Взвесь Взвесь После центрифугирования оптическую плотность надосадочной жидкости определяют на спектрофотометре при длине волны 620 нм 18. Содержание красителя в органах определяют но формуле,0,066 где С - количество синьки Эванса в органе (мкг/г) А - оптическая плотность исследуемого раствора 0,009 - коэффициент б в уравнении регрессии- объем гомогената (мл) 0,066 - коэффициент а в уравнении регрессии- масса органа (г). Представленную формулу получают на основании калибровочного графика (фигура),который строят с использованием линейного регрессионного анализа. Для этого 0,0310 г синьки Эванса растворяют в мерной колбе на 100 мл в 63(учитывая, что в состав гомогенизирующей смеси входит 1 часть 30 раствора 24) ацетоне (маточный раствор 310 г/мл). В серию мерных колб (50 мл) добавляют по 0,1, 0,3, 0,5, 0,8, 1,2 мл маточного раствора и доводят объем раствора до метки 63 ацетоном (0,62, 1,86, 3,1, 4,96, 7,44 г/мл соответственно). Измеряют оптическую плотность калибровочных растворов при длине волны 620 нм. На основании полученной зависимости оптической плотности синьки Эванса от ее концентрации составляют уравнение регрессии, которое имеет вид у 0,066 х 0,009(коэффициент корреляции 20,995). Оценку полученных данных проводят по количеству синьки Эванса в органах в группе диетарутин по сравнению с контрольной группой животных. Чем меньше содержание синьки Эванса в тканях органа в группе диетарутин по сравнению с контролем,тем меньше проницаемость микрососудов этого органа, а следовательно, тем выше капилляроукрепляющее действие исследуемого препарата. Результаты исследования обрабатывают статистически с использованием критерияСтьюдента. Значимость различий считают достоверной при р 0,05. В табл. 6 указаны(- среднее изизмерений,- стандартная ошибка среднего). Таблица 6 Содержание синьки Эванса (мкг/г ткани) в печени, почках, сердце крыс в конце экспериментальною периода Группа Контроль Диетарутин Печень 7 82,183,42 55,613,29 Почка 7 109,914,04 63,892,36 Сердце 7 56,282,82 34,6613,17 Примечание- различия статистически достоверны при р 0,05 в сравнении с контрольной группой животных. Таким образом, внутрижелудочное введение рутина достоверно снижает искусственно вызванную диетой повышенную проницаемость микрососудов печени на 32 , почек - на 42 , сердца - на 38 . 5 7859 1 2006.02.28 Полученные результаты позволяют утверждать, что предлагаемый способ определения влияния соединений с Р-витаминной активностью на проницаемость микрососудов различных органов крыс объективен, воспроизводим, позволяет создать условия эксперимента, близкие к естественным, и может быть рекомендован для проведения исследований по определению влияния соединений с Р-витаминной активностью на проницаемость микрососудов различных органов крыс. Источники информации 1. Березовская Н.Н. Исследование биологического действия витамина Р //Биохимия.1956. - Т. 21. - Вып. 1. - С. 148-155. 2. Болотникова В.А. Белорусская кухня. -Минск Ураджай, 1977. - С. 19. 3. Бульба Энциклопедический справочник по выращиванию, хранению, переработке и использованию картофеля/Под ред. И.П. Шамякина. - М. Белорус. совет. энциклопедия,1988. - С. 7-9. 4. Гацура В.В. Методы первичного фармакологического исследования биологически активных веществ. - М. Медицина, 1974. - С. 143. 5. Егоров И.Л., Скурихин И.М., Ерофеева Н.Н Р-витаминное действие дубильных веществ древесины дуба//Прикладная биохимия и микробиология. - 1966. - Т. 2. - Вып. 6. - С. 691-693. 6. Киселева А.В., Волхонская Т.А., Киселев В.Е. Биологически активные вещества лекарственных растений Южной Сибири. -Новосибирск Наука, 1991. - С. 133 (прототип). 7. Ярусова Н.С., Березовская Н.Н., Лапина С.А., Тикоцкая К.М. К методике биологического определения веществ, обладающих Р-витаминным действием // Витаминные ресурсы. - 1959 г., Сб. 4. - С. 178-181. 8. Макаров В.А., Хаджай Я.И. О противовоспалительной и Р-витаминной активности флавонолов терновника//Фармакология и токсикология, 1969. - Т. ,4. - С. 438-441. 9. Мещерекая-Штейнберг К.А., Богданова Л.С. Фармакологическая характеристика рутина.//Фармакология и токсикология. - 1950. - Т. . -2. - С. 39-41. 10. Надлежащая производственная практика лекарственных средств/Под ред. Н.А. Ляпунова и др. - Киев Морион, 1999. - С. 210-220. 11.Нормативы затрат кормов для лабораторных животных в учреждениях Здравоохранения. Приказ МЗ СССР 1179 от 10.10.1983. 12. Чумбалов Т.К., Ушакова М.Т., Тараскина К.В. и др. О Р-витаминной активности препаратов из веточек эфедры хвощевой, корней щавеля конского, ревеня татарского и тарана дубильного // Растительные ресурсы. - 1966. - С. . - Вып. 2. - С. 213-215. 13. Таранов В.В., Таранова Н.А. Садово-огородный участок. - М. Агропромиздат,1985. - С. 121-124. 14. Хаджай Я.И., Королев В.Ф. К фармакологии кверцетина//Фармакология и токсикология. - 1962. -1. - С. 71-77. 15. Барнаулов О.Д., Кумков А.В., Халикова И.А. и др. Химический состав и первичная оценка фармакологических свойств препаратов из цветков(.) .///Растительные ресурсы. - 1977. - Т. 13. - Вып. 4. - С. 659-672. 16. Шуин К.А. 70 видов овощей на огороде. - Минск Ураджай, 1978. - С. 51-54. 17. Эвенштейн З.М. Популярная диетология. - М. Экономика, 1989. - С. 177-236. 18.- ,,.. -, 1998. - . 64. - Р. 161-168. 19.. . . , 1640. - . 129. - Р. 691. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6