Способ одновременного определения нескольких веществ в смеси

(12) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕСКОЛЬКИХ ВЕЩЕСТВ В СМЕСИ(71) Заявитель Дарашкевич Олег Николаевич(72) Автор Дарашкевич Олег Николаевич(73) Патентообладатель Дарашкевич Олег Николаевич(57) 1. Способ одновременного определения веществ в смеси, включающий взаимодействие анализируемых веществ смеси со специфичными рецепторами, иммобилизованными на поверхности маркированных носителей, причем каждый тип специфичного рецептора присоединен к своему маркированному носителю, отличающийся тем, что используют маркированные носители с иммобилизованными на их поверхности рецепторами с одинаковой подвижностью в физическом поле, причем форма носителей, используемых в одном анализе, одинакова, а размеры не отличаются более чем на 20 , проводят разделение носителей с прореагировавшими и непрореагировавшими рецепторами по их подвижности,подвергая их воздействию физического поля, и определяют наличие или отсутствие анализируемых веществ в смеси путем идентификации маркеров разделенных носителей. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве физического поля используют гравитационное, электрическое или магнитное поля или их комбинации. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что носители изготавливают из микроскопических биологических объектов, синтетических, полусинтетических или природных веществ или их смесей, а маркеры инкапсулированы, связаны с ядром или поверхностью носителя. 4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что носители изготавливают из простейших,бактерий, вирусов, фагов, спор растений, бактерий или грибов, пыльцы растений, эритроцитов, микроскопических водорослей, магнетита, магхемита, железа, никеля, хрома, золота, силикагеля, цеолита, углерода, полистирола, дивинилбензола, полиакриламида,полисульфона, полиамида, поливинилового спирта, полиэтиленгликоля, глюканов в - и-конформациях, в том числе аминоглюканов, полиуроновых кислот, полиакролеина, полиглутаральдегида, полиметил-(гидроксиметил)акрилата, полихлорметилстирола, поливиниламинокислот, поливинилизотрония, полиакриловой кислоты, полилактата,полиалкилцианоакрилата или их смесей или комбинаций. 5. Способ по п. 3, отличающийся тем, что используют носители в виде сферы, полусферы, конуса, многогранника, палочки или нити. 6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что носитель маркируют знаком или рельефом его поверхности, различимым под микроскопом. 7. Способ по п. 3, отличающийся тем, что носитель маркируют веществом или смесью веществ, включенных в носитель или зафиксированных на поверхности носителя. 8. Способ по п. 7, отличающийся тем, что используют вещество, имеющее характерные спектры поглощения, испускания, отражения, рассеивания, люминесценции, двойного лучепреломления, кругового дихроизма или энергии радиоактивного распада или их интенсивность. 9. Способ по п. 7, отличающийся тем, что в качестве маркеров используют органические комплексы катионов лантана, природные или синтетические порфирины, природные или синтетические хиноны, природные или синтетические алкалоиды, с парамагнитными метками или без, с радиоактивными метками или без, или их смеси. 10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что маркеры носителей с изменившейся в физическом поле подвижностью идентифицируют визуально или с помощью регистрирующих приборов. 11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что в качестве регистрирующих приборов используют спектрометры электромагнитного излучения в радио-, инфракрасном, видимом, ультрафиолетовом или рентгеновском диапазоне как по отдельности, так и в комбинации.(56)5891738 , 1999.0760952 1, 1997.0810905 1, 1997.0357786 1, 1990.0421478 3, 1993.0981749 1, 2000.5985153 , 1999.00/40947 1.99/27367 1.94020983 1, 1996.89/11101 1.2129279 1, 1999. Изобретение относится к области экологии, биотехнологии, молекулярной биологии,биохимии, иммунологии, в частности к определению веществ с помощью специфических взаимодействий между ними и носителем с иммобилизованным на нем рецептором для определяемого вещества. Известен способ одновременного анализа нескольких аналитов в одном образце, описанный в международной заявке 89 11101, где для каждого вещества анализируются монодисперсные частицы, несущие специфический связующий рецептор для каждого отдельного вещества, а меченый лиганд используется для оценки количества связанного вещества. При этом каждое вещество анализируется парой частиц различного типа, имеющих оди 2 6766 1 наковую специфичность, но различную связующую способность, а различия в размерах частиц разного типа определяются по характеру рассеяния света при прохождении частицами фотоячейки цитофлоуметра. Подобным является способ одновременного анализа нескольких аналитов в одном образце по российскому патенту 2111488. Недостатками данных способов являются а) относительно низкая чувствительность б) ограниченное число веществ, анализируемых одновременно. В патенте США 5891738 (прототип) описан биоспецифичный многопараметрический метод анализа, основанный на использовании различных категорий микрочастиц, как твердой фазы, представляющей различные анализируемые вещества, где каждая категория микрочастиц покрыта различными первичными биоспецифичными рецепторами. К этим микрочастицам добавляются или структура этих микрочастиц содержит один или несколько флуоресцентных индикаторов, в одной или нескольких концентрациях. При анализе используются и вторичные биоспецифичные реагенты, меченые фотолюминисцентной меткой. Метод выполняется в следующей последовательности 1. смешение различных типов микрочастиц вместе в суспензии и добавление образца к суспензии 2. добавление смеси вторичных биоспецифичных реагентов, меченых фотолюминисцентной меткой в суспензию с целью инициировать биоспецифичную реакцию между анализируемыми веществами и мечеными реагентами, а продукты взаимодействия связываются с микрочастицами 3. разбавление суспензии для снижения концентрации меченых реагентов, не связавшихся с частицами 4. активирование индикаторов и фотолюминисцентной метки 5. измерение фотонной эмиссии индикатора для идентификации категории микрочастицы и фотонной эмиссии метки для определения концентрации вещества. Однако данный способ имеет следующие недостатки 1. невозможно надежно определить отсутствие отдельного вещества в смеси, что особенно существенно при скрининге сложных смесей 2. кроме меченых частиц, необходимы также меченые биоспецифичные реагенты на каждое вещество, что существенно удорожает анализ 3. вследствие того, что необходимо проанализировать все частицы в суспензии, время анализа существенно удлиняется 4. маркерами являются только флуоресцентные красители, что сужает возможности регистрирования различий между носителями. Изобретение решает задачу повышения надежности одновременного определения нескольких веществ в смеси, снижения стоимости анализа, сокращения времени на его проведение, расширения набора маркеров, а также получения возможности регистрации содержания в смеси нескольких веществ визуально. Техническим результатом, обеспечивающим достижение поставленной задачи, является одновременное определение сразу нескольких компонентов в смеси. Поставленная задача в способе одновременного определения веществ в смеси, включающем взаимодействие анализируемых веществ смеси со специфичными рецепторами,иммобилизованными на поверхности маркированных носителей, причем каждый тип специфичного рецептора присоединен к своему маркированному носителю, решена за счет того, что используют маркированные носители с иммобилизованными на их поверхности рецепторами с одинаковой подвижностью в физическом поле, причем форма носителей,используемых в одном анализе, одинакова, а размеры не отличаются более чем на 20 ,проводят разделение носителей с прореагировавшими и непрореагировавшими рецепторами по их подвижности, подвергая их воздействию физического поля, и определяют на 3 6766 1 личие или отсутствие анализируемых веществ в смеси путем идентификации маркеров разделенных носителей. В качестве физического поля могут использовать гравитационное, электрическое и магнитное поля или их комбинации. Носители изготавливают из микроскопических биологических объектов, синтетических, полусинтетических или природных веществ или их смесей с инкапсулированными,связанными с ядром или поверхностью носителя маркерами. Носители могут быть изготовлены из простейших, бактерий, вирусов, фагов, спор растений, бактерий и грибов, пыльцы растений, эритроцитов, микроскопических водорослей,магнетита, магхемита, железа, никеля, хрома, золота, силикагеля, цеолита, углерода, полистирола, дивинилбензола, полиакриламида, полисульфона, полиамида, полиэтиленгликоля, глюканов в - и -конформациях, в том числе аминоглюканов, полиуроновых кислот, полиакролеина , полиглутаральдегида, полиметил - (гидроксиметил)акрилата, полихлорометилстирола, поливинилового спирта, поливиниламинокислот, поливинилизотрония, полиакриловой кислоты, полилактата, полиалкилцианоакрилата или их смесей и комбинаций. Носители могут иметь вид сферы, полусферы, конуса, многогранника, палочки или нити. Носитель может быть маркирован как знаком или рельефом на его поверхности, различимым под микроскопом, так и веществом или смесью веществ, включенных в носитель или зафиксированных на поверхности носителя, причем в качестве различительных признаков маркера используют характерные для данного вещества или смеси веществ спектры поглощения, испускания, отражения, рассеивания, двойного лучепреломления,кругового дихроизма или энергии радиоактивного распада, а также их интенсивность. Маркерами могут являться органические комплексы катионов группы лантана, природные и синтетические порфирины, природные и синтетические хиноны, природные и синтетические алкалоиды, с парамагнитными метками и без, с радиоактивными метками и без, или их смеси. Маркеры носителей с изменившейся в физическом поле подвижностью могут быть идентифицированы визуально или с помощью регистрирующих приборов, в качестве которых могут использоваться спектрометры электромагнитного излучения в радио-, инфракрасном, видимом, ультрафиолетовом и рентгеновском диапазоне как по отдельности,так и в комбинации. На фиг. 1 представлена принципиальная схема установки для осуществления одного из вариантов предлагаемого способа. На фиг. 2 приведены спектры поглощения и эмиссии красителей и маркеров носителей в варианте предлагаемого способа, использованном в установке по фиг. 1. Установка для осуществления одного из вариантов предлагаемого способа, схематично показанная на фиг. 1, содержит источник ультрафиолетового излучения 1, оптические фильтры 2 и приемник флуоресцентного излучения 3, установленные на оптической оси вместе с капилляром 4 устройства для капиллярного электрофореза (на схеме не показано). Блок 5 обработки предназначен для обработки и хранения полученных данных. Осуществление способа поясняется следующими неограничивающими примерами. Пример 1. Пример осуществления способа определения приведен со ссылкой на фиг. 1 и фиг. 2. На носители в виде сфер из хитина размером 2 мк путем инкапсулирования наносились активные флуоресцентные красители 33258,33276,33285,33514 и 33258, спектры поглощения и эмиссии которых представлены на фиг. 2. К каждому типу образовавшихся маркированных носителей путем реакции с карбодиимидом присоединялись моноклональные антитела к следующим белкам сыворотки крови человека 4 6766 1 альбумину, трансферрину, фибриногену, церуллоплазмину и 2-микроглобулину. Полученные комплексы предварительно фракционировались в электрическом поле в аппарате для капиллярного электрофореза при напряженности электрического поля 30 в/см в 0,1 Трисглициновом буфере рН 8,3. Фракции с одинаковой подвижностью (например 0,03 см/Всек) объединялись в тест-систему с таким расчетом, чтобы обеспечить равные пропорции каждого носителя в смеси. Аликвоты тест-системы из расчета по 5 мкг сфер добавлялись к образцам сыворотки крови объемом 0,1 мл. После перемешивания и инкубирования в течение 30 мин. пробы повторно фракционировались в электрическом поле в аппарате для капиллярного электрофореза при напряженности электрического поля 30 в/см в 0,1 Трис-глициновом буфере рН 8,3. При этом наблюдалось разделение носителей на две отчетливо различимые фракции с неизменившейся подвижностью (0,03 см/Всек, на фиг. 1 обозначенных как зона А) и хвост В носителей с уменьшившейся подвижностью (в диапазоне от 0,02 до 0,01 см/Всек). На основе спектров поглощения и эмиссии носителей с изменившейся подвижностью (показанных на фиг. 2) с помощью компьютеризированной системы 5 было установлено присутствие альбумина, трансферрина, фибриногена, церуллоплазмина и 2-микроглобулина в анализированных образцах. Пример 2. На носители в виде игольчатых кристаллов размером 30,2 мк синтетических цеолитов марок Н-6, К-4, М-8 и КО-4 наносили тонким слоем дибутирилхитин с добавленными в него образцами пыльцы следующих злаковых растений ржи, пшеницы, овса и мятлика,различимых по характерной форме и поляризации видимого света. Предварительно каждый тип маркированного цеолита подвергался фракционированию в электрическом поле в аппарате для капиллярного электрофореза при напряженности электрического поля 30 в/см в 0,1 Трис-глициновом буфере рН 8,3. Фракции с одинаковой подвижностью(например, 0,06 см/Всек) объединялись в тест-систему с таким расчетом, чтобы обеспечить равные пропорции каждого цеолита в смеси. Анализируемую смесь катионов К, ,и Со в виде 0,1 мкМ растворов в количестве 0,2 мл добавляли к тест-системе, и повторно проводили разделение в аппарате для капиллярного электрофореза при напряженности электрического поля 30 в/см в 0,1 Трисглициновом буфере рН 8,3. При этом, как и в примере 1, наблюдалось разделение носителей на две отчетливо различимые фракции с неизменившейся подвижностью (0,06 см/Всек) и хвост носителей с уменьшившейся подвижностью (в диапазоне от 0,04 до 0,01 см/Всек). Фракции носителей с уменьшенной подвижностью в электрическом поле рассматривались в поляризованном свете под микроскопом. На основании визуальной оценки микроскопического изображения делался вывод о присутствии отдельных катионов в анализируемой смеси. Пример 3. Суспензия бактерийс размерами 425 нм смешивалась с 6 водным раствором поливинилового спирта и добавлялся 1 водный раствор глутаральдегида при интенсивном перемешивании. После отмывки непрореагировавших компонентов и водорастворимых продуктов реакции к полученным частицам химически присоединялись активные флуоресцентные красители 33258,33276,33285,33514 и 33258, спектры поглощения и эмиссии которых представлены на фиг. 2. К каждому типу образовавшихся маркированных магнитозависимых носителей присоединялись путем тозилирования молекулы авидина. Биотинилированные моноклональные антитела к следующим белкам сыворотки крови человека альбумину, трансферрину, фибриногену,церуллоплазмину и 2-микроглобулину присоединялись путем инкубации каждого типа антител с маркированным определенным красителем носителями. Полученные комплексы предварительно фракционировались в устройстве для определения магнитофоретической 5 6766 1 подвижности клеток или частиц (-измерение скорости по следу клетки), в котором используется строго контролируемый градиент магнитного поля, имеются устройство микроскопического изображения и компьютерная программа для определения магнитофоретической подвижности значительного числа частиц ( 200) и механизм выделения их в отдельные фракции. Фракции с одинаковой подвижностью (например, 0,15 см/Эрстедсек) объединялись в тест-систему с таким расчетом, чтобы обеспечить равные пропорции каждого типа носителей в смеси. Аликвоты тест-системы из расчета по 5 мкг сфер добавлялись к образцам сыворотки крови объемом 0,1 мл и после перемешивания и инкубирования в течение 30 мин. пробы повторно разделялись в устройстве . Как и в примере 1, наблюдалось разделение носителей на две отчетливо различимые фракции с неизменившейся подвижностью (0,15 см/Эрстедсек) и хвост носителей с уменьшившейся подвижностью (в диапазоне от 0,1 до 0,08 см/Эрстедсек). На основе спектров поглощения и эмиссии носителей с изменившейся подвижностью было установлено присутствие альбумина, трансферрина, фибриногена, церуллоплазмина и 2 микроглобулина в анализированных образцах. Пример 4. Сферы из полистирола размером 0,15-6,0 мк окрашивались путем инкубации навесок по 10 мг в 0,1 бензольных растворах следующих красителей активный ярко-красный 5, активный ярко-желтый 53, активный оранжевый 2 Ж, активный ярко-голубой К. Присоединение антител к группоспецифическим антигенам и резус-фактору человеческой крови осуществлялось на основе неспецифической сорбции в натрий-фосфатном буферном растворе (НФБ) рН 7,4. Сферы каждой группы после присоединения антител предварительно фракционировались декантацией в течение 30 мин. Тест-система формировалась из фракций с одинаковой скоростью оседания (1 см/мин) в гравитационном поле. Тени эритроцитов из анализируемых образцов крови объемом по 0,2 мл получали при разбавлении образцов в отношении 19 дистиллированной водой и центрифугировании при 3000 в течение 15 мин. Аликвоты тест-системы из расчета по 5 мкг сфер добавлялись к осадкам теней эритроцитов, перемешивались и наносились на поверхность столба НФБ высотой 5 см в стеклянных пробирках. Через 15 мин наблюдалось расслоение сфер на две фракции. Оседающая с большей скоростью (1,5 см/мин) фракция содержала сферы, прореагировавшие с эритроцитами, а по цвету этой фракции, определенному визуально, делался вывод о принадлежности эритроцитов к определенной группе крови и резус-фактору. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.