Способ диагностики панкреатита по уровню A2 фосфолипазной активности сыворотки крови

(51) МПК (2009) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПАНКРЕАТИТА ПО УРОВНЮ 2 ФОСФОЛИПАЗНОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Литвинко Наталья Михайловна Скоростецкая Лидия Адамовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56) СКОРОСТЕЦКАЯ Л.А. и др. Международная научная конференция Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем.съезд БООФиБ Сб. ст. ТМинск, 2006.- С. 249-251. ГОЛОВАЧ О.Н. и др. Молекулярные,мембранные и клеточные основы функционирования биосистем Сб. ст. ЧМинск, 2004.- С. 225-227. ЛИТВИНКО Н.М. Структурно-функциональные закономерности гидролиза фосфолипидов под действием фосфолипаз А 2 и С (активностьи(57) Способ диагностики панкреатита по уровню 2 фосфолипазной активности сыворотки крови, отличающийся тем, что активность фосфолипазы А 2 определяют с использованием в качестве субстрата мицелл, полученных из фосфатидилхолина яичного желтка, взятого в концентрации 0,12-0,2 мМ, и тритона Х-100, взятого в соотношении с фосфатидилхолином яичного желтка 1(2-3), причем субстрат вносят в буферный раствор рН 7,4-10,0, содержащий 2 в концентрации 1-2 мМ и метгемоглобин в концентрации 3-12 мкМ, полученную смесь преинкубируют в течение 2-5 минут при 20-37 С, вносят в две кюветы, добавляют в первую кювету 5-20 мкл сыворотки крови обследуемого пациента, во вторую - контрольную - 5-20 мкл сыворотки крови здорового человека, выравнивают оптические плотности образцов в кюветах путем внесения этанола в первую кювету и 20 мМ-ного раствора пальмитиновой кислоты в этаноле во вторую кювету, регистрируют при длинах волн 405 и 423 нм дифференциальные спектры интенсивности абсорбции обоих образцов, по значениям 405-423 определяют по калибровочному графику уровни А 2 фосфолипазной активности в образцах и, если А 2 фосфолипазная активность сыворотки крови в 2,6 раза больше у обследуемого пациента, чем у здорового человека, диагностируют панкреатит. 13143 1 2010.04.30 Изобретение относится к области клинической биохимии, биотехнологии и медицины,в частности к выявлению воспалительных заболеваний на основе определения в сыворотке крови активности одного из важнейших ферментов липидного метаболизма - фосфолипазы А 2, уровень которой является патогенетическим признаком острого некротического панкреатита и других воспалительных заболеваний 1. При развитии воспалительных и онкологических процессов, тромбообразовании, ишемии тканей, язвенной болезни, многих заболеваниях, угрожающих жизни человека - отеках вследствие радиационного поражения и других патологиях наблюдается значительное увеличение активности липолитического фермента фосфолипазы А 2 (КФ 3.1.1.4, ФЛА 2) в органах и тканях 2. Известен способ определения активности фосфолипазы А, использующийся в клинических биохимических лабораториях, состоящий в определении специфическими реагентами количества высвободившихся жирных кислот после инкубации сыворотки с лецитином (фосфатидилхолин) в качестве субстрата, солюбилизированного дезоксихолатом натрия, в присутствии глицина в течение длительного времени (18 ч) при температуре 55 С 3. Определение активности ФЛА 2 в биологическом материале осуществляется также с использованием наиболее точного хроматографического метода, включающего в себя экстракцию продуктов реакции, их разделение с помощью тонкослойной хроматографии и последующего количественного определения образующихся лизофосфатидилхолинов и оставшихся непрореагировавшими фосфатидилхолинов по содержанию в них фосфора. Определение по этому способу занимает до пяти суток 4. Существующие методы определения активности ФЛА 2 трудоемки, требуют больших затрат биологического материала, субстратов и времени, а также специального дорогостоящего оборудования и реактивов, не позволяют характеризовать уровень фермента в кинетическом режиме, что создает большие трудности при необходимости быстрого определения активности этого жизненно важного фермента. Функциональная значимость ФЛА 2 для систем свертывания крови, биосинтеза в крови биологически активных оксилипинов, необходимых для передачи внешнего сигнала на внутренний язык клетки, обусловила актуальность определения активности этого фермента в сыворотке крови. ФЛА 2 обнаружена практически во всех клетках крови тромбоцитах, эритроцитах, полиморфно-ядерных лейкоцитах (нейтрофилах, базофилах, эозинофилах) и т.д. Кроме участия в регуляции жирно-кислотного состава фосфолипидов клеточной мембраны ФЛА 2 кровяных клеток имеет специальные функции. Однако основной функцией ФЛА 2 клеток крови является участие в продукции биологически активных оксилипинов путем отщепления арахидоновой кислоты - предшественника простагландинов, лейкотриенов и липоксинов 6. Биосинтез активных метаболитов арахидоновой кислоты, которая освобождается из молекул фосфолипидов под действием ФЛА 2, реализуется при активации тромбоцитов. Таким образом функционирование ФЛА 2, наличие которой зафиксировано как в цитозоле, так и в мембране тромбоцитов, имеет решающее значение для реализации их физиологической функции. Основной функцией полиморфно-ядерных лейкоцитов является фагоцитоз и уничтожение чужеродных бактерий. ФЛА 2, секретируемая лейкоцитами и макрофагами при фагоцитозе, гидролизует фосфолипиды патогенных микроорганизмов. Активация полиморфно-ядерных лейкоцитов сопровождается биосинтезом лейкотриенов, субстратом для биосинтеза которых также служит арахидоновая кислота, образующаяся из фосфолипидов в результате их разрушения ФЛА 2. Клетки иммунной системы крови представлены лимфоцитами и макрофагами. Фосфолипазная активность оказалась присуща как -, так и В-лимфоцитам. Локализация биосинтеза простагландинов в макрофагах указывает на наличие двух пулов фосфолипазной активности в лизосомах и в мембранах. В меньшей степени активность мембранно-связанной представлена в тенях эритроцитов 5. 2 13143 1 2010.04.30 Известен способ определения активности фосфолипазы А 2 в биологических жидкостях и тканях, базирующийся на установлении содержания метаболитов фосфолиполиза в биологическом материале при участии метгемоглобина в кинетическом режиме без отбора отдельных проб с использованием разностной спектрофотометрии (А 405-423) (прототип) 6. Показано, что метод позволяет определять активность ФЛА 2 в бронхоальвеолярном смыве, в препарате культуры клеток альвеолярных макрофагов и в среде культивирования. Недостаток - диагностический тест на этом биологическом материале является узкоприменимым (только для диагностики болезней дыхательных путей). Задачей изобретения является разработка универсального способа выявления связанных с повышенной активностью фосфолипазы А 2 воспалительных заболеваний, который позволяет провести измерение в одну стадию с высокой чувствительностью (1020 нмоль/мл) на небольшом количестве доступного биологического материала (5-20 мкл сыворотки крови). Поставленная задача решается способом диагностики панкреатита по уровню А 2 фосфолипазной активности сыворотки крови, отличающегося тем, что активность фосфолипазы А 2 определяют с использованием в качестве субстрата мицелл, полученных из фосфатидилхолина яичного желтка, взятого в концентрации 0,12-0,2 мМ, и тритона-Х 100,взятого в соотношении с фосфатидилхолином яичного желтка 1(2-3), причем субстрат вносят в буферный раствор рН 7,4-10,0, содержащий 2 в концентрации 1-2 мМ и метгемоглобин в концентрации 3-12 мкМ, полученную смесь преинкубируют в течение 25 мин при 20-37 С, вносят в две кюветы, добавляют в первую кювету 5-20 мкл сыворотки крови обследуемого пациента, во вторую - контрольную - 5-20 мкл сыворотки крови здорового человека, выравнивают оптические плотности образцов в кюветах путем внесения этанола в первую кювету и 20 мМ-ного раствора пальмитиновой кислоты в этаноле - во вторую кювету, регистрируют при длинах волн 405 и 423 нм дифференциальные спектры интенсивности абсорбции обоих образцов, по значениям 403-423 определяют по калибровочному графику уровни А 2 фосфолипазной активности в образцах, и если А 2 фосфолипазная активность сыворотки крови в 2,6 раза больше у обследуемого пациента, чем у здорового человека, диагностируют панкреатит. В процессе фосфолиполиза с участием фосфолипазы А 2 (ФЛА 2) в образцах сыворотки крови больных людей (опытная проба) и здоровых доноров (контрольная проба) под действием продукта реакции фосфолиполиза - жирной кислоты - происходит превращение метгемоглобина в гемихром, что регистрируется по изменению спектра в видимой области. В каждой из проб различия в содержании двух форм гемоглобина сопровождаются пропорциональным изменением разностного спектра. На фиг. 1 представлены спектры поглощения, регистрируемые в течение 90 мин при добавлении 10 мкл сыворотки больного острым панкреатитом к 1 мл реакционной смеси при следующих условиях реакции Ф 0,12 мМ,5 мкМ, 22 мМ,20 С. Разностный спектр определяется спектрофотометрически (Солар) по величине максимума абсорбции при 423 нм и минимума - при 405 нм. Интенсивность поглощения между максимумом и минимумом в разностном спектре (12). Интенсивность спектральных изменений (405-423) пропорциональна концентрации образующейся жирной кислоты, а следовательно, и активности ФЛА 2. При этом 405-423 в опытной пробе 405-423 контрольной пробы(фиг. 2 А). Дифференциальные спектры - в условиях определения активности ФЛА 2 в сыворотке донора (1) и в сыворотке больного острым деструктивным панкреатитом (2). Приведенные ниже примеры определения активности ФЛА 2 в образцах сыворотки крови больных людей и здоровых доноров подтверждают возможность осуществления изобретения, не ограничивая его объем. Пример 1. Определение активности ФЛА 2 в сыворотке крови больных воспалительными заболеваниями с повышенной фосфалипазной активностью. 3 13143 1 2010.04.30 Для проведения реакции готовят следующие реактивы 1. 0,05 Трис-НС-буфер, рН 8,0. 2. Раствор фосфатидилхолина яичного желтка (Ф) в хлороформе, исходная концентрация 30-50 мкмоль/мл. Хранится при -18 С. 3. Раствор метгемоглобина в Трис- -буфере, исходная концентрация - 30-50 мкМ(по гему). Взвешивают лиофилизованный метгемоглобин, исходя из расчета, что 1 мг сухого порошка дает около 28 нмоль по гему. Добавляют буферный раствор до концентрации 0,5 мг/мл. Оставляют на 2-3 ч для набухания, после чего раствор хорошо перемешивают и центрифугируют 5 мин при 3000 об/мин для отделения нерастворившегося белка и апогемоглобина. Регистрируют спектр поглощения разведенного в 20-40 раз супернатанта на Спекорде - либо определяют А 406 на спектрофотометре. Рассчитывают содержание метгемоглобина (по гему) с учетом разведения и длины оптического пути, используя коэффициент молярной экстинкции метгемоглобина 162000 -1 см-1. 4. 0,12. 5. 48 мМ Тритон -100, водный раствор. Далее готовят реакционную смесь. Для этого выпаривают исходный раствор фосфатидилхолина (ФХ) в количестве, эквивалентном 0,516 мкмоль. Оставляют на воздухе на 2030 мин для удаления паров хлороформа. Суспендируют в 100 мкл буферного раствора 0,05 М Трис-, рН 8,0. Солюбилизируют суспензию добавлением 21,5 мкл 48 мМ раствора Тритона -100 (до соотношения ФХ/Тритон 1/2, моль/моль). Оставляют в холодильнике на 15-30 мин до полного просветления. Доводят объем полученных мицелл до 2,5 мл тем же буферным раствором и добавляют 86 мкл 0,12. Исходный раствор метгемоглобина добавляется в количестве 21,5 нмоль Конечный объем реакционной смеси - 4,3 мл. В условиях определения активности ФЛА 2 в сыворотке крови для получения калибровочной зависимости используют способ количественной характеристики амплитуды дифференциального спектра - , возникающего благодаря воздействию отщепившихся при липолизе жирных кислот в опытной кювете. Через определенный промежуток времени (когда зафиксирован под действием эндогенной жирной кислоты четкий дифференциальный спектр -) параллельно с реакцией в опытной кювете, содержащей сыворотку больного или здорового донора, титруют метгемоглобин в контрольной кювете в отсутствии сыворотки, раствором экзогенно добавленной жирной кислоты (ЖК) до минимизации разницы между максимумом и минимумом в дифференциальном спектре(фиг. 3 А, Б). Количество мкмоль ЖК, пошедшей на уравнивание двух кювет по пропусканию, эквивалентно приросту продуктаза время реакции с данным количеством сыворотки (фиг. 3 А). На фиг. 3 А представлены спектры пропускания при титровании пальмитиновой кислотой - в контрольной кювете в следующих условиях реакции ФХ 0,12 мМ,5 мкМ, СА 22 мМ. Концентрации ПК 1 - 0,12 мМ 2 - 0,24 мМ 3 - 0,35 мМ 4 - 0,47 мМ 5 - 0,58 мМ 6 - 0,7 мМ- 15 мин, объем сыворотки больного - 4 мкл. Оптимальной для титрования выбрана 20 мМ концентрация пальмитиновой кислоты (ПК). Титрование производят следующим образом после проведения реакции в течение выбранного интервала времени (близкого к времени насыщения) в контрольную кювету начинала уменьшаться. Титрование проводят до тех пор, пока не прекращается снижение Т. На фиг. 3 Б представлен калибровочный график сниженияпо мере добавления пальмитиновой кислоты в контрольную кювету. Титрование - пальмитиновой кислотой в контрольной кювете проводят в следующих условиях реакции ФХ 0,12 мМ,5 мкМ, 22 мМ. Общее количество мкмоль ПК, пошедшей на титрование продукта, образовавшегося в течение 60 мин инкубирования 4 мкл сыворотки донора с 1 мл раствора - составило 0,8 мкмоль, что соответствовало Т 25 мм (0,038). Активность ФЛА 2 в сыворотке донора составляет 0,067 мкмоль/минмг белка, а в сыворотке больного - 0,176 мкмоль/минмг белка. На фиг. 2 А представлены дифференциаль 4 13143 1 2010.04.30 ные спектры - в условиях определения активности ФЛА 2 в сыворотке донора (1) и в сыворотке больного (2), для которых с помощью калибровки, представленной выше, рассчитана активность фермента (0,067 мкмоль/мин-мг белка и 0,176 мкмоль/минмг белка соответственно). Активность ФЛА 2 в сыворотке больного в 2,6 выше, чем у здорового донора. Пример 2. Определение активности ФЛА 2 в сыворотке крови традиционным методом с использованиемдля разделения продуктов реакции. Для этого была проведена реакция с использованием в качестве субстрата мицелл, содержащих яичный фосфатидилхолин (ФХ) и анионный детергент холат натрия (соотношение 13, моль/моль) 7. В качестве контроля используют смесь того же образца мицелл,содержащую ионы кальция и буферный раствор той же концентрации, что и в опыте. По истечении выбранного времени реакции (24 ч) продукты гидролиза фосфолипида разделяют методом , экстрагируют хлороформ-метанольной смесью и анализируют на наличие неорганического фосфора по методу Васьковского 8, после чего рассчитывают процент гидролиза исходного фосфолипида и активность ФЛА 2 в испытуемом образце(сыворотке, фиг. 2 Б). На фиг. 2 Б представлена зависимость степени гидролиза ФХ в мицеллярной фазе,сформированной холатом натрия (13), под воздействием сыворотки крови здорового донора и больного. Условия проведения реакции были следующие ФХ 0,51 мМ,22 мМ,комн. Реакционная смесь объемом 2,2 мл содержала 0,8 мл сыворотки. Установлено, что активность ФЛА 2 сыворотки больного в 2,7 выше активности фермента здорового донора степень гидролиза субстрата составляет 8,1 и 22 соответственно(фиг. 2 Б). Таким образом, получены сходные данные об активности ФЛА 2 больного по сравнению со здоровым донором, полученные двумя разными методами предлагаемым методом и используемым в клинической практике. Однако чувствительность известного метода с использованиемне позволяет достоверно зафиксировать фосфолипазную активность в сыворотке донора спустя 20 ч от начала реакции. В то же время гемопротеидный метод позволяет детектировать активность за этот промежуток времени даже в 20 мкл реакционной смеси данного образца Т 41 мм, что соответствует 0,0638 Источники информации 1. Савельев , Буянов В.М., Огнев Ю.В. Острый панкреатит.- . Медицина, 1983. 2. Литвинко Активность фосфолипаз А 2 и С при биохимическом моделировании.- Минск Технопринт, 2002. 3. Асатиани Ферментные методы анализа.- . Наука, 1969.- С. 490. 4. Кисель М.А., Литвинко Н.М. Химико-фармацевтический журнал.- 1995.-6.С. 19-22. 5. Литвинко Н.М., Кисель М.А. Эндогенные фосфолипазы А 2. Структура и функция. Минск Навукатэхнка, 1991.- 270 с. 6. Скоростецкая Л.А., Головач О.А., Таганович А.Д., Литвинко Н.М. Молекулярные,мембранные и клеточные основы функционирования биосистем Сб. ст. / Под ред. И.Д. Волотовского и др.- 2006. . .- С. 249-251 (прототип). 7. Ахрем А.А., Шумелина Т.А., Литвенко Н.М., Линник О.И., Кисель М.А. Изучение специфичности фосфолипазы А 2 на субсодержащих структурах, имеющих разную надмолекулярную организацию // Биохимия. - 1989. - Т. 54. -4. - С. 687-693. 8.,,// . . - 1975. - . 114. -1. - . 129-141. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6