Способ моделирования нейродегенеративного поражения центральной нервной системы у крысы

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНОГО ПОРАЖЕНИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ У КРЫСЫ(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-производственный центр Институт фармакологии и биохимии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Мойсеенок Андрей Георгиевич Омельянчик Софья Николаевна Шевалье Анна Александровна Евкович Инна Николаевна Радута Елена Францевна Гуринович Валерий Александрович Слышенков Вячеслав Степанович Пеховская Татьяна Александровна Петухова Тамара Паатовна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-производственный центр Институт фармакологии и биохимии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ моделирования нейродегенеративного поражения центральной нервной системы у крысы, включающий введение хлорида алюминия внутрибрюшинно в дозе 190 мг/кг массы тела в 1 и 3 дни опыта, отличающийся тем, что дополнительно на 14 день опыта вводят липополисахарид 111 В 4 подкожно в дозе, инициирующей падение уровня кофермента А в нейроструктурах головного мозга. Изобретение относится к области экспериментальной медицины, а именно к моделированию нейродегенеративных патологических процессов центральной нервной системы,и может использоваться для выяснения патогенеза нейродегенеративных болезней, таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, рассеянный склероз, синдром Халлервордена-Спатца, боковой амниотрофический склероз и др., а также разработки патогенетических способов лечения указанных заболеваний. В последние годы при углубленном изучении нейродегенеративного синдрома Халлервордена-Спатца доказан генетический дефект ключевого фермента биосинтеза кофермента А(КоА) - пантотенаткиназы 1, и предложена технология патогенетической терапии с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей синтез белка пантотенаткиназы 2. Эта область нейрохимии и нейропатологии быстро развивается. Синдром ХаллерворденаСпатца определен как аутосомальное рецессивное нейродегенеративное заболевание,классифицированное в нозологической форме пантотенаткиназо-ассоциированная нейро 11160 1 2008.10.30 дегенерация (ПКАН). Особенностью последней являются клинические симптомы и патогенетические механизмы, позволяющие рассматривать ПКАН в качестве модели нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона. Наиболее близким к заявляемому является способ моделирования нейродегенеративных заболеваний (болезни Альцгеймера и других) путем введения хлористого алюминия,вызывающего алюминиевый нейротоксикоз и приводящего к повреждению нейрональных мембран продуктами окислительного стресса 3. Алюминиевый нейротоксикоз как модель болезни Альцгеймера характеризуется окислительными нарушениями в гиппокампе(нейроструктура, страдающая при болезни Альцгеймера), что позволяет ее использовать для изучения патогенеза заболевания и нейропротекторных препаратов. В наиболее распространенном варианте моделирование осуществляется путем двукратного внутрибрюшинного введения хлорида алюминия в дозе выше 120 мг/кг массы тела белых крыс на 1-й и 3-й день эксперимента и наблюдением морфо-биохимических нарушений на 10-14-й день эксперимента, в том числе изменения прооксидантно-антиоксидантного равновесия 4. Патогенетическая роль окислительного стресса (ОС) при нейродегенерации является показанием к назначению антиоксидантной терапии данной группы заболеваний 5. Недостатком данного способа является невозможность моделирования болезней, сочетающихся с нарушением биосинтеза КоА и развитием ОС в нейроструктурах мозга,подверженных нейродегенеративной патологии и воспроизводящих основной патогенетический механизм (нарушение системы КоА), характерный для ПКАН. Алюминиевый токсикоз не обеспечивает синхронного индуциирования в коре больших полушарий и гиппокампе ОС и выраженных нейродистрофических изменений. Дополнительным фактором, важным для процесса моделирования нейродегенеративных процессов, является сочетание нейродегенеративных и флогоинициирующих механизмов, приводящих к повышенному образованию -амилоидного пептида, что возможно при дополнительном введении противовоспалительного агента - липополисахарида. Задача изобретения - осуществить моделирование дегенеративных поражений нейрональных структур коры больших полушарий и гиппокампа, сочетающихся с нарушением биосинтеза КоА и развитием окислительного стресса. Поставленная задача решается путем внутрибрюшинного введения лабораторным животным (белые крысы линии ) хлористого алюминия в дозе до 190 мг/кг массы тела в 1 и 3 день от начала опыта, при этом отличительным моментом является то, что дополнительно на 14-й день после первой инъекции алюминия вводят подкожно препарат липополисахарида 111 В 4 в дозе, инициирующей падение уровня кофермента А в нейроструктурах головного мозга. Способ осуществляют следующим образом. Белым крысам линиимассой 180-200 г, получающим сбалансированный рацион вивария, производят двукратное (на 1-й и 3-й день от начала эксперимента) внутрибрюшинное инъецирование раствора хлорида алюминия в дозе до 190 мг/кг массы тела и на 14-й день после первой инъекции алюминия дополнительно вводят подкожно препарат липополисахарида (ЛПС)111 В 4. Спустя 24 ч наблюдают развитие гипертермии, окислительного стресса и дегенеративные изменения в нейроструктурах головного мозга. Целесообразность использования алюминиевого нейротоксикоза в предлагаемом способе и его выбор в качестве прототипа определяются применением данной модели для изучения патогенеза болезни Альцгеймера, характерным дистрофическим поражением нейронов гиппокампа и, что подтверждено нашими сравнительными исследованиями,инициированием ОС в коре больших полушарий головного мозга и последними сообщениями литературы 6, 7. Необходимость дополнительного введения ЛПС . связана с его способностью стимулировать накопление в нейронах белка предшественника -амилоида 8 и вызывать 2 11160 1 2008.10.30 дегенеративные изменения в гиппокампе и энторинальной коре 9. Однако введение ЛПС инициирует преимущественно эндогенную интоксикацию, гипертермию и в меньшей мере, по сравнению с алюминиевым нейротоксикозом, инициирует проявления ОС. Величины использованных доз нейротоксикантов были установлены на основании проведения дополнительных опытных испытаний, а также путем анализа литературных данных. Дальнейшее их повышение и изменение соотношений, описанных в способе, не сопровождалось увеличением степени развития ОС и нарушения биосинтеза КоА. В то же время снижение доз не приводит к необходимому эффекту. Приводим доказательства возможности осуществления способа. Пример 1. Использовали 18 белых крыс-самок массой 180-200 г, разделенных на 3 группы по 6 животных в группе 1 группа - контрольная (интактная), 2 группа - введение 3 двукратно в/б в дозе 190 мг/кг за 14 дней до декапитации, 3 группа - сочетанное действие через 14 суток после введения А 1 С 13 в/б в дозе 190 мг/кг вводится ЛПС .в дозе 400 мг/кг за сутки до декапитации. На окрашенных по методу Ниссля препаратах головного мозга крыс под световым микроскопом проводили общую оценку и анализ пирамидных нейронов ганглиозного слоя сенсомоторной коры больших полушарий и пирамидных нейронов гиппокампа белых крыс 10. Кроме того, проводили измерение объемовядер вышеуказанных нейронов. Измерение объемов производилось с помощью компьютерного анализатора изображений-. При введении животным 3 пирамидные нейроны гиппокампа сохраняют нормальное строение. В ганглиозном слое сенсомоторной коры больших полушарий наряду с нейронами, имеющими нормальное строение, встречаются в достаточно большом количестве патологически измененные нейроны. Для них характерны набухание и лизис цитоплазмы и ядрышек, гиперхромное набухание с последующим гиперхроматозом и сморщиванием нейронов. При сочетанном действии изменения морфологии затрагивают как пирамидные нейроны ганглиозного слоя сенсомоторной коры больших полушарий, так и гиппокампа. Изменения более выражены, чем при действии одного 3. В коре наблюдаются случаи гиперхромного набухания и лизиса нейронов с очагами клеточного опустошения гиперхроматоза и сморщивания нейронов с последующей гибелью отека апикальных отростков. В гиппокампе наблюдаются случаи набухания и лизиса цитоплазмы с последующим некрозом клеток. Объемы ядер пирамидных нейронов коры и гиппокампа у подопытных животных отличаются от таковых у контрольных животных. При введении 3 объемы ядер возрастают и у нейронов коры, и у нейронов гиппокампа - на 13,9 и 7,5 соответственно. При сочетанном действии 3 и ЛПС объем ядер нейронов коры уменьшается на 10,2 ,объем ядер нейронов гиппокампа возрастает на 12,7 . Однако достоверные различия с контрольными показателями наблюдаются только у нейронов коры при сочетанном действии (табл. 1). Таблица 1 Объем ядер пирамидных нейронов ганглиозного слоя сенсомоторной коры больших полушарий и гиппокампа (мкм)3 у животных подопытных и контрольной групп Вид Объем ядер нейроновк контроль- Объем ядер нейроновк контвоздействия коры, мкм 3 ным гиппокампа, мкм 3 рольным 3 531,54126,32 113,9 364,4364,20 107,5 3 ЛПС 418,8312,7389,8 382,09142,63 112,7 Контроль 466,5318,98 338,9182,13- статистически достоверные различия с контрольными показателями. 3 11160 1 2008.10.30 Таким образом, как 3, так и сочетание его с ЛПС приводят к нарушениям морфологии и снижению биосинтетической активности пирамидных нейронов ганглиозного слоя сенсомоторной коры больших полушарий и гиппокампа. При этом выраженность влияния существенно больше при сочетанном действии вышеуказанных препаратов, когда изменения затрагивают и нейроны коры, и нейроны гиппокампа. Для нейронов коры нарушения морфологии выражаются в гиперхромном набухании цитоплазмы, гиперхроматозе и сморщивании нейронов с последующей их гибелью. Для нейронов гиппокампа эти нарушения выражаются в набухании и лизисе цитоплазмы с последующим некрозом клеток. На снижение биосинтетической активности в нейронах коры косвенно указывает достоверное уменьшение объемов ядер нейронов при сочетанном действии препаратов. Результаты биохимических исследований отражены в табл. 2-5. Таблица 2 Содержание общего КоА (нмоль/г ткани) в гомогенатах отделов головного мозга белых крыс Группы Как следует из табл. 2, только сочетанное применение двух нейротоксических факторов приводит к падению системы биосинтеза КоА - важнейшего патогенетического звена ПКАН. Таблица 3 Антиокислительная активность (АОА) и содержание малонового диальдегида(наработка тиобаритурат-реагирующих продуктов - ТБРП) в субклеточных фракциях больших полушарий головного мозга белых крыс Группы Из табл. 3 видно, что только при предлагаемом способе наблюдается падение общей антиокислительной активности в синаптосомально-митохондриальной фракции больших полушарий головного мозга, а также выраженная индуцибельность активации перекисного окисления липидов (более чем в 2 раза превосходящую таковую в прототипе модели). Кроме того, предлагаемый способ характеризуется падением основной антиокислительной активности в растворимом компартменте клеток нервной ткани и, следовательно, высокой предрасположенностью к развитию ОС. В табл. 4 отображена отличительная способность предлагаемого способа в инициировании ОС. Относительно прототипа выраженные и достоверные изменения зарегистрированы в следующих лабораторных показателях плазмы крови общие продукты окислительного стресса, содержание малонового диальдегида, реакции эритроцитов с нильским голубым и концентрации продуктов эндогенной интоксикации. 4 11160 1 2008.10.30 Таблица 4 Показатели окислительного стресса в крови белых крыс Контроль Группы Общие продукты окислительного стресса, у.е./мл плазмы Малоновый диальдегид,нмоль/мл плазмы Малоновый диальдегид,нмоль/мл взвеси эритроцитов Малоновый диальдегид,нмоль/г гемоглобина Реакция с нильским голубым,у.е./г гемоглобина Продукты эндогенной интоксикации, у.е./мл плазмы В табл. 5 отображены показатели, характеризующие развитие ОС в коре больших полушарий головного мозга и гиппокампе, свидетельствующие, что степень нарушения системы глутатиона в нейроструктурах практически одинакова при использовании предлагаемого способа и прототипа (алюминиевый нейротоксикоз). Таблица 5 Показатели системы глутатиона в гомогенатах отделов головного мозга белых крыс Группы Алюминиевый нейротоксикоз Большие полушария 10,430,24 3,370,25 0,330,02 0,460,01 31,941,29 7,451,22 Гиппокамп 8,300,84 6,130,92 Алюминиевый Контроль нейротоксикоз 0,290,02 0,490,02 27,891,19 12,391,22 Контроль Р 0,05 по отношению к контролю. Как следует из представленных материалов, предлагаемый способ моделирования приводит к достоверному снижению конечного продукта пантотенаткиназной реакции КоА - в коре больших полушарий головного мозга и гиппокампе. Тем самым достигается реализация основного патогенетического механизма ПКАН - нарушение активности биосинтеза КоА. Таким образом, предлагаемый способ действительно приводит к существенным различиям нарушений прооксидантно-антиоксидантного равновесия в нейроструктурах по сравнению с алюминиевым нейротоксикозом, избранным в качестве прототипа. В частности,на фоне падения уровня КоА, в больших полушариях и гиппокампе наблюдается более чем 2-кратный рост наработки малонового диальдегида в синаптосомально-митохонд 5 11160 1 2008.10.30 риальной фракции больших полушарий головного мозга подопытных животных по сравнению с алюминиевым нейротоксикозом, а также более выраженное падение антиокислительной активности в синаптосомах и постмитохондриальном супернатанте. Предлагаемая модель проста, воспроизводима и может быть использована для изучения патогенетических механизмов, а также для разработки способов коррекции нейродегенеративных поражений центральной нервной системы. Источники информации 1..-// . . . .2002. - .6. -5. - . 243-247. 2. Патент 03008626. 3. Ваградян А.Г., Галоян А.А., Агаджанов М.И., Симонян М.А., Зильфян А.В. Исследование некоторых иммунологических и нейрохимических аспектов болезни Альцгеймера// Нейрохимия. - 2003. - Т. 20. -4. - С. 290-294. 4. Агаджанов М.И., Ваградян А.Г., Симонян М.А., Галоян А.А. Влияние обогащенного пролином синтетического пептида на содержание металлопротеинов и перекисное окисление липидов у крыс при алюминиевом нейротоксикозе (модель болезни Альцгеймера) // Нейрохимия. -2000. - Т. 17. - 4. - С. 294-297. 5..,С.,,В.,.,.-...,. 2004. - . 182-183. 6. Ваградян А.Г. Обогащенный пролином пептид (галармин) - нейропротекторный модулятор окислительного повреждения при хронической алюминиевой интоксикации // Нейрохимия. -2003. -Т. 20. - 2. -С. 139-142. 7. Закарян А.Е., Агаджанов М.И., Погосян Г.А., Ашотян А.Г., Енкоян К.Б., Галоян А.А. Фотохемилюминесценция гомогенатов органов крыс при воздействии галармина на фоне алюминиевого нейротоксикоза // Нейрохимия. -2004. -Т. 21. - 2. - С. 152-157. 8.В.,,.,, - .,.-// . . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6