Флуориметрический детектор для микроколоночной хроматографии и капиллярного электрофореза

ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКИЙ ДЕТЕКТОР ДЛЯ МИКРОКОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА(72) Авторы Анисимов Андрей Владимирович Булат Олег Эдуардович Попкович Геннадий Борисович Лобазов Александр Филиппович(73) Патентообладатель Частное научнопроизводственное унитарное предприятие ХРОМДЕТЕКТ(57) Флуориметрический детектор для микроколоночной хроматографии и капиллярного электрофореза, содержащий оптически связанные источник света, фокусирующую систему линз, проточную кювету, узел сбора и транспортировки излучения флуоресценции, установленный в плоскости, перпендикулярной плоскости возбуждения флуоресценции, и регистрирующий фотоприемник, отличающийся тем, что источник света выполнен в виде двух светодиодов с длиной волны излучения в области 370-460 нм., симметрично установленных под углом 45 к продольной оси проточной кюветы, проточная кювета выполнена в виде кварцевой трубки с внутренним диаметром, соответствующим условию максимального сохранения разрешения хроматографического и электрофоретического разделения, линзы сбора флуоресценции установлены с двух сторон проточной кюветы, а средство транспортировки излучения флуоресценции к регистрирующему фотоприемнику выполнено в виде двухканального многоволоконного световода. 7957 1 2006.04.30 Изобретение относится к аналитической спектроскопии, более точно касается флуориметрических детекторов для микроколоночной хроматографии и капиллярного электрофореза, может быть использовано для анализа малых количеств флуоресцирующих веществ. К детекторам для жидкостной хроматографии и капиллярного электрофореза предъявляются следующие общие требования высокая чувствительность, низкий уровень отношения сигнал-шум, широкий диапазон линейности. Кроме того, с точки зрения хроматографического и электрофоретического разделения важно также соблюдение ряда требований, предъявляемых к конструкции измерительной ячейки детектора небольшой детектируемый объем, хорошая промываемость, отсутствие условий для перемешивания разделенных компонентов. Основным условием для сохранения разрешающей способности методов (микроколоночной хроматографии и капиллярного электрофореза) является выполнение следующего требования(1) 01 2 1 ,где 0 - детектируемый объем, включающий в себя непосредственно объем измерительной ячейки детектора и объем жидкостного тракта от выхода хроматографической колонки до измерительной ячейки, 1 - объем элюционного пика. С другой стороны, использование малых детектируемых объемов приводит к увеличению доли прямого рассеянного света возбуждения флуоресценции, попадающего на регистрирующий фотоприемник. При низких концентрациях анализируемых веществ эта доля может превышать полезный сигнал флуоресценции детектируемых компонентов, что снижает чувствительность детектирования. Известен флуориметрический детектор для микроколоночной хроматографии, содержащий оптически связанные источник света, фокусирующую линзу, проточную кювету,систему сбора и регистрации флуоресценции ( Н..- . - .28. - . 4, 1980. - . 1337-1339). Проточная кювета в этом устройстве выполнена в виде кварцевой трубки, к которой для соединения с хроматографической колонкой перпендикулярно приварена другая трубка меньшего диаметра. В верхний торец кюветы введен волоконный световод, на конце которого установлена фокусирующая линза. Возбуждение флуоресценции происходит в зоне поступления исследуемых веществ из трубки малого диаметра в трубку большого диаметра. При этом световод с фокусирующей линзой устанавливается на таком расстоянии, что свет возбуждения флуоресценции не касается стенок трубки в зоне, с которой осуществляется сбор излучения флуоресценции. Выбор этой зоны осуществляется круглой регулируемой диафрагмой, установленной на одной оси с трубкой малого диаметра. Таким образом, достигается зашита фотоприемника от рассеянного света возбуждения флуоресценции. Данная конструкция флуориметрического детектора характеризуется невысокой разрешающей способностью, вследствие сильного размывания хроматографических фракций на повороте тока жидкости из трубки малого диаметра в трубку большего диаметра, где имеет место нарушения ламинарности потока. Также известен флуориметрический детектор, содержащий оптически связанные источник света, фокусирующую систему линз, узел сбора и транспортировки излучения флуоресценции и регистрирующий фотоприемник. (Флуориметрический детектор для микрокапиллярной хроматографии и капиллярного электрофореза -250,АВ, , ). Проточной кюветой в этом детекторе служит кварцевый капилляр с внутренним диаметром, соответствующим условию (1). Возбуждение флуоресценции проводится на определенном участке кварцевого капилляра, а сбор части флуоресценции, которая распространяется по капилляру, вследствие полного внутреннего отражения на границе стенка капилляра-воздух, проводится в точке удаленной от участка возбуждения флуоресценции 2 7957 1 2006.04.30 на некоторое расстояние, посредством эллиптического отражателя, ось которого совпадает с осью капилляра. Точка сбора флуоресценции является первым фокусом эллиптического отражателя, во втором фокусе установлен волоконный световод, который транспортирует излучение флуоресценции к регистрирующему фотоприемнику. Конструкция флуориметрического детектора, несмотря на пространственное разделение возбуждения, и сбора флуоресценции, полностью не исключает попадание прямого рассеянного света на фотоприемник детектора. Для фокусировки света возбуждения флуоресценции используется короткофокусная линза, имеющая апертуру сведения света,при которой направление части лучей попадает под условие полного внутреннего отражения распространения света по используемому капилляру. Пройдя путь вместе с флуоресценцией анализируемых веществ до регистрирующего фотоприемника, этот свет уменьшает чувствительность детектирования. Наиболее близким по технической сущности к настоящему изобретению является флуориметрический детектор, содержащий источник света, систему формирования излучения (фокусирующую систему), проточную кювету, канал сбора, передачи и регистрации флуоресцентного излучения, оптическая ось которого расположена под углом 90 к оптической оси канала возбуждения флуоресценции ( 2071055 С 1, 1996). Приведенная конструкция и оптическая схема флуориметрического детектора не позволяет эффективно исключить влияние рассеянного света возбуждения на регистрирующий фотоприемник детектора, что приводит к снижению чувствительности детектирования. Рассмотренные конструкции детекторов не позволяют работать одновременно с высокой чувствительностью и разрешающей способностью. Кроме того, изготовление проточной кюветы для первого описанного детектора и эллиптического отражателя для второго,требует специальной, высокотехнологичной техники, что существенно увеличивает цену детектора. Задачей данного изобретения является создание высокочувствительного флуориметрического детектора с сохранением максимального разрешения хроматографического и электрофоретического разделения компонентов исследуемых веществ. Эта задача решается тем, что во флуориметрическом детекторе для микроколоночной хроматографии и капиллярного электрофореза, содержащем оптически связанные источник света, фокусирующую систему линз, проточную кювету, узел сбора и транспортировки излучения, установленный в плоскости, перпендикулярной плоскости возбуждения флуоресценции, и регистрирующий фотоприемник, источник света выполнен в виде двух светодиодов с длиной волны излучения в области 370-460 нм, симметрично установленных под углом 45 к продольной оси проточной кюветы, проточная кювета выполнена в виде кварцевой трубки с внутренним диаметром, соответствующим условию максимального сохранения разрешения хроматографического и электрофоретического разделения,линзы сбора флуоресценции установлены с двух сторон проточной кюветы, а средство транспортировки излучения флуоресценции к регистрирующему фотоприемнику выполнено в виде двухканального многоволоконного световода. Флуориметрический детектор для микроколоночной хроматографии и капиллярного электрофореза, выполненный в соответствии с настоящим изобретением, позволяет проводить высокочувствительное детектирование с сохранением максимального разрешения хроматографического и электрофоретического разделения компонентов исследуемых веществ. Конструкция проточной кюветы обеспечивает ламинарность потока жидкости в зоне сбора излучения флуоресценции. Использование оптической схемы возбуждения флуоресценции с симметрично установленными под углом 45 двух светодиодов позволяет получить высокую интенсивность света в детектируемом объеме, при этом обеспечивая минимальное влияние прямого рассеянного света на приемник излучения флуоресценции. Узел сбора флуоресценции в сочетании с двухканальным многоволоконным световодом в 3 7957 1 2006.04.30 два раза увеличивает плотность излучения флуоресценции на фотокатоде фотоэлектронного умножителя. Предлагаемое устройство поясняется чертежами. На фиг. 1 изображена оптическая схема детектора для микроколоночной хроматографии и капиллярного электрофореза. На фиг. 2 то же, что и на фиг. 1 в изометрии. Изображенный на фиг. 1 и 2 флуориметрический детектор для микроколоночной хроматографии и капиллярного электрофореза содержит оптически связанные и расположенные последовательно два светодиода 1, фокусирующие линзы 2, проточную кювету 3,линзы сбора флуоресценции 4, двухканальный световод 5, держатель кюветы 6 и регистрирующий фотоприемник 7. Светодиоды 1 с длиной волны излучения 370-460 нм симметрично установлены под углом 45 относительно продольной оси проточной кюветы. Проточная кювета 3 изготовлена из кварцевой трубки, вставленной в держатель 6 из нержавеющей стали. Вход держателя имеет стандартное резьбовое соединение с хроматографической колонкой. Выход выполнен аналогично входу. Двухканальный световод 5 состоит из двух рукавов, составленных из большого количества одноволоконных световодов, сведенных на другом конце в единый многоволоконный световод. Регистрирующим фотоприемником 7 служит фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Детектор работает следующим образом. Разделенные компоненты анализируемой смеси веществ из хроматографической колонки поступают в сквозной канал кюветы 3 без нарушения ламинарности потока. Излучение светодиодов 1 фокусируется линзами 2 в детектируемый объем проточной кюветы 3, возбуждая флуоресценцию разделенных компонентов вещества. Излучение флуоресценции собирается линзами 4 и транспортируется световодом 5 к регистрирующему фотоприемнику 7. Излучение светодиодов 1, направленных на кювету 3 под углом 45, частично отражается от внешней и внутренней стенок кюветы в соответствии с законом отражения света. В пределах угла падения света 90-45 процент отраженного света практически остается неизменным (Лансберг Г.С. Оптика. Глава 23. - С. 470-479). Такая геометрия возбуждения флуоресценции с одной стороны позволяет эффективно использовать всю мощность излучения светодиодов и одновременно вывести прямой рассеянный свет из апертуры сбора флуоресценции. Прямоточное соединение выхода хроматографической колонки с кюветой, имеющей круглое сечение канала, обеспечивает минимальное размывание разделенных компонентов анализируемой смеси веществ. Изготовлен опытный образец флуориметрического детектора для микроколоночной хроматографии и капиллярного электрофореза согласно изобретению. Проточная кювета была изготовлена из кварцевой трубки с внутренним диаметром 0,4 мм. Внешний диаметр 4 мм, длина кюветы 10 мм. Для капиллярного электрофореза измерительной ячейкой служил кварцевый капилляр (с внутренним диаметр - 0,05 0,075 мм), используемый для разделения анализируемых веществ. Детектируемый объем для микроколоночной хроматографии составлял 200 нл, для капиллярного электрофореза менее 1 нл. Источником света для возбуждения флуоресценции были выбраны светодиоды с длиной волны 375 нм 460 нм (компанияЯпония). Световод имел диаметр входных торцов - 3 мм, общего выхода - 5 мм. Длина - 1000 мм. Таким образом, детектируемый объем удовлетворяет условию (1), принятому в жидкостной хроматографии и капиллярном электрофорезе. При этих условиях с микроколонкой 2120 мм была получена пороговая чувствительность детектирования флуоресцеинизоцеанатных производных аминокислот 5,10-16 моль в хроматографическом пике. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5