Пероральная вакцина против диареи

(71) Заявитель СБЛ ВАКЦИН АБ(72) Авторы КАРЛИН Нильс АСКЕЛФ Пер БЬЯРЕ Ульф(73) Патентообладатель СБЛ ВАКЦИН АБ(57) 1. Пероральная вакцина против диареи у людей, вызываемой энтеротоксигенной ., содержащая, по крайней мере, 100 г каждого, по крайней мере, из трех различных видов антигенов колониеобразующего фактора , выбираемых из группы, включающей,(1, 2 и 3) и(4, 5 и 6), на основе инактивированных бактерий . , у которых отсутствует ген, кодирующий термолабильный энтеротоксин , эффективное количество -субъединиц холерного токсинаи фармацевтически приемлемый носитель, при этом она очищена от видимого присутствия термостабильного энтеротоксина . 2. Пероральная вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что количествосоставляет,по крайней мере, 0,5 мг, а носителем является физиологически приемлемый буферный раствор. 3. Пероральная вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что количество различных видовсоставляет для каждого вида 100-300 г, а количествосоставляет 0,5-2,0 мг. 4. Пероральная вакцина по п. 3, отличающаяся тем, что содержит 200 г,200 г 1, 150 г 2, 200 г 4, 150 г 5 и 1,0 мг , а физиологически приемлемым буферным раствором является солевой раствор фосфатного буфера. Настоящее изобретение относится к пероральной вакцине против диареи. В частности,настоящее изобретение касается композиции пероральной вакцины против диареи у людей, вызываемой . . Бактерии и вирусы часто экспрессируются внутри или на поверхности их мембранных белков, которые в определенной среде действуют в качестве опоры, позволяющей организмам специфически ассоциироваться или прикрепляться к поверхности. Такой поверхностью может быть внутренняя стенка желудочно-кишечного тракта, пищевод или любая другая биологическая поверхность или мембрана, входящая в состав тела человека или животного, на которой организм может находить оптимальные условия для роста. Микробные мембранные белки такого рода часто называются антигенами колониеобразующего фактораили фимбриями. В литературе для такого рода веществ используются другие слова, такие как пили, гемагглютинины, волокнистые или фибриллярные белки. 7351 1 2005.09.30 Для удобства далее будет использоваться термин , охватывающий все виды мембранных белков, которые могут также обладать антигенными свойствами. У большинства организмов продуцирование ихконтролируется различными факторами окружающей среды, которые в свою очередь могут активировать регуляторные гены в плазмиде ДНК. Известен ряд бактерий, представляющих интерес для медицины, которые способны продуцировать , ассоциированные с их мембраной. К таким бактериям, имеющим наиболее важное значение для людей, относятся организмы, формирующие колонии в желудочнокишечном тракте и дыхательных путях человека. Примерами организмов, которые образуют колонии в желудочно-кишечном тракте, являются энтеротоксигенные,,, , ,и . Особый интерес с медицинской точки зрения представляет энтеротоксигенная, так как она является одной из главных причин диареи путешественников и детской диареи в развивающихся странах. По подсчетам она вызывает 1 миллиард случаев заболевания диареей и приводит к по крайней мере 1 миллиону летальных случаев в год, прежде всего летальных случаев среди детей. Энтеротоксигенные .характеризуются тем, что они продуцируют термолабильный энтеротоксини/или термостабильный энтеротоксин . В международной заявке 92/14487, раскрыт способ получения и применения пероральной вакцины на основе . Бактерииси их субкомпоненты(-антигены) выращивают в специфичных условиях. После инактивации формалином бактерии могут затем использоваться в качестве пероральной вакцины против бактерии.и С-антигены будут таким образом действовать в качестве антигенов в иммунологическом процессинге, который будет происходить в кишечнике. Имелись трудности с увеличением количества продуцируемых бактерий , включающих . Решение этих трудностей раскрыто в международной заявке 95/33825. Показано, что составы вакцин на основе , содержащие В-субъединицу холерного токсина, обладающего антигенным сходством с термолабильным энтеротоксином , а также антигены колониеобразующего фактора , стимулировали соответствующие иммунные ответы слизистой оболочки у добровольцев из Швеции ( .. , 1997 16255-260). Для надежности и эффективности продукта композиция вакцины должна быть нетоксична и содержать определенные количества активных ингредиентов, остающихся неизменными от серии к серии. Целью настоящего изобретения является композиция новой вакцины на основе отрицательных инактивированных энтеротоксигенных бактерий . , состоящая из эффективных количеств по крайней мере трех различных видов антигенов колониеобразующего фактора, а также В-субъединицы холерного токсина , обладающего антигенным сходством с термостабильным энтеротоксином . В последующем композицию вакцины очищают от видимо присутствующего термостабильного энтеротоксина .-отрицательные бактерииотбирают либо в лаборатории из естественным образом генетически модифицированных штаммов, либо продуцируют с помощью рекомбинантных механизмов. Видимо присутствующий термостабильный энтеротоксин, представляющий собой сравнительно небольшой белок длиной в 19 аминокислотных остатков, отмывают во время даунстрим процессинга вакцинной композиции. Элиминация видимо присутствующих бактерий для продуцирования термолабильного энтеротоксина и удаление видимо присутствующего термостабильного энтеротоксина способствует еще большей надежности продукта. Инактивацию бактерий следует осуществлять таким образом, чтобы антигены колониеобразующего фактора в значительной степени сохранялись, т.е. с помощью мягкой инактивации формалином. 2 7351 1 2005.09.30 Таким образом, задачей настоящего изобретения является композиция пероральной вакцины против диареи у людей, вызываемой энтеротоксигенной . , содержащая, по крайней мере, 100 г каждого, по крайней мере, из трех различных видов антигенов колониеобразующего фактора (СА), выбираемых из группы, содержащей,(1, 2 и 3) и(4, 5 и 6), на основе инактивированных бактерий ., у которых отсутствует ген, кодирующий термолабильный энтеротоксин , эффективное количество В-субъединиц холерного токсинаи фармацевтически приемлемый носитель, при этом она очищена от видимого присутствия термостабильного энтеротоксина , при этом количествосоставляет, по крайней мере, 0,5 мг, а носителем является физиологически приемлемый буферный раствор, а также количество различных видовсоставляет для каждого вида 100-300 г,составляет от 0,5 до 2,0 мг,при этом пероральная вакцина содержит 200 г 1, 200 г 1, 150 г 2, 200 г 4,150 г 5 и 1,0 мг , а физиологически приемлемым буферным раствором является солевой раствор фосфатного буфера. Одна доза вакцинной композиции будет содержать приблизительно 1011 бактерий. Вакцинную композицию назначают человеку в форме питья в стакане воды, содержащей карбонатный буфер, такой как бикарбонат натрия. Количественное определение различных антигенов колониеобразующего фактора. Антигены фимбрий .выявляют методом ингибиторного иммуноферментного анализа , в основном, так, как описано - .. Клиническая микробиология. - Том 26, 1988. - С. 1967-1972. Кратко, анализируемую бактериальную пробу инкубируют вместе с фиксированным количеством моноклональных антител, направленных против . После инкубации смесь переносят на пластинку, предварительно покрытую , на которой остаточные моноклональные антитела могут связываться с . Связанные антитела наблюдают визуально с добавлением антимышиного иммуноглобулина, конъюгированного с пероксидазой хрена. В качестве питательной среды используют о-фенилендиаминдигидрохлорид в цитратном буфере. Оптическую плотность измеряют при 450 нм на спектрофотометре, подсоединенном к компьютеру с предварительной обработкой данных. Наблюдаемая оптическая плотность обратно пропорциональна концентрации антитела в пробе. Состав вакцинной композиции. Серию пероральной ЕТЕС-вакцины получали из моновалентных объемов инактивированных формалином штаммов 101 / , 106 1 , 107 2 , 104 4 и 105 5 соответственно и моновалентного объема очищенного гСГВ. Композиция Наименование ингредиентов Единица Функция Активные вещества 1. Моновалентный объем . , А/ -101,2,0102 г инактивированная формалином фимбрий 2. Моновалентный объем . , 1 -106,2,0102 г инактивированная формалином фимбрий 3. Моновалентный объем . , 2 -107,1,5102 г Для усиления иммунинактивированная формалином фимбрий ного ответа против бактерий 2 4. Моновалентный объем . , 4 -104,2,010 г инактивированная формалином фимбрий 5. Моновалентный объем . , 5 -105,1,5102 г инактивированная формалином фимбрий 6. Моновалентный объем СТВ, очищенный 1,0 мг Транспорт 7351 1 2005.09.30 Штаммы -104 и -105 также продуцировали 6, но его количество не установлено. Штамм -107 также продуцировал 3, но его количество не установлено. Опытное исследование для оценки эффективности и реактогенности пероральной цельноклеточной ЕТЕС-вакцины с инактивированной В-субъединицей против диареи у путешественников согласно изобретению. Проводили двукратную иммунизацию в шифрованном исследовании с применением препарата плацебо в качестве контроля. Лиц для обследования отбирали методом случайной выборки. Были сформированы три группы путешественников из Австрии. Кроме ЕТЕСвакцины, в исследования была также включена цельноклеточная холерная вакцина с Всубъединицей, которая, как показали исследования в Бангладеш ( .., 1988, 158372-377) и в Марокко с финскими путешественниками ( .. ,1991, 3381285-89), обеспечивала значительную защиту против -диареи, вызываемой . . В состав указанных групп вошли 250 добровольцев, взрослых и детей, направлявшихся в путешествие по тропическим и субтропическим регионам (44 страны в Африке, Азии и Латинской Америке) с предполагаемым сроком пребывания от 7 до 23 дней. Двенадцать человек из них были отстранены от участия в исследовании вследствие нарушения протокола. Таким образом, численность путешественников, намеревавшихся пройти курс лечения,составила 238 человек, а численность следовавших протоколу, т.е. полностью выполнивших все требования, составила 187 человек. Были введены две последовательных дозы вакцины или плацебо с интервалом от 7 до 21 дня, однако не ранее, чем за 7 дней до, и не позднее, чем за 30 дней после отъезда. Поствакцинационные реакции и осложнения отмечены после введения обеих доз. Все добровольцы, принимавшие участие в исследовании,вели ежедневный дневник с записью случаев заболевания диареей во время пребывания за границей и были оснащены средствами для транспортировки забираемых проб стула в случае диареи (пробиркии Сагу ). Путешественники получили инструкции сдать их дневники и пробирки с пробами сразу же по возвращении. Пробы крови для определения иммуногенности брали у 73 добровольцев до и после введения первой и второй дозы вакцины или плацебо. Пробу после первой дозы брали сразу же перед введением второй дозы, а пробу после второй дозы брали после возвращения. Составы, введенные путешественникам трех групп, отобранных методом случайной выборки, были следующими ЕТЕС-вакцина, содержащая 1 мг рекомбинантной В-субъединицы холерного токсина плюс 1011 инактивированных формалином бактерийиз пяти штаммов , экспрессирующих наиболее типовые антигены колониеобразующего фактора , такие как,(1, 2 и 3) и(4, 5 и 6) цельноклеточная холерная вакцина с В-субъединицей (зарегистрирована в Швеции с 1992 г.),содержащая 1 мг рекомбинантной В-субъединицы холерного токсина и 10 инактивированных цельных клеток (Инаба, Огава, классических и Эль-Тор) препарат плацебо, содержащий 1011 инактивированного .12. Составы суспендировали в 4 мл буфера. Каждую дозу вакцины или плацебо вводили в форме питья в 150 см 3 раствора бикарбоната натрия. Выделение и характеристику бактерийи анти-СТВосуществляли, как описано ( .. ). 250 добровольцам вводили одну дозу вакцины или плацебо, из них 246 добровольцам вводили вторую дозу. До начала исследования протокол его проведения был одобрен местной Комиссией по этике. До случайной выборки было получено письменное согласие добровольцев. Результаты реактогенности следующие. В целом у 43 добровольцев (17 ) отмечены слабые или средние желудочно-кишечные или общие реакции после первой дозы 13(16 ) в группе, получавшей плацебо, 13 (16 ) в группе, получавшей холерную вакцину,и 17 (20 ) в группе, получавшей ЕТЕС-вакцину. После второй дозы реакции отмечены у 20 (8 ) добровольцев 6 (7 ) в группе, получавшей плацебо, 7 (9 ) в группе, получавшей 4 7351 1 2005.09.30 холерную вакцину, и 7 (8 ) в группе, получавшей ЕТЕС-вакцину. Частота реакций в исследуемых группах статистически не различалась. При оценке эффективности вакцин проявление диареи, вызываемой , определяли по жидкому стулу в трех и более случаях и по обнаружению(без других патогенов) в пробах стула до вакцинации. У добровольцев, следовавших протоколу,обнаружены в 5 случаях (8 ) в группе, принимавшей плацебо, в 6 случаях (10 ) в группе, принимавшей холерную вакцину, и в 1 случае (2 ) в группе, принимавшей ЕТЕС-вакцину. Эффективность вакцины, что касается ЕТЕС-вакцины по отношению к препарату плацебо,составила 79(р 0,119), а по отношению к холерной вакцине - 84(р 0,0496). Сравнение интенсивности случаев диареи, вызываемых , осуществляли пробой Фишера. Все изолятыу добровольцев, следовавших протоколу, экспрессировали колониеобразующие факторы, включенные в вакцину. Холерная вакцина не давала достоверной защиты противпо сравнению с группой, получавшей препарат плацебо, но следует отметить, что в группе, принимавшей холерную вакцину, только два случаябыли вызваны бактериями, продуцирующими только термолабильный энтеротоксин , против которого холерная вакцина может теоретически действовать (через свою В-субъединицу). Таким образом, вследствие того, что в этой группе присутствовали исключительно отрицательные штаммы, холерная вакцина предположительно не дает никакого эффекта. Несмотря на эти результаты, следует иметь в виду, что описанная обработка проб стула может быть источником ошибки. При использовании средств транспортировки существует риск утраты чувствительных патогенов, в то время как менее чувствительные, такие как бактерии . , выживают, в результате чего наблюдаются недостоверные положительные случаи -диареи (см. определение ЕТЕС-диареи). Поэтому число случаев ЕТЕСдиареи, возможно, преувеличено. Маловероятно, однако, чтобы возможно недостоверные положительные случаи были неравномерно распределены по исследуемым группам. Что касается иммуногенности, в группе, получавшей -вакцину, методом антиСТВпоказан значительный рост антител к В-субъединице холерного токсина(геометрически средние титры до вакцинации против после вакцинации 7,8 против 58,7 после первой и 62,6 после второй дозы сероконверсия после второй дозы 91 ), в группе, получавшей холерную вакцину (7,6 против 54,6 после первой и 60,1 после второй дозы сероконверсия 100 ). В группе, получавшей плацебо, значительного роста в антиСТВ ответе не отмечено (7,9 против 8,3 после первой и 11,8 после второй дозы сероконверсия 29 ). Таким образом, хотя СТВ-холерная цельноклеточная вакцина индуцировала очень хороший ответ к В-субъединице, значительного влияния на ЕТЕС-диарею эта вакцина не оказала. Это могло быть преимущественно вызвано тем фактом, что большинство штаммов , выделенных у добровольцев, продуцировали только(9 из 12) и поэтому не могли ингибироваться холерной вакциной. Очевидно анти- антитела очень важны для защиты против, в частности, диареи, вызываемой -только . Данные результаты являются самыми первыми в пользу рабочей гипотезы, что анти/ иммунитет, индуцируемый пероральной ЕТЕС-вакциной, способен обеспечить защиту против диареи, вызываемой , продуцирующей только . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.