Способ получения культуры эпидермальных кератиноцитов человека и способ получения биополимерной композиции для восстановления кожного покрова человека

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЕРАТИНОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПОЛИМЕРНОЙ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КОЖНОГО ПОКРОВА ЧЕЛОВЕКА(71) Заявители Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем(72) Авторы Квачева Зинаида Болеславовна Бутенко Анна Викторовна Юркштович Татьяна Лукинична Беляев Сергей Александрович Корень Сергей Викторович Антоневич Наталья Георгиевна Кабанова Юлиана Анатольевна Амвросьева Тамара Васильевна(73) Патентообладатели Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем(57) 1. Способ получения культуры эпидермальных кератиноцитов человека, заключающийся в том, что получают кожный лоскут, отделяют эпидермис кожного лоскута от дермы по линии базальной мембраны с использованием диспазы, обрабатывают эпидермис при 37 С трехкратно по 20 мин 0,2 -ным раствором коллагеназы Н, отделяют центрифугированием эпидермальные кератиноциты и 8-10 дней культивируют их до образования монослоя в среде, содержащейи 12 в соотношении 31, гидрокортизон в концентрации 0,4 мкг/мл, эпидермальный фактор роста в концентрации 10 нг/мл, аденин в концентрации 1,810-4 М, инсулин в концентрации 5 мкг/мл, трансферрин в концентрации 5 мкг/мл, 3-йод-тиронин в концентрации 210-11 М и форсколин в концентрации 0,1 мкг/мл. 2. Способ получения биополимерной композиции для восстановления кожного покрова человека, отличающийся тем, что монослой эпидермальных кератиноцитов, полученный способом по п. 1, обрабатывают 0,5 -ным раствором диспазы с получением суспензии эпидермальных кератиноцитов, доводят концентрацию кератиноцитов в суспензии до 500000 в 1 мл, смешивают с высокозамещенным фосфатом декстрана, стерилизованным гамма-облучением, в соотношении 60 мл суспензии с концентрацией 500000 кератиноцитов в 1 мл и 6 мг высокозамещенного фосфата декстрана и термостатируют 1820 ч при 37 С, периодически встряхивая. 18533 1 2014.08.30 Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной биотехнологии, и может применяться в качестве способа культивирования стволовых клеток кожи и клетокпредшественников кератиноцитов и способа восстановления кожного покрова путем переноса иммобилизированных на биодеградируемом субстрате в виде геля или пленки на поврежденный кожный покров больных. В организме кожный покров человека постоянно обновляется за счет пролиферации кератиноцитов и их последовательной дифференцировки по направлению от базальной мембраны, разграничивающей эпидермис от дермы, к поверхности кожи. Установлено,что на базальной мембране сосредоточены ниши стволовых клеток. Они дают начало так называемым транзиторным клеткам (клеткам-предшественникам кератиноцитов), способным интенсивно размножаться и после нескольких делений вступать на путь дифференцировки. Поэтому для наращивания необходимой биомассы кератиноцитов в условиях культуры необходимо выделение именно этих клеток, а для повышения их метаболического и энергетического уровня необходимы дополнительные экзогенные стимуляторы. Известны способы выделения и выращивания пластов кератиноцитов кожи в культуре с использованием разных ферментов разделения клеток и разных ростовых средах 1. Недостатками известных способов является отсутствие данных о влиянии каждого из используемых ферментов на адгезивные и пролиферативные свойства стволовых клеток кожи и клеток-предшественников кератиноцитов. Наиболее близким, выбранным за прототип, является способ культивирования эпидермальных кератиноцитов 2, включающий 1. Кожный лоскут погружают в раствор диспазы на 14-16 ч для разделения эпидермиса от дермы, для обнажения базального слоя и выделения фрагменты эпителия из данной области. 2. Выделенные фрагменты эпителия обрабатывают протеолитическим ферментом 0,25 трипсином и 0,02 версеном в соотношении 11 в течение 5-10 мин при температуре 37 С. 3. Фильтруют через нейлоновый фильтр в центрифужную пробирку, добавляют 10 сыворотки для нейтрализации ферментативной активности трипсина. 4. Центрифугируют в течение 5 мин при 800-1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в ростовой среде 12 в соотношении 31 с добавлением 0,4 мкг/мл гидрокортизона,10-10 М холерного токсина, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, аденина 1,810-4 М,инсулина 5 мкг/мл, 5 мкг/мл трансферрина, 210-11 лиотиронина. Посев клеток проводят во флаконы, обработанные коллагеномтипа, и культивируют в инкубаторе при 37 С. Недостатком известного способа является использование трипсина для выделения эпидермальных клеток из базального слоя. Эффективное действие трипсина ограничено во времени (5-10 мин). Дальнейший его контакт приводит к повреждению мембран клеток и поверхностных рецепторов, что влияет на адгезивную способность клеток к субстрату. Другим недостатком методики является использование в качестве индуктора аденилатциклазной системы клеток (для повышения уровня метаболического и энергетического их статуса) субъединиц холерного токсина, являющегося потенциально опасным веществом биологического происхождения. Задачей изобретения является подбор более щадящих условий ферментативной обработки базального слоя эпидермиса и выделения большего количества стволовых клеток кожи и клеток-предшественников кератиноцитов, а также поиск состава ростовой среды с биобезопасным компонентом для индукции аденилатциклазной системы и обеспечения высокого уровня метаболического и энергетического статуса клеток, обеспечивающее избирательное накопление биомассы кератиноцитов. Результат достигается в способе получения культуры эпидермальных кератиноцитов человека, заключающемся в том, что получают кожный лоскут, отделяют эпидермис кож 2 18533 1 2014.08.30 ного лоскута от дермы по линии базальной мембраны с использованием диспазы, обрабатывают эпидермис при 37 С трехкратно по 20 мин 0,2 -ным раствором коллагеназы Н,отделяют центрифугированием эпидермальные кератиноциты и 8-10 дней культивируют их до образования монослоя в среде, содержащейи 12 в соотношении 31, гидрокортизон в концентрации 0,4 мкг/мл, эпидермальный фактор роста в концентрации 10 нг/мл, аденин в концентрации 1,810-4 М, инсулин в концентрации 5 мкг/мл, трансферрин в концентрации 5 мкг/мл, 3-йод-тиронин в концентрации 210-11 М и форсколин в концентрации 0,1 мкг/мл. Способ иллюстрируется следующими примерами. 1 (по способу-прототипу). Для приготовления культуры кератиноцитов используют образец кожи области бедра (1 см 2) (возраст пациента 37 лет). Для разделения эпидермиса от дермы для обнажения базального слоя и выделения клеточных фрагментов из данной области применяют фермент диспазу. Выделенный эпителий обрабатывают протеолитическим ферментом - 0,25 -ным трипсином - 30 мин. Количество собранных из образца клеток составляло 2,6 млн. клеток, жизнеспособность, оцененная после окраски их трипановым синим, составляла 682 . Далее фильтруют через нейлоновый фильтр в центрифужную пробирку для удаления остатков фрагментов ткани, добавляют 10 сыворотки эмбрионов коров для нейтрализации ферментативной активности трипсина. Центрифугируют в течение 5 мин при 800-1000 об/мин. В качестве ростовой среды используют 12 в соотношении 31 с добавлением 0,4 мкг/мл гидрокортизона, 10 нг/мл эпидермального фактора роста, 1,810-4 М аденина, 5 мкг/мл инсулина, 5 мкг/мл трансферрина, 23-йод-тиронина, 0,1 мкг/мл холерного токсина. Далее посев клеток (5 млн клеток в 10 мл ростовой среды) проводят во флаконы, обработанные бычьим коллагеном(25 см 2 посевная площадь). Время достижения сатурации монослоя 9-11 дней. 2 (по предлагаемому способу). Манипуляции, описанные в примере 1, выполняют те же, но эпителий базальной мембраны (стволовые и транзиторные клетки) обрабатывают трехкратно по 20 мин 0,2 -ным раствором коллагеназысо сбором надосадка клеток после каждого цикла обработки. Количество собранных клеток из образца 1,0 см 3 составляет 3,5 млн клеток, жизнеспособность - 87,52, в ростовую среду вносили вместо 0,1 мкг/мл холерного токсина форсколин (0,1 мкг/мл). Время достижения сатурации монослоя 8-10 дней. Таким образом, предлагаемый способ позволяет селективно выделить из образца кожи большее количество пролиферативно-активных кератиноцитов и при их дальнейшем культивировании накапливается значительно большее количество биомассы клеток за тот же промежуток времени. Известен способ восстановления кожного покрова 3, включающий выделение и последующее культивирование кератиноцитов на полимерной пористой подложке с последующей пересадкой их на раневую поверхность. При этом кератиноциты культивируют на подложке из оптически прозрачного полимера со сквозными порами диаметром 0,013,0 мкм и плотностью пор(103-109)1/см 2 до формирования монослоя кератиноцитов. Недостатками способа являются трудоемкость процесса изготовления оптически прозрачной пленки - облучение, травление, а также то, что пленка не является биодеградируемым материалом и после переноса на рану и заживления пленку приходится удалять, что травмоопасно. Кроме того, требуется длительный подготовительный этап ее приготовления. До конца не исследованы ее свойства на биосовместимость и токсичнось. К настоящему времени разработаны различные способы иммобилизации клеток на матрицу в виде губки, гелеобразующие покрытия, пленочные и другие для роста и иммобилизации клеток с последующим переносом и трансплантацией. Используются биодеградируемые полимеры, состоящие из различных сочетаний коллагена, гликозаминогликана, хитозана на основе гиалуроновой кислоты, полилаклида, хондроитинсульфата и др. 4. 3 18533 1 2014.08.30 Известен способ получения клеточной биополимерной композиции на основе коллагенового или фибринового геля для трансплантации клеток (мезенхимальные, стволовые,кардиомиоциты, хондроциты и др.) 5, 6. Недостатками способа являются использование биологического материала для приготовления биополимера и сложность приготовления клеточной композиции. Задачей изобретения является разработка клеточной биополимерной композиции для переноса и трансплантации, полимерный компонент которой будет безопасным, биосовместимым с клетками и легко деградируемым в организме человека. Результат достигается в способе получения биополимерной композиции для восстановления кожного покрова человека. Монослой эпидермальных кератиноцитов, полученный культуральным способом, предлагаемым в данном изобретении, обрабатывают 0,5 ным раствором диспазы с получением суспензии эпидермальных кератиноцитов, доводят концентрацию кератиноцитов в суспензии до 500000 в 1 мл, смешивают с высокозамещенным фосфатом декстрана, стерилизованным гамма-облучением, в соотношении 60 мл суспензии с концентрацией 500000 кератиноцитов в 1 мл и 6 мг высокозамещенного фосфата декстрана и термостатируют 18-20 ч при 37 С, периодически встряхивая. В последние десятилетия декстран считается одним из наиболее перспективных полимеров для получения гидрогелей, используемых в качестве носителей биологически активных веществ и лекарств 7. Но для культивирования клеток он не использовался. Изобретение иллюстрируется примером. 3. Манипуляции, описанные в примере 2, те же. После достижения плотного монослоя клетки переводили в суспензию, обработкой монослоя 0,5 -ным р-ром диспазы. Определяют число жизнеспособных клеток, которое составляет 895. Доводят концентрацию клеток до 500 тыс/мл питательной средой с антибиотиками без сыворотки с добавлением 10 нг/мл эпидермального ростового фактора. Соединяют 60 мл клеточной суспензии с 6 мг сухого высокозамещенного фосфата декстрана (проба заранее стерилизована гаммаоблучением), ставят в термостат при 37 С, периодически встряхивая, на 18-20 ч. Микроскопируют с использованием инвертированного микроскопа. Наблюдают распределение живых округлых клеток, расположенных внутри пор. Жизнеспособность клеток составляет 873 . При наблюдении в течение 1-й недели за клетками в геле цитотоксичности не наблюдается. Авторам из научно-технической, в том числе патентной, литературы не известна совокупность признаков заявляемого технического решения, что, по мнению авторов, свидетельствует о соответствии заявляемого способа критерию новизна. Отличительные признаки заявляемого технического решения обеспечивают достижение нового технического результата - повышение эффективности способа восстановления кожного покрова за счет снижения риска поврежения стволовых и прогениторных клеток базального слоя мембраны при их выделении и повышения биобезопасности накопленной в культуре биомассы функционально-активных эпидермальных кератиноцитов и за счет индукции аденилатциклазной системы и обеспечения высокого уровня метаболического и энергетического статуса клеток при использовании вместо потенциально опасного биологического препарата, применение препарата растительного происхождения. Результат также обеспечивается разработкой технологии получения биополимерных клеточных композиций со свойствами полимера биосовместимость, биодеградация, доступность (отечественная разработка), что существенно снизит стоимость клеточного биопрепарата, а в последующем и затраты на лечение. Все вышеизложенное соответствует критерию изобретательский уровень. Источники информации 1.. ., 1996. - Р. 9-15. 4 18533 1 2014.08.30 2. Методы культивирования клеток / Под ред. Г.П. Пинаевой, М.С. Богдановой. СПб. Изд-во Политехнического ун-та, 2008. - С. 176-180. 3. Патент РФ 2342164, МПК 61 27/60, 2008. 4. Воусе ,,., ,// . - . 110. - 1991. - . 866-876. 5.,,,,.,. (2000)-. . . . . - . 51. - . 233240. 6.,. (2002). . . . - . 20. - . 16-19. 7. Патент РБ 11838, МПК 61 31/4162,61 31/715, 2002. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5