Способ оценки способности образования биопленки микроорганизмами

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ СПОСОБНОСТИ ОБРАЗОВАНИЯ БИОПЛЕНКИ МИКРООРГАНИЗМАМИ(71) Заявитель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(72) Авторы Кабанова Арина Александровна Окулич Виталий Константинович Плотников Филипп Викторович(73) Патентообладатель Учреждение образования Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет(56). . . . - 1985. - . 22. - . 6. - . 996-1006. ГОРБУНОВ В.А. Сравнительная активность некоторых дезинфектантов в отношении клинических штаммов Р. , выделенных в стационарах Республики Беларусь, 2010... . . . . - 2007. - . 22. - . 186-194. КАРПОВА Т.И. и др. Микробиология. 2008. -1. - С. 3-7. КРЮКОВ А.И. и др. Вестник оториноларингологии. - 2010. -3. - С. 4-6. РОМАНОВА Ю.М. и др. Микробиология. - 2006. -4. - С. 38-42. ПРОНИНА Е.А. и др. Фундаментальные исследования. - 2010. -10. - С. 40-45.2385942 2, 2010.2393459 1, 2010.2396543 1, 2010.5349874 , 1994.(57) Способ оценки способности образования биопленки микроорганизмами, при котором готовят взвесь микроорганизмов в бульоне Мюллера-Хинтона, оптическая плотность которой составляет 0,5 ед., полученную взвесь переносят в лунки полистиролового планшета,инкубируют в течение 24 ч, полученную биопленку окрашивают раствором кристаллического фиолетового, в лунки с окрашенной биопленкой вносят 33 -ный раствор уксусной кислоты и инкубируют при комнатной температуре до полной экстракции красителя в раствор кислоты, определяют оптическую плотность полученного раствора методом спектрофотометрии при длине волны 620 нм и при значении оптической плотности до 0,12 ед. констатируют неспособность микроорганизмов к образованию биопленки, при значении оптической плотности в интервале 0,12-0,24 ед. - среднюю способность к образованию биопленки, а при значении более 0,24 ед. - сильную способность к образованию биопленки. Изобретение относится к медицине, а именно к клинической микробиологии. Известен способ оценки способности образования биопленки микроорганизмами с помощью определения способности бактерий к адгезии на поверхности 96-луночного полистиролового планшета, при котором интенсивность пленкообразования определяется спектрофотометрическим методом 1. 17673 1 2013.10.30 Недостатками способа являются 1) длительность и трудоемкость получения биопленки 2) возможность получения ошибочных результатов вследствие нестандартного процесса удаления свободных клеток бактерий и промывания планшета 3) отсутствие критериев оценки пленкообразования микроорганизмами. Известен способ оценки способности образования биопленки микроорганизмами на покровных стеклах, помещенных в питательную среду, при котором формирование биопленки оценивают микроскопическим методом 2. Недостатками способа являются 1) трудоемкость процесса получения и окрашивания биопленки 2) большие затраты реактивов 3) невозможность массового использования данного способа при изучении формирования биопленки различными микроорганизмами 4) отсутствие количественного выражения способности бактерий формировать биопленки. Наиболее близким к предлагаемому является способ оценки способности образования биопленки микроорганизмами, заключающийся в том, что 24-часовую колонию помещают в триптоно-соевый бульон и инкубируют при 37 С на водяной бане с функцией встряхивания при 100 циклах в минуту в течение 18 ч. Полученную ночную культуру разводят в 100 раз и разливают по 200 мкл в каждую лунку планшета, по 8 лунок на изолят, первый ряд заполняется бульоном. Планшет инкубируют 24 ч при 37 С. Через 24 ч планшет извлекают, бульон в асептических условиях удаляют стерильными наконечниками. Лунки 4 раза промывают стерильным фосфатным буфером с целью удалить все планктонные формы бактерий из культуры. Биопленку фиксируют 200 мкл 2,5 -ным раствором глютаральдегида 5 мин, затем дважды промывают. Далее биопленку окрашивают 200 мкл 0,25 -ным кристаллическим фиолетовым 5 мин и лунки 8 раз промывают. Планшет осушают путем переворачивания лунок и сушки воздухом. Далее краситель растворяют из пленок при помощи 200 мкл смеси ацетон/этанол (11). Оптическую плотность определяют при длине волны 570 нм 3. Недостатками способа являются 1) длительность подготовительного этапа с момента получения культуры микроорганизмов до внесения их в лунки планшета 2) необходимость использования водяной бани с функцией встряхивания проб 3) отсутствие четких критериев оценки способности микроорганизмов к образованию биопленки. Задачей предлагаемого изобретения является разработка более простого и наименее затратного способа оценки способности образования биопленки микроорганизмами, не требующего длительных временных затрат, обладающего четкими критериями оценки. Поставленная задача достигается за счет того, что готовят взвесь микроорганизмов в бульоне Мюллера-Хинтона, оптическая плотность которой составляет 0,5 ед., полученную взвесь переносят в лунки полистиролового планшета, инкубируют в течение 24 ч, полученную биопленку окрашивают раствором кристаллического фиолетового, в лунки с окрашенной биопленкой вносят 33 -ный раствор уксусной кислотой и инкубируют при комнатной температуре до полной экстракции красителя в раствор кислоты, определяют оптическую плотность полученного раствора методом спектрофотометрии при длине волны 620 нм и при значении оптической плотности до 0,12 ед. констатируют неспособность микроорганизма к образованию биопленки, при значениях оптической плотности в интервале 0,12-0,24 ед. - среднюю способность, а при значении более 0,24 ед. - сильную способность к образованию биопленки. Способ осуществляется следующим образом. Штамм бактерий выращивают на агаре при 37 С в течение 24 ч. В асептических условиях с помощью бактериологической петли готовят взвесь микроорганизмов в бульоне 2 17673 1 2013.10.30 Мюллера-Хинтона с оптической плотностью на денсометре 0,5 ед. оптической плотности,что соответствует концентрации 1,5108 КОЕ/мл. В лунки планшета вносят по 150 мкл полученной взвеси бактерий, на один штамм отводят 8 лунок. Отрицательным контролем служат лунки с 150 мкл бульона Мюллера-Хинтона. Планшет инкубируют в термостате при температуре 37 С в течение 24 ч. Из лунок с помощью стерильной пипетки удаляют содержимое. Лунки промывают четырехкратно дистиллированной водой с помощью автоматической мойки МВ-350 производства Технофорум или аналогичной ей. Биопленку фиксируют путем добавления в лунки по 160 мкл 2,5 -ного раствора глютаральдегида и его инкубации в течение 5 мин. Планшет четырехкратно промывают и вносят по 170 мкл 0,25 -ного раствора кристаллического фиолетового на 5 мин, после чего снова повторяют процедуру мойки четыре раза и высушивают в течение 10 мин. В лунки добавляют по 200 мкл 33 -ного раствора уксусной кислоты и инкубируют при комнатной температуре 10 мин до полной экстракции красителя в кислоту. Планшет помещают в многоканальный спектрофотометр Ф 300, где при длине волны 620 нм определяют оптическую плотность в лунках. По полученным данным определяют среднее значение восьми лунок и оценивают способность образования микроорганизмом биопленки. При значении оптической плотности до 0,12 ед. констатируют неспособность микроорганизма к образованию биопленки,при значениях оптической плотности в интервале 0,12-0,24 ед. - среднюю способность, а при значении более 0,24 ед. - сильную способность к образованию биопленки. Приведенные значения определены статистически с помощью частотного анализа. Пример 1. Пациент К. поступил в отделение челюстно-лицевой хирургии с диагнозом острый одонтогенный остеомиелит, осложненный подчелюстной флегмоной слева. Во время операции вскрытия и дренирования гнойного очага был произведен забор раневого отделяемого для микробиологического исследования. На следующий день возбудитель идентифицирован -- и перенесен на питательную среду. На второй день после операции с помощью предложенного способа выявлено, что выделенный штамм образует биопленку с оптической плотностью конечного раствора 0,78 ед. опт. плотности, что указывает на высокую способность данного микроорганизма к образованию биопленки, следовательно, необходимо предполагать изменения свойств возбудителя данной патологии и учитывать это при проведении лечебных мероприятий. Пример 2. Пациентка М. поступила в отделение челюстно-лицевой хирургии с диагнозом абсцедирующий фурункул левой щеки. Во время операции вскрытия и дренирования гнойного очага был произведен забор раневого отделяемого для микробиологического исследования. На следующий день возбудитель идентифицирован -- и перенесен на питательную среду. На второй день после операции с помощью предложенного способа выявлено, что выделенный штамм образует биопленку с оптической плотностью конечного раствора 0,089 ед. опт. плотности, что указывает на неспособность данного микроорганизма к образованию биопленки. Преимущества предложенного способа 1) используемые реактивы и оборудование доступны для всех микробиологических лабораторий 2) результат измерения известен уже через 48 ч после забора материала 3) позволяет классифицировать микроорганизмы по способности к образованию биопленок. Источники информации 1..,,.//. - 2000. - . 54. - . 49-79. 3 17673 1 2013.10.30 2. Тец Г.В. Роль внеклеточной ДНК и липидов матрикса во взаимодействии бактерий биопленок с антибиотиками Автореф. дис. канд. мед. наук. - Санкт-Петербург, 2007. 3.-//. - 1985. - . 22. - . 996-1006. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4