Рекомбинантные IL4 антитела, применяемые для лечения заболеваний, опосредованных IL4

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ РЕКОМБИНАНТНЫЕ 4 АНТИТЕЛА, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ОПОСРЕДОВАННЫХ 4(71) Заявители СМИТКЛАЙН БИЧЕМ КОРПОРЕЙШН , СМИТКЛАЙН БИЧЕМ п.л.с.(73) Патентообладатели СМИТКЛАЙН БИЧЕМ КОРПОРЕЙШН , СМИТКЛАЙН БИЧЕМ п.л.с.(57) 1. Белок слияния, обладающий специфичностью связывания в отношении человеческого интерлейкина-4(4), содержащий области, определяющие комплементарность , происходящие из нейтрализующего моноклонального антитела 3 В 9, характеризуемого константой диссоциации равной или меньшей 2 х 10-10 М относительно человеческого 4,где аминокислотные последовательноститяжелой цепи указанного белка слияния представляют собой(с)26 аминокислотные последовательностилегкой цепи представляют собой 28,и аминокислотные последовательности первого партнера слияния представляют собой последовательность тяжелой цепи аминокислоты 21-50, 56-71, 88-119 и 131-141 последовательности 12 или последовательность легкой цепи аминокислоты 20-42, 58-72, 80-111 и 121-131 последовательности 14. 2. Белок по п.1, отличающийся тем, что последовательность указанного первого партнера слияния представляет собой последовательность тяжелой цепи аминокислоты 21-50, 56-71, 88-119 и 131-141 последовательности 12. 3. Белок по п.1, отличающийся тем, что последовательность указанного первого партнера слияния представляет собой последовательность легкой цепи аминокислоты 20-42, 58-72, 80-111 и 121-131 последовательности 14. 4. Фармацевтическая композиция для лечения аллергии и других болезненных состояний, связанных с избыточной продукциейв организме человека, содержащая терапевтически эффективное количество 4496 1 инженерного антитела и фармацевтически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что инженерное антитело представляет собой белок слияния по п.1. 5. Способ лечения аллергии и других болезненных состояний, связанных с избыточной продукциейв организме человека, заключающийся во введении нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически эффективного количества белка слияния по п.1. 6. Изолированная нуклеиново-кислотная последовательность молекулы ДНК природного или синтетического происхождения, выбранная из группы, включающей) нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую белок слияния по п.1) фрагмент или аналог ,или , который кодирует белок, характеризующийся специфичностью в отношении человеческого 4 причем указанная последовательность необязательно содержит сайт рестрикции. 7. Последовательность по п.6, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая белок слияния,содержит нуклеиново-кислотную последовательность 13. 8. Последовательность по п.6, отличающаяся тем, что последовательность, кодирующая белок слияния,содержит нуклеиново-кислотную последовательность 11. 9. Последовательность по п.8, отличающаяся тем, что ее выбирают из группы последовательностей, кодирующих области, определяющие комплементарность легкой цепи, при этом указанная группа включает)27. 10. Изолированная нуклеиново-кислотная последовательность молекулы ДНК природного или синтетического происхождения, выбранная из группы, включающей, которую получают из нейтрализующего моноклонального антитела 3 В 9, специфичного в отношении человеческого 4 и имеющего константу диссоциации равную или меньшую 2 х 10-10 М) фрагмент или аналог ,или , который кодирует белок, характеризующийся специфичностью в отношении человеческого 4. 11. Последовательность по п.10, отличающаяся тем, что ее выбирают из группы последовательностей,кодирующих области, определяющие комплементарность тяжелой цепи, при этом указанная группа включает)56. 12. Рекомбинантная плазмида природного или синтетического происхождения с высоким уровнем конъюгативности, имеющая физическую карту согласно рис.9 и содержащая тяжелую цепь нуклеиновой кислоты по п.6. 13. Рекомбинантная плазмида природного или синтетического происхождения с высоким уровнем конъюгативности, имеющая физическую карту согласно рис.10 и содержащая легкую цепь нуклеиновой кислоты по п.6. 14. Рекомбинантная плазмида природного или синтетического происхождения с высоким уровнем конъюгативности, имеющая физическую карту согласно рис.9 и содержащая тяжелую цепь нуклеиновой кислоты по п.10. 4496 1 15. Рекомбинантная плазмида природного или синтетического происхождения с высоким уровнем конъюгативности, имеющая физическую карту согласно рис.10 и содержащая легкую цепь нуклеиновой кислоты по п.10. 16. Линия клеток . для экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.6. 17. Линия клетокдля экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.6. 18. Линия клетокдля экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.6. 19. Линия клеток . для экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.10. 20. Линия клетокдля экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.10. 21. Линия клетокдля экспрессии белков слияния, содержащая нуклеиново-кислотную последовательность по п.10. 22. Нейтрализующее моноклональное антитело, обладающее высоким титром в отношении человеческого 4, егофрагмент или 2 фрагмент, отличающееся тем, что оно получено путем скрининга библиотеки гибридомных продуктов с помощью альдегид-связанного человеческого 4 или биотинизированного человеческого 4. 23. Гибридома клеточной линии для получения антител, клеточная линия которой имеет идентифицирующие характеристики клеточной линии 3426 А 11 С 1 В 9, депонированной в Европейской коллекции культур животных клеток под номером 93100620. Настоящее изобретение относится к области слитых белков, а также к белкам, используемым для лечения и диагностики болезненных состояний, связанных с действием 4 и избытком продуцирования , более конкретно, настоящее изобретение относится к химерным и гуманизированным 4 антителам. Настоящая заявка является частично продолженной заявкой относительно заявки США с серийным номером 08/136,783 от 14 октября 1993 г., которая является продолжением заявки США с серийным номером 08/117,366 от 7 сентября 1993 г., причем на обе эти заявки ссылаются в настоящем изобретении. Область атопических аллергических заболеваний охватывает как относительно незначительные болезни,например такие как сезонные риниты и коньюктивиты, так и более серьезные заболевания, такие как атопический дерматит и атопическая астма, а также такие болезни, угрожающие жизни, как анафилактический шок. Общим фактором таких болезненных состояний является иммунный ответ организма на аллергены,причем такая реакция заключается в продуцировании иммуноглобулиновыхантител у генетически предрасположенных пациентов (атопия). Ингибирование продукциив течение длительного времени составляло цель специфической иммунотерапии аллергических заболеваний с использованием десенсибилизирующих вакцин. Однако в последние годы безопасность и эффективность вакционной терапии стала вызывать сомнения, однако потребность понижения уровняне отпала. Интерлейкин 4 (4) представляет собой протеиновый медиатор в лимфоидной системе. Исследования лимфоцитов, взятых у атопических пациентов, позволило обнаружить повышенное количество Тлимфоцитов, обладающих способностью секретировать 4 в ответ на стимуляцию и повышенные количества 4, секретированного после стимуляции. Было обнаружено, что анти- 4 антитело ингибирует , но не ингибирует 1 или 2 а ( с сотр., . . . 8303(1990, а также продукцию 5 секретирующих -клеток ( с сотр., .1482142 (1992. Кроме этого, последние данные подтвердили, что 4 может оказывать влияние на аккумуляцию зозинофила в тканях. См., например, Терре с сотр., , 62457(1990) Терре с сотр., ,57503 (1989). Задачей настоящего изобретения является создание высокоаффинного 4 антагониста, способного снижать уровень зозинофильного воспаления в результате уменьшения пролиферации 5 секретирующих клеток и ингибирования механизма адгезии, в результате чего зозинофилы могли бы аккумулироваться в тканях и использоваться для лечения, профилактики и диагностики аллергических реакций. Предметом изобретения является белок слияния, обладающий специфичностью связывания в отношении человеческого интерлейкина-4 (4), содержащий области, определяющие комплементарность , про 3 4496 1 исходящие из нейтрализующего моноклонального антитела 3 В 9, характеризуемого константой диссоциации равной или меньшей 210-10 относительно человеческого 4, где аминокислотные последовательноститяжелой цепи указанного белка слияния представляют собой 26 аминокислотные последовательностилегкой цепи представляют собой 28,и аминокислотные последовательности первого партнера слияния представляют собой последовательность тяжелой цепи аминокислоты 21 - 50, 56 - 71, 88 - 119 и 131141 последовательности 12 или последовательность легкой цепи аминокислоты 20 - 42, 58 -72, 80 -111 и 121 - 131 последовательности 14. Предпочтительно что последовательность указанного первого партнера слияния представляет собой последовательность тяжелой цепи аминокислоты 21 - 50, 56 - 71, 88 - 119 и 131 - 141 последовательности 12. А также предпочтительно что последовательность указанного первого партнера слияния представляет собой последовательность легкой цепи аминокислоты 20 - 42, 58 -72, 80 - 111 и 121 - 131 последовательности 14. Еще один аспект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции для лечения аллергии и других болезненных состояний, связанных с избыточной продукциейв организме человека, которая содержит терапевтически эффективное количество инженерного антитела и фармацевтически приемлемый носитель, при этом инженерное антитело представляет собой заявляемый белок слияния. Следующий аспект настоящего изобретения предусматривает способ лечения аллергии и других болезненных состояний, связанных с избыточной продукциейв организме человека, заключающийся во введении нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически эффективного количества белка слияния по изобретению. Кроме того, предметом изобретения является изолированная нуклеиново-кислотная последовательность молекулы ДНК природного или синтетического происхождения, выбранная из группы, включающей) фрагмент или аналог (а),или (с), который кодирует белок, характеризующийся специфичностью в отношении человеческого 4 причем указанная последовательность необязательно содержит сайт рестрикции. В одном варианте заявляется последовательность, кодирующая белок слияния, содержащая нуклеиновокислотную последовательность 13. В другом варианте - последовательность, кодирующая белок слияния, содержит нуклеиново-кислотную последовательность 11. В следующем варианте последовательность выбирают из группы последовательностей, кодирующих области, определяющие комплементарность легкой цепи, при этом указанная группа включает Еще один аспект настоящего изобретения предусматривает изолированную нуклеиново-кислотную последовательность молекулы ДНК природного или синтетического происхождения, выбранную из группы,включающей а) нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую область, определяющую комплементарность, которую получают из нейтрализующего моноклонального антитела 3 В 9, специфичного в отношении человеческого 4 и имеющего константу диссоциации равную или меньшую 210-104) фрагмент или аналог (а),или (с), который кодирует белок, характеризующийся специфичностью в отношении человеческого 4. Причем ее выбирают из группы последовательностей, кодирующих области, определяющие комплементарность тяжелой цепи, при этом указанная группа включает Настоящее изобретение предусматривает также рекомбинантные плазмиды природного или синтетического происхождения с высоким уровнем коньюгативности, имеющие физическую карту согласно фиг. 9 и содержащие тяжелые цепи нуклеиновой кислоты, описанные выше, рекомбинантные плазмиды природного или синтетического происхождения с высоким уровнем коньюгативности, имеющие физическую карту согласно фиг. 10 и содержащие легкие цепи нуклеиновой кислоты, описанные выше. Далее предметом изобретения являются следующие линии клеток линии клеток . для экспрессии белков слияния, содержащие нуклеиново-кислотные последовательности, описанные выше,линии клетокдля экспрессии белков слияния, содержащие нуклеиново-кислотные последовательности, описанные выше,линии клетокдля экспрессии белков слияния, содержащие нуклеиново-кислотные последовательности. описанные выше. Настоящее изобретение предусматривает также нейтрализующее моноклональное антитело, обладающее высоким титром в отношении человеческого 4, егофрагмент или 2 фрагмент, полученное путем скрининга библиотеки гибридомных продуктов с помощью альдегид-связанного человеческого 4 или биотинизированного человеческого 4. Последний аспект изобретения предусматривает гибридому клеточной линии для получения антител,клеточная линия которой имеет идентифицирующие характеристики клеточной линии 3426 А 11 С 1 В 9, депонированной в Европейской коллекции культур животных клеток под номером 93100620. Изобретение иллюстрируется следующими фигурами. На фиг. 1 (последовательности 1, 2) проиллюстрирован вариабельный участок легкой цепи(аминокислоты 21-132) мышиного 114 антитела 3 В 9, человек/мышь 3 В 9 химерное антитело, а также нативная сигнальная последовательность (аминокислоты 1-20). Подчеркнутые участки обозначают(последовательности 15, 1617 и 18 и 19 и 20). На фиг. 2 (3 и 4) проиллюстрированы вариабельный участок тяжелой цепи аминокислоты 20140) мышиного 3 В 9, а также нативная сигнальная последовательность (аминокислоты 1-19). Подчеркнутые участки обозначают(21, 2223 и 24 и 25, 26). На фиг. 3 (9, 10) проиллюстрирован вариабельный участок тяжелой цепи (аминокислоты 21141) человек/мышь 3 В 9 химерного антитела и его сигнальная последовательность (аминокислоты 1-195 и 6). Подчеркнутые части обозначают , являющиеся производными 3 В 9 (21, 2223, 24 и 25, 26). На фиг. 4 проиллюстрированы (11, 12) вариабельный участок тяжелой цепи (аминокислоты 20-141) гуманизированного 3 В 9 антитела с сигнальной последовательностью (аминокислоты 1-195, 6). Подчеркнутые участки обозначают , являющиеся производными 3 В 9 (54, 2255, 24 и 56 и 26). На фиг. 5 (13, 14) проиллюстрирован вариабельный участок легкой цепи (аминокислоты 21131) гуманизированного 3 В 9 антитела и сигнальная последовательность (аминокислоты 1-207,8). Подчеркнутые участки обозначают , являющиеся производными 3 В 9 (53, 1617, 18 и 27, 28). 5 4496 1 На фиг. 6 А (5, 6) показана сигнальная последовательность тяжелой цепи, используемая в приведенном ниже примере 4. На фиг. 6 В (7, 8) показана сигнальная последовательность легкой цепи, используемая в представленном ниже примере 4. На фиг. 7 дано схематическое изображение плазмиды 43-, используемой для экспрессии химерной 4 тяжелой цепи в клетках млекопитающих. Такая плазмида содержит бета-лактамазный ген (), точку начала репликации -40 (40), цитомегаловирусную промоторную последовательность, сигнальную последовательность, химерную вариабельную тяжелую цепь от 9, 10, константный участок человеческой тяжелой цепи, поли А сигнал бычьего гормона роста , бетаглобиновый промотор ( ), дигидрофолатредуктазный гени другаяпоследовательность поли А сигнала в среде 19. На фиг. 8 представлена схема плазмиды 4-, используемой для экспрессирования химерного 4 легко-цепного вариабельного участка 1 и 2 в клетках млекопитающего. Эта плазмида отличается от изображенной на фиг. 7 тем, что она содержит химерный легко-цепной вариабельный участок, отличный от химерной тяжелой цепи, постоянный участок человеческой легкой цепи и неомициновый ген помимо . На фиг. 9 представлена схема плазмиды 4, используемой для экспрессии синтетического 4 вариабельного участка тяжелой цепи 11 и 12 в клетках млекопитающего. Такая плазмида отличается от изображенной на фиг. 7 тем, что содержит вариабельный участок гуманизированной тяжелой цепи,отличный от того, который присутствует в химерной тяжелой цепи. На фиг. 10 представлена схема плазмиды 4, используемой для экспрессии вариабельного участка гуманизированной 4 легкой цепи 13 и 14 в клетках млекопитающего. Такая плазмида отличается от той, что изображена на фиг. 8 тем, что содержит вариабельный участок гуманизированной легкой цепи, отличающейся от той, что присутствует в химерной легкой цепи и не кодируетген. Настоящее изобретение обеспечивает ряд антител, их фрагментов и слитых белков, главным образом, гуманизированных антител, которые характеризуются связующей специфичностью в отношении человеческого 4, нейтрализующей активностью и высоким сродством к человеческому 4, как это показано в примерах, относящихся к мышинымили крысиным 61. Такие продукты находят применение в терапевтических и фармацевтических композициях для лечения реакций, вызванных действием 4 и . Такие продукты также используются для диагностики вызванного действием 4 болезненного состояния в результате измерений (например, методом твердофазного иммуноферментного анализациркуляционного эндогенного уровня 4 у людей. Принятые определения. Термин слитый белок относится к белку, закодированному слитой молекулой, который может быть получен экспрессией в выбранной клетке-хозяине. Такие слитые белки представляют собой генно-инженерные антитела, например, химерные или гуманизированные антитела, или фрагменты антитела, в которых полностью или частично отсутствует константный участок иммуноглобулина, например, ,или 2 и т.д. Термин слитые молекулы относится к нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей участки, определяющие комплементарность , не-человеческого иммуноглобулина, которые вставлены в первый партнер слияния, включающий человеческие вариабельные каркасные последовательности. Иногда первый партнер слияния оперативно связан со вторым партнером слияния. Термин первый партнер слияния относится к нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей человеческий каркас или вариабельный участок человеческого иммуноглобулина, где нативные (или встречающиеся в природе) С замещены С донорского антитела. Человеческая вариабельная область может представлять собой иммуноглобулиновую тяжелую цепь, легкую цепь (или обе такие цепи), а также аналог их функциональных фрагментов. Такие С (или С области), находящиеся внутри вариабельных участков антител (иммуноглобулинов), могут детерминироваться (определяться известными способами). Так например,сотр. (, 4-е изд. Департамент здравоохранения США, Национальный Институт здоровья (1987, описывает правила расположения С. Кроме этого известны компьютерные программы идентификации участков или структур С. Термин высокий титр относится к антителу с высокой аффиностью связывания, характеризующемуся К равной или меньшей 210-10 для человеческого 4. Под термином специфичность связывания относительно человеческого 4 подразумевается высокий титр (или сродство) в отношении человеческого, но не в отношении бычьего или мышиного 4. Термин второй партнер слияния относится к другим нуклеотидным последовательностям, кодирующим протеин или пептид, с которыми коньюгирован первый партнер слияния в рамке или с использованием необязательной традиционной линкерной последовательности (например, путем оперативного связывания). Предпочтительно это вещество представляет собой иммуноглобулин. Второй партнер слияния может включать нуклеиново-кислотную последовательность, кодирующую полный константный район того же самого(например, вариант гомологии, когда первый и второй белки слияния имеют одинаковое происхождение или 6 4496 1 дополнительного (например, гетерологичного) нужного антитела. Это вещество может представлять собой иммуноглобулиновую тяжелую или легкую цепи (либо обе такие цепи, как часть единого полипептида). Второй партнер слияния не ограничивается конкретным классом иммуноглобулина или изотипом. Кроме этого,второй партнер слияния может включать часть иммуноглобулинового константного участка, такого какили 2 (например, дискретную часть соответствующего человеческого константного участка или участка каркаса). Такой второй партнер слияния может также включать последовательность, кодирующую интегрально-мембранный протеин, экспонированный на внешней поверхности клетки-хозяина, например, как часть фаговой библиотеки, или последовательность, кодирующую белок в целях диагностики, например, пероксидазу хрена,- галактозидазу и т.п. Термины , , а или (а)2 используются в стандартных значениях (см., например,с сотр.,, лаборатория Колд Спринг Харбор (1988). Используемый в тексте термин инженерное антитело относится к типу слитого белка, т.е. синтетического антитела (например химерного или гуманизированного антитела), в которых часть вариабельных доменов легкой и/или тяжелой цепей выбранного акцепторного антитела замещена на аналогичные части одного или более донорских антител, обладающих специфичностью в отношении выбранного эпитопа. Так например, указанные молекулы могут включать антитела, характеризующиеся наличием гуманизированной тяжелой цепи, связанной с немодифицированной легкой цепью (либо химерной легкой цепью) или наоборот. Инженерные антитела могут также характеризоваться изменением нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих вариабельные доменные каркасные участки легкой и/или тяжелой цепей акцепторного антитела с тем, чтобы сохранить специфичность к связыванию донорского антитела. Такие антитела могут включать замену одного или более С (предпочтительно всех) от акцепторного антитела на С до донорского антитела, описанного в настоящем документе. Термин химерное антитело, используемый в данном тексте, относится к типу инженерных антител, которые содержат природные вариабельный район (легкая цепь и тяжелые цепи), произведенный из донорского антитела, ассоциированного с константными районами легкой и тяжелой цепей, произведенных из акцепторного антитела. Термин гуманизированное антитело относится к антителу инженерного типа с его С от нечеловеческого донорского иммуноглобулина, причем другие оставшиеся иммуноглобулиновые части молекулы являются производными одного (или более) человеческого иммуноглобулина. Следует отметить, что каркасные опорные остатки могут подвергаться изменению с тем, чтобы сохранить связующую аффинность(см., например,с сотр., . . .86, 10029-10032 (1989),с сотр.,/, 9421 (1991). Используемый в тексте термин донорское антитело относится к антителу (поликлональному, моноклональному или рекомбинантному), которое способствует передаче нуклеиново-кислотным последовательностям его вариабельных участков, С или других его функциональных фрагментов или аналогов к первому партнеру слияния, в результате чего образуется слитая молекула и экспрессированный слитый протеин с антигенной специфичностью и нейтрализующей способностью, характерными для донорского антитела. Примером донорского антитела, подходящего для использования в настоящем изобретении, может служить нечеловеческое нейтрализующее моноклональное антитело (например мышиное), обозначаемое, как 3 В 9. Антитело 3 В 9 определяется, как обладающее высоким титром, человеческий-4 специфичное (т.е. не распознающее бычий или мышиный 4), нейтрализующее антитело изотипа 1, имеющее ДНК вариабельной легкой цепи и аминокислотные последовательности 1 Д 1 и 2, а также ДНК вариабельной тяжелой цепи и аминокислотные последовательности 1 Д 3 и 4 в константной области подходящего мышиного . Термин акцепторное антитело относится к антителу (поликлональному, моноклональному или рекомбинантному) гетерологичному донорскому антителу, которое способствует передаче всех (или любой их части, но предпочтительно всех) нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих каркасные районы его тяжелой и/или легкой цепи и/или константные районы его тяжелой и/или легкой цепи второму партнеру слияния. Предпочтительно, человеческое антитело представляет собой акцепторное антитело. Термин С относится к определяющему комплементарность участку аминокислотных последовательностей антитела, которые представляют собой гипервариабельный участок иммуноглобулиновых легких и тяжелых цепей. См., например,с сотр. Последовательности протеинов, имеющих иммунологическое значение, 4-е изд., Департамент здравоохранения США, Национальный институт здоровья (1987). Имеется по три С (или С районов) в тяжелой и легкой цепях в вариабельной части иммуноглобулина. В связи с этим используемый в тексте термин С относится ко всем тремтяжелой цепи или всем тремлегкой цепи (либо ко всемкак легкой, так и тяжелой цепей).обеспечивают множество константных остатков для связывания антитела с антигеном или эпитопом.настоящего изобретения являются производными последовательностей вариабельных тяжелой и легкой цепей донорского антитела и содержат аналоги встречающихся в природе , причем такие анало 7 4496 1 ги обладают частью или сохраняют ту же антиген-связующую специфичность и/или нейтрализующую способность, что и донорское антитело, из которого они произошли. Под термином распределение антиген-связующей специфичности или нейтрализующей способности предполагается, например, что хотя МА 3 В 9 может характеризоваться некоторым уровнем антигенного сродства, а , закодированный нуклеиново-кислотной последовательностью 3 В 9 в подходящем структурном окружении может обладать более низким или более высоким сродством, предполагается, что 3 В 9 в таких условиях все-таки будут распознавать тот же эритоп, что и 3 В 9. Примерами тяжелоцепных 3 В 9 могут служить последовательности 1 Д 22 последовательность 1 Д 24 последовательность 1 Д 26 а примерами легкоцепных 3 В 9 могут служить последовательность 1 Д 16 последовательность 1 Д 18 и последовательность 1 Д 20. Термин функциональный фрагмент относится к неполной вариабельной последовательности тяжелой или легкой цепи (например, небольшие делеции на амино- или карбокси-концах иммуноглобулинового вариабельного участка), сохраняющей ту же антиген-связующую специфичность и/или нейтрализующую способность, что и антитело, из которого был получен данный фрагмент. Термин аналог относится к аминокислотной последовательности, модифицированной, по меньшей мере, одной аминокислотой, причем указанная модификация может быть осуществлена химически, представлять собой замещение или перегруппировку нескольких аминокислот (как правило не более 10) и такая модификация позволяет аминокислотной последовательности сохранять биологические характеристики,например, специфичность к антигену, высокий титр или аффинность, присущие немодифицированной последовательности. Так например, молчащие мутации могут реализоваться путем замещений с целью создания рестрикционных эндонуклеазных сайтов внутри или в пределах окружающих С области. Аналоги могут также возникать в ходе аллельных вариаций. Под термином аллельная вариация или модификация подразумевается изменение нуклеиново-кислотной последовательности, кодирующей аминокислотную или пептидную последовательности изобретения. Такие вариации или модификации могут быть связаны с дегенерацией генетического кода или достигнуты в результате обдуманного конструирования с целью придания желаемых характеристик. Такие вариации или модификации могут в результате приводить или не приводить к изменению в любой кодирующей аминокислотной последовательности. Так например,аминокислотные последовательностилегкой цепи, последовательность 1 Д 16 идентична нативной мышиной последовательности и гуманизированного 3 В 9 антитела. Однако такая С последовательность закодирована как 1 Д 15, так и 1 Д 53. Аналогичным образом,1 Д 22 закодирована как 1 Д 21, так и Е 1 Д 54,1 Д 24 закодирована как 1 Д 23, так и 1 Д 55 и С 1 Д 26 закодирована, как 1 Д 25, так и 1 Д 56. Термин эффекторные агенты относится к не-протеиновым молекулам-носителям, с которыми, обычными методами, могут быть связаны слитые протеины и/или природная или синтетическая, легкая или тяжелая цепь донорского антитела или других фрагментов донорского антитела. Такие не-белковые носители могут включать традиционные носители, используемые в области диагностики, например полистирол или другие пластиковые шарики, полисахариды, например те, что используются в системе 1 // или другие не-белковые вещества, используемые в медицине и безопасные при применении на людях и животных. Другие агенты-эффекторы могут включать макроцикл для хелатирования атома тяжелого металла или радиоизотопы. Такие эффекторы могут также использоваться для повышения времени полураспада слитых протеинов к таким агентам относится полиэтиленгликоль. Высокоаффинные 4 моноклональные антитела Для осуществления конструирования антител, фрагментов и слитых протеинов изобретения могут применяться не-человеческие разновидности (например материалы, полученные от коров, овец, приматов, грызунов (например мышей и крыс) и т.д.) и они используются для генерации желаемого иммуноглобулина путем представления с помощью нативного человеческого 4 или его пептидного эпитопа. Традиционные гибридомные методы используются для обеспечения гибридомной клеточной линии, секретирующей нечеловеческийк 4. Затем такие гибридомы подвергают скринингу с использованием 4, ковалентно связанного с 96-луночными пластинами или с использованием биотинилированного 4, предназначенного для применения в скрининге в соответствии с методикой, подробно описанной в следующем ниже примере 2. Таким образом, одним из отличительных признаков настоящего изобретения является способ детекциина человеческий 4, в котором используемые аналитические средства позволяют избежать денатурацию 4. Согласно такому способу было обнаружено, что могут детектироватьсяс высоким титром(или высоким сродством) к человеческому 4. В качестве одного из примеров вначале будет описано получение нейтрализующегос высоким титром из мышиного донора. МА 3 В 9, представляющие собой желательное мышиное донорское антитело для использования в выработке химерного или гуманизированного антитела подробно описано в следующем ниже примере 1. 3 В 9 МА характеризуется антиген-связующий специфичностью на человеческий 4 с К менее 2,010-10(около 1,810-10 ) в отношении 4.для 114 фрагмента а такого 3 В 9 имеет значение менее 310-10 . Эпитоп такого антитела не может картироваться с помощью 4 линейных пептидов и,8 4496 1 следовательно, такой эпитоп рассматривается, как связывающийся с не-соприкасающимся эпитопом. Картина связывания предполагает наличие связующего сайта в области - петля (остатки 60-69)С-спираль(остатки 70-93). В отношении картированного обозначения таких участков можно сослаться на работыс сотр. . .218675-678 (1991),с сотр., . . . 26720371-20376 (1992),с сотр.,. 30959-64 (1992),с сотр.3011029-11035 (1991),с сотр., . . . 224899-904 (1992),с сотр., (1992) ис сотр.314334-4346 (1992) и 25616731677 (1992). Другим желаемым донорским антителом является крысиный МА, 61. Получение такогоописано ниже в примере 7. Такой МА характеризуется тем, что является изотипом 2 и имеет константу диссоции в отношении 4 менее 2,010-10 М (около 1,610-10 ). Как и в случае 3 В 9, эпитоп-мишень такого 61 не картируется с 4 линейными пептидами и поэтому такой эпитоп рассматривается как не-соприкасающийся и трехмерный. Картина связывания с 4 мутеинами и его биологическая активность указывают на связывание в области Д-спирали человеческого 4 (аминокислотные остатки 109-127), по-видимому в области тирозина на аминокислотном остатке 124. Настоящее изобретение не ограничивается использованием 3 В 9 Ма, 61 или их гипервариабельных (т.е. С) последовательностей. Любые другие подходящие 4 антитела с высоким титром, характеризующиеся константой диссоциации равной или меньшей 2,010-10 в отношении человеческого 4 и соответствующие анти-114 могут служить заменой указанным материалам. В следующем ниже описании донорское антитело идентифицируется, как 3 В 9 или 61, причем такое обозначение дается лишь в целях иллюстрации и упрощения описания. Фрагменты антител Настоящее изобретение также охватывает использованием а фрагментов или Г(а)2 фрагментов, являющихся производными МА, направленных против человеческого 4. Такие фрагменты используются в качестве агентов, защищающихот 4 -- медиаторных состояний илив качестве части 4 диагностического средства. Фрагмент а содержит полную легкую цепь и амино-терминальную часть тяжелой цепи, а фрагмент (а)2 представляет собой фрагмент, образованный двумя фрагментами а, связанными посредством дисульфидной связи.39, 61 и другие аналогичные высокоаффинные, 4 связывающие антитела, представляют собой источники фрагментови (а), которые могут быть получены традиционными методами, например, расщеплением МА с помощью соответствующих протеолитических энзимов, папаина и/или пепсина, или рекомбинантными методами. Такие фрагментыи (а)2 сами по себе используются в качестве терапевтических, профилактических или диагностических агентов, а также в качестве доноров последовательностей, включающих вариабельные участки ипоследовательностей,используемых для образования рекомбинантных или гуманизированных антител, как это описано в настоящем документе. Анти-4 аминокислотная и нуклеотидные последовательности 3 В 9 или другие описанные выше антитела могут обеспечивать последовательности, например, вариабельные пептидные последовательности тяжелой и легкой цепей, рамочные последовательности,последовательности, их функциональные фрагменты и аналоги, а также иодирующие их нуклеиновокислотные последовательности, применяемые для конструирования и получения различных слитых протеинов (включая генно-инженерные антитела), которые характеризуются антиген-связующей специфичностью донорского антитела. Таким образом, в качестве одного из примеров, настоящее изобретение предусматривает последовательности вариабельной легкой цепи и вариабельной тяжелой цепи из 4 мышиного антитела 3 В 9 и последовательности, являющиеся их производными. Вариабельный участок тяжелой цепи 3 В 9 характеризуется аминокислотными остатками 20-1401 Д 4.области указаны путем подчеркивания на фиг. 2 и представлены в Е 1 Д 221 Д 24 и 1 Д 26. Вариабельная область клона легкой цепи характеризуется аминокислотными остатками 21-132 на фиг. 1 / 1 Д 2/.области даны аминокислотными остатками 44-58 / 1 Д 16/ 74-80 / 1 Д 18/ и 113-121 / 1 Д 20/. Также предусмотрены вариабельная область химерной тяжелой цепи и сигнальная нуклеотидная и аминокислотная последовательности. Эти последовательности идентичны тяжелой цепи 3 В 9 за исключением сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность химерной тяжелой цепи показана в 1 Д 5 и 6. Области С подчеркнуты на фиг. 3 и они идентичны по аминокислотной последовательности нативным мышиным/ 1 Д 21-26/. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного района химерной легкой цепи идентичны немодифицированным 3 В 9 последовательностям (аминокислотные остатки 21-1321 Д 2), что делает возможным использование природных мышиных сигнальных последовательностей (аминокислотные остатки 1-201 Д 2). Вариабельная область гуманизированной тяжелой цепи и сигнальные последовательности проиллюстрированы на фиг. 4 / 1 Д 11 и 12/. Сигнальная последовательность также показана в 1 Д 5 и 6. Другие подходящие сигнальные последовательности, известные специалистам в данной области, могут служить заменой сигнальным последовательностям, представленным в примерах.аминокислотные после 9 4496 1 довательности такой конструкции идентичнынативной мышиной и химерной тяжелой цепи и они показаны в 1 Д 22 (закодированной 1 Д 54),1 Д 24 (закодированной 1 Д 55) и 1 Д 56 (закодированной 1 Д 26). Приведенная в качестве примера (синтетическая) вариабельная последовательность гуманизированной легкой цепи проиллюстрирована на фиг. 5 / 1 Д 13 и 14/. Такая сигнальная последовательность включает аминокислотные остатки 1-19 последовательности 1 Д 8.последовательности на этом рисунке обозначены путем подчеркивания и они отличаются отнативной мышинойпо сигнальной аминокислотной последовательности 1 Д 20. Таким образом,гуманизированной легкой цепи представлены 1 Д 53 и 16,1 Д 17 и 18 и 1 Д 27 и 28. Имеющееся отличие подробно описано в примере 3. Нуклеиново-кислотные последовательности настоящего изобретения или их фрагменты кодирующие пептидные последовательности вариабельной легкой цепи и тяжелой цепи используются в немодифицированной форме или могут быть синтезированы с целью введения желаемых модификаций, например, рестрикционных сайтов. Выделенные нуклеиново-кислотные последовательности природного или синтетического происхождения, являющиеся производными 3 В 9 или других желательных 4 антител с высоким титром, могут необязательно содержать рестрикционные сайты, облегчающие инсерцию или легирование в подходящую нуклеиново-кислотную последовательность, например, ту, что кодирует каркасную область желаемого антитела, легирование с мутантнымиили слияние с нуклеиново-кислотной последовательностью, кодирующей выбранный второй партнер слияния. Принимая во внимание вырожденности генетического кода, могут быть сконструированы различные кодирующие последовательности, которые способны кодировать вариабельные аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи, а такжепоследовательности изобретения и их функциональные фрагменты и аналоги, которые делят антигенную специфичность донорского антитела. Выделенные нуклеиново-кислотные последовательности изобретения или их фрагменты, кодирующие пептидные последовательности вариабельной цепи или , могут использоваться для получения слитых протеинов, химерных или гуманизированных антител или других инженерных антител настоящего изобретения при оперативном соединении со вторым партнером слияния. Эти последовательности также используются для мутагенного введения специфических изменений в нуклеиново-кислотные последовательности, кодирующиеили каркасные области, а также для введения полученной в результате модифицированной или слитой нуклеиново-кислотной последовательности в плазмиду для экспрессии. Так например, молчащие замещения в нуклеотидной последовательности каркасной и-кодирующей областей использовали для создания рестрикционных сайтов, которые облегчают вставку мутагенизированных(и/или каркасных) областей. Такиеобласти использовали для конструирования гуманизированного антитела изобретения. Следует отметить, что помимо выделенных нуклеиново-кислотных последовательностей, кодирующих части слитого белка и антител, описанных в настоящем документе, могут использоваться и другие нуклеиново-кислотные последовательности, например, комплементарные нативным последовательностям. Используемые ДНК последовательности включают такие последовательности, которые гибридизуются в строгих условиях /см. .с сотр., Молекулярное клонирование (Лабораторное руководство), лаборатория Колд Спринг Харбор (1982), стр. 387-389/ с ДНК-последовательностями. Одним из примеров такой гибридизации в строгих условиях является гибридизация при 4 Х при 65 С с последующей промывкой в 0,1 Х при 65 С в течение часа. Другим примером гибридизации в строгих условиях может служить обработка в 50 формамиде, 4 Х при 42 С. Предпочтительно, чтобы такие гибридные ДНКпоследовательности содержали, по крайней мере, 18 нуклеотидов, т.е. имели размер, близкий к размеру. Слитые молекулы и слитые протеины Слитые молекулы способны кодировать слитые белки, которые включают такие инженерные антитела,как химерные антитела и гуманизированные антитела. Желательная слитая молекула содержит . последовательности, кодирующие пептиды, обладающие антигенной специфичностью 4 антитела предпочтительно высоко-аффинного антитела, предусматриваемого настоящим изобретением, вставленного в первый партнер слияния (человеческая каркасная область или человеческая иммуноглобулиновая вариабельная область). Предпочтительно, чтобы первый партнер слияния был оперативно связан со вторым партнером слияния. Второй партнер слияния определен выше и он может включать последовательность, кодирующую область второго антитела, напримеробласть. Вторые партнеры слияния могут также включать последовательности, кодирующие другие иммуноглобулины, с которыми, с сохранением рамки считывания, слита константная область легкой или тяжелой цепи или такое слияние осуществляет с помощью линкерной последовательности. Инженерные антитела, направленные против функциональных фрагментов или аналогов 4, могут быть сконструированы таким образом, чтобы обеспечивать усиленное связывание с тем же антителом. 4496 1 Второй партнер слияния может быть также связан с описанным выше агентом-аффектором, включающим не-белковые молекулы-носители, с которыми второй партнер слияния может быть оперативно связан традиционными средствами. Слияние или сцепление между вторыми партнерами слияния, например последовательностями антитела,и агентом-аффектором может осуществляться любыми подходящими методами, например путем создания традиционных ковалентных или ионных связей, слияния протеинов, или с использованием таких гетеробифункциональных сшивателей, как карбодиимид, глутаровый альдегид и т.п. Такие методики известны в данной области и легко доступны из традиционной химической и биохимической литературы. Кроме этого,традиционные линкерные последовательности, которые просто обеспечивают желаемое пространство между вторым партнером слияния и агентом-аффектором также могут быть сконструированы в слитой молекуле. Конструкция таких линкеров хорошо известна специалистам в данной области. Следует отметить, что сигнальные последовательности молекул изобретения могут быть модифицированы с целью усиления экспрессии. В качестве одного из примеров можно отметить слитый белок, имеющий аминокислотную последовательность последовательности мышиной тяжелой цепи, которая идентична химерной вариабельной тяжелой цепи (Н) фиг. 2 / 1 Д 4/, содержит оригинальной сигнальный пептид,замененный другой сигнальной последовательностью (аминокислотные остатки 1-20) / 1 Д 6/. Пример слитого белка содержит пептидную или протеиновую последовательность вариабельной тяжелой и/или легкой цепи, обладающую антигенной специфичностью МА 3 В 9, например, Н /аминокислотные остатки 21-141 последовательности 1 Д 9 и 10/ ицепи /аминокислотные остатки 21-132 последовательностей 1 Д 1 и 2/. Еще один желательный слитый белок изобретения характеризуется аминокислотной последовательностью, содержащей по крайней мере одну, а предпочтительно всевариабельной области тяжелых и/или легких цепей мышиного антитела 3 В 9, причем оставшиеся последовательности имеют человеческое происхождение, либо их аналоги или функциональные фрагменты. См., например, гуманизированныеиобласти 1 Д 11 и 12 и 1 Д 13 и 14 (фиг. 4 и 5). Согласно еще одному воплощению изобретения, инженерное антитело может содержать присоединенный к нему дополнительный агент. Так например, метод рекомбинантной ДНК технологии может быть использован для получения инженерного антитела изобретения, в которомфрагмент СН 3 домена молекулы всего антитела заменен на энзим или другую детектируемую молекулу (например, полипептидный эффектор или молекулу-репортер). Второй партнер слияния может быть также оперативно связан с неиммуноглобулиновым пептидом, протеином или их фрагментом, гетерологичным -содержащей последовательности, имеющей антигенную специфичность мышиного 3 В 9. Полученный в результате белок может в ходе экспрессии проявлять как анти-4 антигенную специфичность, так и характеристики не-иммунноглобулина. Характеристики такого партнера слияния могут включать такие функциональные характеристики, как другой связующий или рецепторный домен, или терапевтические характеристики, если партнер слияния сам по себе является терапевтическим белком, или дополнительные антигенные характеристики. Другой желательный белок настоящего изобретения может содержать молекулу полного антитела,имеющую легкие и тяжелые цепи полной длины, или любой ее дискретный фрагмент, напримерили(а)2, димер тяжелой цепи, или любые их минимальные рекомбинантные фрагменты, например . или одно-цепочечное антителолибо любую другую молекулу с той же специфичностью, что выбранное донорское МА например, МА 3 В 9 или 61. Такой протеин может использоваться в виде слитого белка или может применяться в не-слитой форме. В каждом случае, когда второй партнер слияния происходит из другого антитела, например любого изотипа или класса иммуноглобулиновой каркасной или константной области, возникает генно-инженерное антитело. Инженерные антитела могут содержать иммуноглобулиновые (1) константные области и вариабельные каркасные области из одного источника, например акцепторного антитела, и одну или более(предпочтительно, все)донорского антитела, например описанное в тексте анти-4 антитело. Кроме этого, могут осуществляться изменения, например, делеции, замещения или вставки вариабельного домена каркасной области тяжелой и/или легкой и/или тяжело цепной вариабельной доменной остовной области акцепторной цепи акцепторногона нуклеиново-кислотном или аминокислотном уровнях или участков донорскогос тем, чтобы сохранить антигенную связующую специфичность донорского антитела. Такие инженерные антитела конструируются таким образом, чтобы использовать одну (или обе) вариабельные тяжелые и/или легкие цепи 4 МА (необязательно модифицированные, как это описано) или одну или более ниже-идентифицированные , тяжелой или легкой цепи (см. пример 3). Инженерные антитела настоящего изобретения являются нейтрализующими антителами, т.е. они могут блокировать связывание с рецептором 4 протеина. Так например, антитело, происходящее из МА 3 В 9, направлено против специфического третичного белкового эпитопа человеческого 4, находящегося, как полагают, в области - петляС-спираль, как это было отмечено выше. Такие инженерные антитела могут включать гуманизированное антитело, содержащее каркасные участки выбранного человеческого иммуноглобулина или субтипа, или химерное антитело, содержащее человече 11 4496 1 ские константные области тяжелой или легкой цепи, слитые с функциональными фрагментами 4 антитела. Подходящее человеческое (или другого животного происхождения) ацепторное антитело может быть выбрано из традиционной базы данных, например базы данных , Лос-Аламоской базы данных и Швейцарской белковой базы данных, по гомологии с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями донорского антитела. Человеческое антитело, характеризующееся гомологией с каркасными областями донорского антитела (на аминокислотном базисе) может быть пригодным для обеспечения константной области тяжелой цепи и/или вариабельной каркасной области тяжелой цепи для вставки донорских . Подходящее акцепторное антитело, способное быть донором константных или вариабельных каркасных областей легкой цепи, может быть выбрано аналогичным образом. Следует отметить, что тяжелые и легкие цепи акцепторного антитела необязательно должны иметь происхождение от одного и того же акцепторного антитела. Желательно, чтобы гетерологичные каркасные и константные области выбирались из человеческих иммуноглобулиновых классов и изотипов таких, как(подтипы 1-4), , А и . Однако акцепторное антитело необязательно должно содержать лишь человеческие иммуноглобулиновые белковые последовательности. Так например, может быть сконструирован ген, в котором ДНК последовательность, кодирующая часть цепи человеческого иммуноглобулина слита, с ДНК-последовательностью кодирующей неиммуноглобулиновую аминокислотную последовательность, например, полипептидную эффекторную или репортерскую молекулу. Один из примеров особенно желательного гуманизированного антитела содержит 39, вставленные в каркасные области последовательности выбранного человеческого антитела. В случае нейтрализующих гуманизированных антител, один, два или, предпочтительно, трииз вариабельных областей тяжелой и/или легкой цепи 14 антитела вставляются в каркасные области последовательности выбранного человеческого антитела, заменяя нативныепоследнего антитела. Предпочтительно, в гуманизированном антителе вариабельные домены как тяжелых, так и легких цепей человека подвергаются генно-инженерным операциям путем замены одного или более . Можно использовать все шестьили различные комбинации из менее, чем шести . Предпочтительно заменяют все шесть . Можно заменятьтолько в человеческой тяжелой цепи, используя в качестве легкой цепи немодифицированную легкую цепь человеческого акцепторного антитела. С другой стороны совместимая легкая цепь может выбираться из другого человеческого антитела, прибегая к помощи традиционной базы данных антител. Оставшаяся часть инженерного антитела может быть производным любого подходящего акцепторного человеческого иммуноглобулина. Таким образом, генно-инженерное гуманизированное антитело предпочтительно имеет структуру природного человеческого антитела или его фрагмента и обладает комбинацией свойств, требуемых для эффективного терапевтического использования, например, в лечении связанных с 4 воспалительными заболеваниями людей или для диагностического применения. В качестве другого примера можно привести инженерное антитело, которое содержит тривариабельной области легкой цепи 3 В 9 / 1 Д 116, 18, 20 и 28/ и тривариабельной области тяжелой цепи 3 В 9 / 1 Д 22, 24 и 26/. Полученное в результате гуманизированное антитело характеризуется антиген-связующей специфичностью и высокой аффинностью 3 В 9. Специалистам в данной области должно быть понятно, что инженерное антитело может подвергаться дополнительным модификациям в результате изменений аминокислот вариабельных доменов, причем это необязательно должно оказывать влияние на специфичность и высокую аффинность донорского антитела (т.е. аналога). Так например, были сконструированы гуманизированные моноклональные антитела, в которых аминокислотный остаток в положении 120 легкой цепи представлял собой аргинин / 1 Д 13 и 14/ или треонин / 1 Д 57 и 58/. Следует отметить, что аминокислоты тяжелой и легкой цепей могут быть замещены другими аминокислотами либо в вариабельном домене каркасов, либо в С, или в обеих указанных областях. Кроме этого, константная область может подвергаться изменению, направленному на усиление или снижение селективных свойств молекул настоящего изобретения. В качестве примеров таких изменений можно привести димеризацию, связывание срецепторами, или изменение способности связывать и активировать комплемент (см., например,с сотр. .30105-108 (1993),с сотр., . . . 2693469-3474 (1994),с сотр.,307, 434-В). Слитый протеин, представляющий собой химерное антитело, отличается от описанных выше гуманизированных антител тем, что имеет вариабельные области тяжелой и легкой цепи полностью нечеловеческого донорского антитела, включает каркасные области, ассоциированные с человеческими иммуноглобулиновыми константными областями обеих цепей. Следует отметить, что химерные антитела, сохраняющие дополнительные не-человеческие последовательности относительно гуманизированных антител изобретения,могут вызывать значительную иммунную реакцию у людей. 4496 1 Как обсуждается ниже, такие антитела полезны в профилактике и лечении связанных с действием 4 аллергических расстройств. Получение слитых протеинов и инженерных антител Предпочтительно, вариабельные последовательности легкой и/или тяжелой цепи и 3 В 9 / 1 Д 16, 18, 20, 22, 24 и 26/ или других подходящих донорских(например, 61) и их кодирующие нуклеиново-кислотные последовательности используются для конструирования слитых белков и инженерных антител, предпочтительно гуманизированных антител изобретения, с использованием следующего способа. Такой же или похожие методы могут использоваться для реализации других технических решений настоящего изобретения. Гибридому, продуцирующую выбранное донорское МА, например мышиное антитело 3 В 9, подвергают общепринятому клонированию и ДНК ее вариабельных участков тяжелой и легкой цепи получают методами,известными специалистам в данной области, например методами, описаннымис сотр., Молекулярное клонирование (Лабораторное руководство), 2-е изд., Лаборатория Колд Спринг Харбор (1989). Вариабельные области тяжелой и легкой цепи 3 В 9, содержащие, по крайней мере,и те части вариабельного домена каркасной области легкой и/или тяжелой цепи акцепторного , которые требуются для сохранения связующей специфичности в отношении донорского , а также оставшиеся иммуноглобулиновые части цепи антитела, происходящей из человеческого иммуноглобулина, получают с использованием полинуклеотидных праймеров и обратной транскриптазы.идентифицируют с использованием известной базы данных и сравнением с другими антителами. Затем может быть получено мышь/человек химерное антитело и проведен его анализ на способность к связыванию. Такое химерное антитело содержитиобласти полностью не-человеческого донорского антитела, связанные с константными участками человеческого . для обеих цепей. Гомологичные каркасные области вариабельного участка тяжелой цепи человеческого антитела идентифицировали с использованием компьютеризированной базы данных, например,и человеческое антитело, обладающее гомологией к 3 В 9, выбирали в качестве акцепторного антитела. Последовательности синтетических вариабельных участков тяжелой цепи, содержащих 3 В 9 С внутри каркасов человеческого антитела, конструировали с необязательными заменами нуклеотидов в каркасных областях с целью введения рестрикционных сайтов. Такую сконструированную последовательность затем синтезировали с помощью перекрывающихся олигонуклеотидов, амплифицировали с помощью полимеразной цепной реакциии исправляли ошибки. Аналогичным образом была сконструирована подходящая вариабельная каркасная область легкой цепи. Гуманизированное антитело может происходить из химерного антитела или, предпочтительно, может быть получено синтетически, вставкойдонорскогоиз тяжелых и легких цепей в выбранный каркас тяжелой и легкой цепи. С другой стороны гуманизированное антитело изобретения может быть получено с использованием стандартных приемов мутагенеза. Таким образом, полученное в результате гуманизированное антитело содержит человеческие каркасные области идонорского . Могут быть осуществлены последующие манипуляции с остатками каркаса. Полученное гуманизированное антитело может быть экспрессирован в рекомбинантных клетках-хозяевах, например, клетках С или . Другие подробности такого метода представлены в примере 4. Другие гуманизированные антитела могут быть получены с использованием такого метода на других подходящих 4-специфичных, нейтрализующих, не-человеческих антителах с высоким титром. Традиционный вектор экспрессии или рекомбинантную плазмиду получают проводя оперативную ассоциацию таких кодирующих последовательностей для слитого белка с традиционными регуляторными контрольными последовательностями, способными контролировать репликацию и экспрессию в, и/или секрецию из, клетки-хозяина. Регуляторные последовательности включают промоторные последовательности,напримерпромотор, и сигнальные последовательности, которые происходят из других известных антител. Аналогичным образом получают второй вектор экспрессии, содержащий ДНК последовательность,кодирующую легкую или тяжелую цепь комплементарного антитела. Предпочтительно, такой второй вектор экспрессии идентичен первому, за исключением тех случаев, когда кодирующие последовательности и способные к селекции маркеры предназначаются для максимально возможной функциональной экспрессии каждой полипептидной цепи. Выбранную клетку-хозяин подвергают котрансфекции общепринятыми методами как с первым, так и со вторым векторами или просто трансфицируют одним вектором с целью получения трансфицированной клетки-хозяина настоящего изобретения, содержащей как рекомбинантную, так и синтетическую легкую и тяжелую цепи. Трансфицированную клетку затем культивируют общепринятыми методами с получением инженерного антитела изобретения. Гуманизированное антитело, включающее ассоциацию рекомбинантной тяжелой цепи и/или легкой цепи тестируют из культуры с помощью соответствующих анализов, таких какили . Аналогичные традиционные приемы могут использоваться для конструирования других слитых белков и молекул настоящего изобретения. 4496 1 Подходящие векторы для клонирования и субклонирования, а также конструкции композиций настоящего изобретения могут быть выбраны специалистами в данной области техники. Так например, могут применяться общепринятые рУС серии клонирующих векторов. Один из используемых векторов представляет собой рУС 19 и он выпускается такими поставщиками, как(Букингхамшир, Великобритания) или(Уппсала, Швеция). Кроме этого, любой вектор, способный легко реплицироваться, содержит множество клонирующих сайтов и маркерных генов и в целях клонирования может легко осуществляться любая манипуляция. Таким образом, выбор клонирующего вектора не является ограничивающим фактором настоящего изобретения. Аналогичным образом векторы, используемые для экспрессии инженерных антител согласно изобретению, могут быть выбраны специалистом в данной области из любого традиционного вектора. Такие векторы также содержат выбранные регуляторные последовательности, находящиеся в оперативной ассоциации с ДНК-кодирующими последовательностями иммуноглобулиновых областей и способны направлять репликацию и экспрессию гетерологических ДНК-последовательностей в выбранных клеткаххозяевах, например,промоторы. Такие векторы содержат описанные выше ДНК-последовательности,которые кодируют инженерное антитело слитой молекулы. С другой стороны, такие векторы могут содержать выбранные иммуноглобулиновые последовательности, модифицированные вставкой желаемых рестрикционных сайтов в целях облегчения манипуляции. Векторы экспрессии могут также характеризоваться маркерными генами, подходящими для усиления экспрессии гетерологичных ДНК-последовательностей, например, дигидрофолатредуктазный ген млекопитающего (ДНР) или ген неомицин-устойчивости . Другие предпочтительные векторные последовательности включают поли- А сигнальную последовательность, например бычьего гормона ростаи бетаглобинпромоторную последовательность (еа). Используемые векторы экспрессии могут быть синтезированы методами хорошо известными специалистам в данной области. Компоненты таких векторов, например, репликоны, гены селекции, энхансеры, промоторы, сигнальные последовательности и т.п. могут быть получены из природных источников или синтезированы известными методами с целью их использования для направления экспрессии и/или секреции продукта рекомбинантной ДНК в выбранном хозяине. Другие подходящие векторы экспрессии, многочисленные типы которых известны в данной области для экспрессии у млекопитающих, бактерий, насекомых, дрожжей и грибков, также могут быть выбраны для использования в указанных выше целях. Настоящее изобретение также охватывает клеточную линию, трансфицированную рекомбинантной плазмидой, содержащей кодирующие последовательности инженерных антител или их слитых молекул. Клеткихозяева, используемые для клонирования и других манипуляций с такими клонирующими векторами, также являются традиционными. Однако наиболее желательно использовать клетки различных штаммов . для репликации клонирующих векторов и других стадий конструирования слитых белков настоящего изобретения. Подходящими клетками-хозяевами или клеточными линиями для экспрессии инженерных антител или слитых белков изобретения, предпочтительно являются такие эукариотные клетки, как , , фибробластная клетка (например, ЗТЗ) и миелоидные клетки, причем наиболее предпочтительной является такая клетка млекопитающего, какклетка или миелоидная клетка. Могут использоваться человеческие клетки, что позволяет модифицировать молекулу по профилям человеческого гликозилирования. Могут использоваться и другие эукариотные клеточные линии. Выбор подходящих клеток-хозяев от млекопитающих, методов их трансформации, культивирования, амплификации, скрининга, а также получения продукта и его очистки известны из литературы. См., например, цитированную выше работус сотр. Бактериальные клетки могут оказаться полезными в качестве клеток-хозяев, подходящих для экспрессии рекомбинантных М настоящего изобретения. Однако в связи с тенденцией белков к экспрессии в бактериальных клетках в неуложенной или неправильно уложенной форме или в не-гликозилированной форме, любые рекомбинантные МА, полученные в бактериальной клетке, должны быть подвергнуты скринингру на сохранение способности связывать антиген. Если молекула, экспрессированная бактериальной клеткой, получена в правильно уложенной форме, то такая бактериальная клетка может считаться желательным хозяином. Так например, различные штаммы ., используемые для экспрессии, как хорошо известно, могут применяться в качестве клеток-хозяев в области биотехнологии. В этом методе могут также использоваться различные штаммы . ,другие бактерии и т.п. Как известно специалистам, штаммы дрожжевых клеток также могут использоваться в качестве клетокхозяев, как и клетки насекомых, например,и , а также вирусные экспрессирующие системы. См., например,с сотр. Генная инженерия, 8277-298, Пленум Пресс (1986) и цитированную в этой работе литературу. Основные методы конструирования векторов настоящего изобретения, методы трансфекции, требующиеся для получения клеток-хозяев изобретения, и методы культивирования, необходимо для получения слитого белка или инженерного антитела настоящего изобретения из такой клетки-хозяина, являются хорошо известными приемами. Аналогичным образом, после получения, слитые белки или инженерные антитела изо 14 4496 1 бретения могут быть очищены от компонентов клеточной культуры с помощью стандартных методов, включающих осаждение сульфатом аммония, очистку на аффинных колонках, хроматографических колонках,гель-электрофорез и т.п. Эти методы известны специалистам и не ограничивают сферу изобретения. Еще один способ экспрессии гуманизированных антител может состоять в экспрессии в трансгенном животном, в соответствии с описанным в патенте США 4873316. Этот метод относится к экспрессирующей системе, использующей казеиновый промотор животного, который при трансгенном введении в млекопитающее позволяет женской особи продуцировать желаемый рекомбинантный белок в ее молоке. После экспрессии желательным методом инженерное антитело исследуют наактивность с использованием соответствующего анализа. В настоящее время общепринятые схемы анализаиспользуются для оценки качественного и количественного связывания инженерного антитела с 4 эпитопом. Кроме этого, другиеанализы, например/га/, могут также использоваться для проверки нейтрализующей эффективности перед последующим клиническом исследованием на людях, осуществляемом для оценки персистем инженерного антитела в организме человека в независимости от обычных механизмов очистки. Следуя методам, описанным для получения гуманизированных антител из 3 В 9, специалист в данной области может также сконструировать гуманизированные антитела из других донорских 4 антител, последовательностей вариабельных областей и С пептидов, описанных в настоящей заявке. Инженерные антитела могут быть получены с такими вариабельными каркасными участками, которые потенциально распознаются,как свои реципиентами инженерного антитела. В вариабельной каркасной области могут быть произведены небольшие модификации с целью осуществления сильного увеличения антигенного связывания без ощутимого увеличения иммуногенности для реципиента. Такие инженерные антитела могут эффективно использоваться для лечения людей при болезненных состояниях, связанных с 4. Эти антитела могут также использоваться для диагностики указанных состояний. Терапевтическое и профилактическое применения Настоящее изобретение также относится к способу лечения людей, испытывающих аллергические нарушения, который заключается в применении эффективной дозы антител, включающей одно или более инженерных антител или слитых белков, описанных в настоящей заявке или их фрагментов. Терапевтическая реакция, вызываемая применением молекул настоящего изобретения, возникает вследствие связывания с человеческим 4 и последующим блокированием выделения . Таким образом, молекулы настоящего изобретения в виде препаратов и рецептур для терапевтического использования весьма желательны для применения на пациентах с аллергическими нарушениями, такими как аллергический ринит,конъюктивит, атопический дерматит, атоническая астма и анафилактический шок. Слитые белки, антитела, инженерные антитела или их фрагменты настоящего изобретения могут также использоваться совместно с другими антителами, особенно человеческими МА, реактивными в отношении других маркеров (эпитопов), ответственных за болезненное состояние, против которого направлено действие инженерных антител изобретения. Аналогичным образом МА, реакционноспособные в отношении эпитопов, ответственных за болезненное состояние выбранного животного, против которого направлено действие антитела изобретения, также могут использоваться в ветеринарных композициях. Предполагается, что терапевтические агенты настоящего изобретения окажутся полезными для лечения аллергических состояний в течение периода времени от 2 дней до 3 недель, или по необходимости. Так например, более длительные времена лечения могут оказаться желательными при лечении сезонных ринитов и т.п. Такой метод представляет собой значительный шаг вперед по сравнению с используемым в настоящее время методом вливания в соответствии с известными приемами лечения нарушений, вызванных действием 4. Дозировка и длительность лечения зависят от относительной длительности пребывания молекул изобретения в организме человека и они могут регулироваться специалистом в зависимости от типа заболевания и общего состояния здоровья пациента. Тип применения терапевтического агента изобретения может быть любым, обеспечивающим доставку такого агента в организм хозяина. Слитые белки, антитела, инженерные антитела и их фрагменты, а также фармацевтические композиции изобретения особенно полезны при парентеральном применении, т.е. подкожно, внутримышечно, внутривенно или интраназально. Терапевтические агенты настоящего изобретения могут быть приготовлены в виде фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество инженерного (например, гуманизированного) антитела настоящего изобретения в качестве активного ингредиента в фармацевтически применимом носителе. При профилактическом применении агента изобретения предпочитают использовать водную суспензию или раствор, содержащий инженерное антитело, предпочтительно в среде буфера при физиологическом значении рН, в форме, готовой для инъекции. Композиции для парентерального применения обычно содержат раствор инженерного антитела изобретения или его смесь, растворенную в фармацевтически применимом носителе,предпочтительно в водном носителе. Может использоваться большое число водных носителей, например 0,4 солевой раствор, 0,3 глициновый раствор и т.п. Такие растворы должны быть стерильными и, как правило, они не содержат мелких частиц вещества. Эти растворы могут быть простерилизованы хорошо из 15 4496 1 вестными методами (например, фильтрацией). Такие композиции могут содержать фармацевтически применимые вспомогательные соединения, требующиеся для аппроксимации физиологических условий, и ими могут быть регуляторы рН, буфферные агенты и т.п. Концентрация антитела изобретения в такой фармацевтической рецептуре может изменяться в широких пределах, например, от значения менее 0,5 , обычно, по крайней мере 1 до 15-20 вес.и требуемую концентрацию выбирают основываясь на требуемом объеме жидкости, вязкости и т.п., в соответствии с конкретным типом применения. Так например, фармацевтическую композицию настоящего изобретения для внутримышечного вливания готовят таким образом, чтобы она содержала 1 мл стерильной забуференной воды и 1 нг - 100 мг, как правило, 50 нг - 30 мг или, более предпочтительно, 5-25 мг инженерного антитела изобретения. Аналогичным образом, фармацевтическая композиция изобретения для внутривенного вливания должна содержать 250 мл стерильного раствора Рингера и 1-30 мг, предпочтительно 5-25 мг инженерного антитела настоящего изобретения. Методы приготовления парентерально применяемых композиций хорошо известны специалистам и более детально они описаны, например в, 15-е изд. Мак Паблишинг Компани, Истон, Пенсильвания. Предпочтительно, чтобы терапевтический агент изобретения присутствовал в фармацевтическом препарате в виде единичной дозы. Соответствующая терапевтически эффективная доза может быть легко определена специалистом в данной области. Для эффективного лечения воспалительного расстройства у людей и животных следует применять парентерально, предпочтительно, внутримышечно, единичную дозу, включающую примерно 0,1-20 мг на 70 кг веса тела белка или антитела настоящего изобретения. Такая доза, если необходимо, может быть повторена через соответствующий период времени в ходе воспалительной реакции в соответствии с предписаниями терапевта. Настоящее изобретение также охватывает введение 4 слитых белков настоящего изобретения одновременно или последовательно с другими антителами или слитыми белками, характеризующимися анти-4 активностью, например, фактором активности противоопухолевого некроза или другими фармацевтическими активностями, совместимыми с 4 рецепторной связующей способностью слитых белков изобретения. Такие другие антитела выпускаются промышленностью или могут быть сконструированы в соответствии со способом, аналогичным описанному в настоящей заявке. Слитые белки и инженерные антитела настоящего изобретения могут также использоваться в диагностических целях, например для определения расстройств, связанных с действием 4 или слежения за ходом лечения таких нарушений. В качестве диагностических реагентов такие слитые белки могут быть традиционным образом помечены для использования в анализе Е и других общепринятых анализах,предназначенных для измерения уровней 4 в сыворотке, плазме или других соответствующих тканях. Такие анализы, где используются слитые белки, являются общепринятыми и не ограничивают сферу изобретения. Антитела, инженерные антитела или их фрагменты, описанные в данной заявке, могут быть лиофилизированы для хранения и вновь составлены в подходящем носителе перед использованием. Было показано, что такой прием эффективен для обычных иммуноглобулинов и известные методики лиофилизации и реконституции могут быть использованы. Следующие ниже примеры иллюстрируют различные аспекты настоящего изобретения, включая конструирование представителей инженерных антител и их экспрессию в подходящих векторах и клетках - хозяевах, и такие примеры не ограничивают сферу изобретения. Все аминокислоты обозначены традиционными трех-буквенным или одно-буквенным кодами. Все необходимые рестрикционные энзимы, плазмиды и другие реагенты и материалы получали из коммерческих источников, если это не оговорено особо. Все общие методы клонирующего легирования и другие методы рекомбинантной ДНК-технологии осуществляли в соответствии с описанным в работе Т.с сотр., цитированной выше, или вторым изданием этой книги(1989), ред.с сотр., тех же издателей ( с сотр.). Пример 1. Получение 39 А. Методика иммунизации. Четырех мышей (1 гибриды Ва/с и С 57 В 1/6) подкожно иммунизировали 50 мкг рекомбинантного. человеческого 4 в полном адъюванте Фрейнда и через 4 недели проводили повторную внутрибрюшинную иммунизацию 50 мкг 4 в неполном адъюванте Фрейнда. Основываясь на хорошем значении титра сывороточного антитела по отношению к 4, одну из мышей дополнительно иммунизировали через 8 недель 200 мкг 4 (внутрибрюшинно, физиологический раствор), через два дня - 100 мкг 4 (внутрибрюшинно, в физиологическом растворе) и спустя два дня - 50 мкг 4 (внутрибрюшинно, в физиологическом растворе). Через два дня после финальной иммунизации проводили спленектомию. В. Методика слияния и система скрининга. Клетки мышиной селезенки использовали для получения гибридом (по стандартной методике, например,описаннойс сотр.,256495 (1975), из которых 250 клонов клеток подвергали скринингу на секрецию антитела к 4, с использованием выпускаемой промышленностью системыи анализа, как это описано ниже, в целях связывания 4. В пяти лунках был получен положительный ответ. 16.Скрининговый анализ, осуществляемый в соответствии с описанным ниже, предназначался для измерения аффинности на нативный человеческий 4. В эксперименте 1 активированные альдегидом пластины с 96 лунками покрывали 4 в количестве 1 мкг/мл, 100 мкл/лунку в 0,1 боратном буфере, рН 8,5 и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. К пластине ковалентно присоединяли 4. Раствор 4 удаляли и неспецифически связанные (В) сайты блокировали 1 бычьим сывороточным альбумином в ТВ буффере (50 мМ Трис, 150 мМ , 1 мМ 2, 0,023, рН 7,4) в течение 60 минут при 37 С. После этой и каждой из последующих стадий пластину промывали 4 раза промывным буфером (10 мМ Трис, 150 мМ , 0,05 Твин 20, 0,023, рН 7,4). После этого добавляли 50 мкл гибридомной среды (очищенный 3 В 9 илифрагменты) и 50 мкл аналитического буфера (0,5 бычьего гаммаглобулина в ТВ буффере) и пластины инкубировали в течение 60 минут при 37 С. 100 мкл биотинилированного анти-мышиного антитела добавляли в каждую лунку в среде аналитического буффера и проводили инкубацию, как описано выше. 100 мкл стрептавидина, конъюгированного со щелочной фосфатазой добавляли в лунку и проводили инкубацию (30 минут при 37 С). Добавляли 100 мкл/лункуи проводили инкубацию в течение 30 минут при 37 С. Показания снимали по оптической плотности при длине волны 405 нм. В эксперименте 2 покрытые стрептавидином пластины (100 мкл/лунку, 1 мкг/мл в фосфатном буферном растворе ( инкубировали в течение ночи при 4 С и анализировали, как описано ниже. Стрептавидиновый раствор удаляли, В сайты блокировали 1 вбуффере (60 минут при 37 С). После этой стадии и каждой из последующих стадий пластины четыре раза промывали промывным буфером 50 мкл биотинилированного 4 добавляли совместно с 50 мкл аналитического буфера и систему инкубировали в течение 30 минут при 37 С. После этого добавляли 50 мкл очищенного 3 В 9 илифрагмент (или гибридомную среду) плюс 50 мкл аналитического буфера и проводили инкубацию в течение 60 минут при 37 С. Добавляли 100 мкл антимышиного -щелочно-фосфатазного конъюгата и проводили инкубацию в течение 60 минут при 37 С. Добавляли 100 мклсубстрата и проводили инкубацию в течение 30 минут при 37 С. Отсчет показаний проводили, как описано выше. В. Расчет 3 В 9 аффинности к 4. Используя результаты описанных выше экспериментов и суммируя их, как описано ниже, рассчитывалидля 3 В 9 в соответствии с методомс сотр., ., 100173-179 (1987) 1,2(2 Ахконцентрация связанного А при 150 нг/мл биотинилированного 4,концентрация связанногопри 300 нг/мл биотинилированного 4. Константы диссоциации рассчитывали из следующего соотношения 1.Эксперимент 1 анализна пластине с 96 лунками, покрытой стрептавидином (100 нг/лунку).2,210-10(3 В 9 ). Эксперимент 2 анализна пластине с 96 лунками, покрытой стрептавидином (100 нг/лунку).1,410-10(3 В 9 ). С. Специфичность. МА 3 В 9 распознает человеческий 4, но не распознает бычий или мышиный 4. Один из путей определения такого явления состоит в следующем. Анализможет быть осуществлен с использованием пластины с 96 лунками, покрытой анти-мышиными затем заблокированной бычьим сывороточным альбумином, на которой 50 мкл 3 В 9 (100 нг/мл), 25 мкл не-человеческого 4 и 25 мкл биотин-4 инкубировали в течение 60 минут при 37 С, после чего проводили промывку стрептавидином, конъюгированным с щелочной фосфатазой и РР. Аналогичным образом было установлено, что 61 не распознает бычий или мышиный 4. Пример 3. Гуманизированное антитело Одно гуманизированное антитело конструировали таким образом, чтобы оно содержало мышиныевнутри каркаса человеческого антитела. Такую гуманизированную версию 4 специфичного мышиного антитела 3 В 9 готовили путем осуществления следующих манипуляций. А. кДНК клонирование. Клоны кДНК получали из мРНК 3 В 9 тяжелых и легких цепей, экстрагированной из 3 В 9 гибридомной клеточной линии (пример 1), с использованием набора Вое , Праймеры, специфичные как на мышиный шарнирный участок, так и на каппа-константную область использовали для синтеза первой нити. 4496 1 Праймер каппа цепи представляет собой / 1 Д 129/ Праймер тяжелой гамма-цепи представляет собой / 1 Д 30/ Двух-нитевую кДНК клонировали непосредственно в плазмиде рЕМ 7/го/, которыми затем трансформировали Е.со ДН 5-а //. В. Секвенирование ДНК. кДНК клонов восьми мышиных тяжелых и одной легкой цепи мышиных из Части А подвергали секвенированию. Результаты секвенирования вариабельных областей таких клонов показаны в 1 Д 1, 2, 3 и 4. Каждый клон содержал аминокислоты, известные как консервативные среди вариабельных районов мышиных тяжелых цепей или легких цепей, и мышиные сигнальные последовательности. Аминокислотные последовательностиперечислены ниже.области тяжелой цепи представляют собой 1 Д 22, 24 и 26 (аминокислоты 50-56, 71-86 и 119-129 последовательности 1 Д 4), см. фиг. 2. Такие последовательности закодированы последовательностями 1 Д 21,1 Д 23 и 1 Д 25 соответственно.области легкой цепи представляют собой 1 Д 16, 18 и 20 (аминокислоты 45-58, 74-80 и 113-121 последовательности 1 Д 2), см. фиг. 1. Такие последовательности закодированы последовательностями 1 Д 15, 17 и 19,соответственно. С. Отбор человеческих каркасов. После клонирования 39, аминокислотные последовательности вариабельной области (аминокислоты 211321 Д 2 и аминокислоты 20-1401 Д 4) сравнивали с базой данных последовательностей человеческого иммуноглобулина, с использованием баз данныхис целью идентификации человеческого каркаса как для тяжелой, так и для легкой цепи, которые наиболее близко совместимы с мышиным источником по гомологии последовательности. Помимо этих исследований по гомологии последовательности, легкие и тяжелые цепи также оценивали относительно позиционной базы данных, разработанной из структурных моделейдомена с целью определения потенциальных конфликтов, связанных с заменами аминокислот, которые могут оказывать влияние напредставление. В настоящем случае структурными исследованиями не было обнаружено очевидных конфликтов поэтому использовали ДНК кодирование, выведенное на основании исследований гомологии аминокислотной последовательности. Использовали каркасные области тяжелой цепи антитела, полученного из человеческого миеломного иммуноглобулина (СО) (. , ..117641-660 (1970. Такая последовательность оказалась примерно на 77 гомологичной (69,4 идентичность) 3 В 9 вариабельной области цепи на аминокислотном уровне. Для подходящей вариабельной каркасной области легкой цепи использовали вариабельную каркасную последовательность легкой цепи человеческого антитела, идентифицированную.с сотр., .. . 136515-6529 (1985). Было установлено, что последовательность человеческого антитела примерно на 80,2 гомологична (идентичность 72,0 ) мышиной вариабельной области легкой цепи на аминокислотном уровне. Используя мышиные 3 В 9/ 1 Д 15-26/ и последовательность человеческого антитела, получали синтетическую тяжелую цепь и осуществлялидля амплификации ДНК. Такие последовательности синтезировали с помощью следующих перекрывающихся олигонуклеотидов и амплифицировали с помощью.1 Д 31-37 предусматривает пять перекрывающихся олиго и 2 праймера. Олиго 1 / 1 Д 31/, как установлено, содержит основания 5-121. Олиго 2 / 1 Д 32/ содержит основания в диапазоне 122-241, а олиго 3 / 1 Д 33/ содержит основания 242-361. Два нижних нитевых праймера 1 Д 34 и 1 Д 35 содержат основания 134-110 и основания 134-110 и основания 253-230. Все ошибки в картированной последовательности, которые были внесеныбыли исправлены.осуществляли снова с использованием в качестве 5 праймера нуклеотиды 1-251 Д 36, а в качестве 3 -праймера - нуклеотиды 361-341 последовательности 1 Д 37. Синтетический вариабельный участок легировали в экспрессирующий вектор рС совместно с синтетической сигнальной последовательностью 1 Д 5 и 6 из химерной конструкции тяжелой цепи совместно с 1 человеческой константной областью. Синтетическая Н и нуклеотидная и аминокислотная последовательности сигнальной последовательности представлены на рис. 4 / 1 Д 11 и 12/. Аминокислотные последовательности/ 1 Д 22, 24 и 26/ идентичны мышиным 3 В 9 ВД. Однако кодирующие последовательности для/ 1 Д 54, 55 и 56/ отличаются от мышиных 3 В 9 кодирующих последовательностей / 1 Д 21, 23 и 25/. Полученный в результате вектор экспрессии, 4 1-1- показан на рис. 9.генные области пресуществующего каркаса легкой цепи удаляли рестрикционным перевариванием и заменяли на следующие синтетические 4 гены, которые получали синтетическим путем. Для 1 18 Синтетическаяи нуклеотидная и аминокислотные последовательности сигнальной последовательности показаны на фиг. 5 / 1 Д 13 и 14/. Аминокислотные последовательности двух первых С / 1 Д 16 и 18/ идентичны соответствующим мышиным 3 В 9 . Однако кодирующая последовательность для первого/ 1 Д 53/ отличается от мышиной 3 В 9 кодирующей последовательности / 1 Д 15/. Кроме этого в последнембыли созданы две гуманизированные конструкции 3 В 9 аминокислотной последовательности. Одна из них / 1 Д 28/ отличается по сигнальной аминокислотной / 1 Д 20/ от нативной мышиной 3 В 9 последовательности.1 Д 28 закодирована последовательностью 1 Д 27. Синтетические вариабельные легкие области легировали в вектор экспрессии совместно с сигнальной последовательностью / 1 Д 7 и 8/. Один из полученных векторов экспрессии, 4 Рс показан на фиг. 10. Такие синтетические вариабельные последовательности легкой и/или тяжелой цепи используются при конструировании гуманизированного антитела. Пример 4. Экспрессия гуманизированногов клеткахир 18 субклоны дляполучали таким образом, чтобы добавить сигнальную последовательность, первоначально полученную от человеческого антитела 1 Д 5. Дляполучали субклоны р 18 с целью добавления сигнальной последовательности 1 Д 7. Гуманизированная тяжелая цепь, являющаяся производным 1 изотипа, проявляет 893 гомологию(идентичность 84,3 ), на аминокислотном уровне, к мышиной тяжелой цепи от 3 В 9. Синтетическаяобеспечена аминокислотами 20-141 последовательности 1 Д 11 и 12. Гуманизированная легкая цепь, человеческая каппа-цепь, демонстрирует 92,0 гомологию (идентичность 86,6 ) с 3 В 9 на аминокислотном уровне. Синтетическая/аминокислоты 21-131 последовательности 1 Д 13 и 14/, содержащая 3 В 9 была сконструирована и синтезирована в соответствии с описанным для синтетических тяжелых цепей. Фрагменты ДНК, соответствующие сигналы которых связаны с вариабельными участками как гуманизированной тяжелой, так и легкой цепи вставляли р 19 - основанные экспрессирующие плазмиды клеток 19 4496 1 млекопитающих, содержащие СМУ промоторы и константные области человеческой тяжелой или легкой цепи химеры, полученной в примере 5, используя для этого традиционные методы /, цитированная выше/ с получением плазмид 4 -(тяжелая цепь) /фиг. 9/ и 4 - ) (легкая цепь) /фиг. 10/. Плазмидыикотрансфицировали в клеткии супернатанты анализировали методомна присутствие гуманизированного антитела через 3 и 5 дней. Другое гуманизированное антитело конструировали с использованием 4 изотипа. В представленном примере описывается получение инженерного антитела. Другие методики могут использоваться для создания других инженерных антител с использованием других анти-4 антител (например, 61 - пример 7), полученных традиционными методами. Пример 5. Конструирование химерного антитела А. Химерную тяжелую цепь конструировали путем выделения мышиного вариабельного участка тяжелой цепи из оригинального мышиного МА 3 В 9 в виде 111 рестрикционного фрагмента. Конструировали и синтезировали небольшой олигомер ДНК для соединения мышиного вариабельного участка с человеческой 1 константной областью (111) Два таких фрагмента легировали в плазмиду рС (см. рис. 7) (расщепленную с Есо 1 и 1), которая уже кодирует человеческий 1 константный участок. Такой клон не экспрессировался, поэтому 5 дикого типа и сигнальную последовательность делетировали и заменяли на 1 Д 5 и 6. Поскольку традиционный рестрикционный эндонуклеазный сайт не доступен на 3 окончании сигнальной последовательности, вводили 11 сайт (т.е. молчащая мутация) с помощью . Использовали следующиепраймеры Затем из такой плазмиды выделяли 11-1 рестрикционный фрагмент. Затем конструировали и синтезировали новую сигнальную последовательность и 5, содержащие Есо 1 и 11 концы. Химерную легкую цепь конструировали с применением техникик исходной мышиной 3 В 9 легкой цепи, которую клонировали в 72 //. Используемые праймеры представляли собой выпускаемые промышленностью р 18 универсальный обратный праймер на 5 конце (Есо 1) и 3 праймер, вводящий сайтиспользуемый для слияния мышиного вариабельного участка с человеческим константным участком. Затем такую вариабельную область легировали в экспрессионный вектор(Есо 1 ) (рис. 8), который уже содержал человеческую каппа-область. Через 3 и 5 дней собирали супернатанты и проводили аналин методом , описанным ниже пластиныпокрывали 0,1 мкг козьего антитела, специфичного наобласть человеческих антител. Супернатанты среды добавляли в течение часа. Добавляли пероксидазу хрена, конъюгированную с козьим антителом, специфичным на полное человеческоеантитело. После этого в течение часа добавлялипероксидазный субстрат (Киркегаард и Перри Лабораторис Инк., Гайтерсбург, МД). Детектировали экспрессию химерного антитела. Во втором анализеклеточные супернанты, содержащие химерное антитело, специфически связывались с рекомбинантным человеческим 4 протеином. Этот результат подтверждает тот факт, что гены кодирующие антитело специфичное на 4 подвергались клонированию. В. Гуманизированная тяжелая цепь может быть также получена из такой химерной тяжелой цепи. Гуманизированную тяжелую цепь конструировали вставкой мышиныхв человеческий каркас. Использовали тот же человеческий каркас, что описан выше, наиболее гомологичная протеиновая последовательность в Швейцарской базе данных протеинов на мышиную 3 В 9 Н (аминокислоты 20-140 последовательности 1 Д 4). Такую гуманизированную последовательность тяжелой цепи (Есо 1 ) получали синтетическим путем и осуществлялис целью амплификации ДНК, в соответствии с описанным выше. Синтетическую вариабельную область легировали в экспрессирующий вектор(Есо 1 ) совместно с синте 20 4496 1 тической сигнальной последовательностью 1 Д 5 и 6 из химерной конструкции тяжелой цепи и 1 человеческого константного участка. Аналогичным образом гуманизированная легкая цепь может быть получена из химерной легкой цепи, в соответствии с описанным выше для тяжелой цепи. Этот ген (Есо а) получали также синтетическим путем. Гуманизированныйлегировали в экспрессирующий вектор рС, переваренный в присутствии Есо 1 , совместно с сигнальной последовательностью (Есо 1 Есо). Вектор экспрессии содержал человеческую каппа константную область. Пример 6. Очистка и термодинамика гуманизированного МА Очисткаэкспрессированного химерного и гуманизированного 3 В 9 может достигаться традиционными методами белковой А (или ) аффинной хроматографии с последующим применением ионообменной хроматографии и гель-фильтрации. Аналогичные методы с успехом использовались для очистки до чистоты 95 других(например, респираторного синцитиального вируса и малярийных циркумспорозоитных антигенов). Аффинность и подробная термодинамика 4 связывания с гуманизированным 3 В 9 и мышиным 3 В 9 (пример 1) определяли методом микрокалориметрического титрования. В этом методе измеряются реакции связывания по их внутренним теплотам реакции (см., например,с сотр., . . 179131-137 (1989). Аффинность обоих МА оказалась настолько прочной, что не было возможности провести измерения при окружающей температуре. Тогда был применен термодинамический подход ) аффинность измеряли при 60 С, когда она достаточно слаба и поддается прямому измерению и ) снимали температурную зависимость энтальпии связывания при 30-60 С. Совместно полученные результаты позволили рассчитать аффинность в широком температурном интервале с использованием уравнения ГиббсаГельмгольца. Результаты термодинамики 4 связывания для гуманизированного и мышиного 3 В 9 антител представлены в таблице 1. На основании различий в свободной энергии, энтальпии, энтропии и теплоемкости двух таких МА можно сделать вывод о неразличимости их термодинамического поведения. Таблица 1 Термодинамика связывания 4 с гуманизированным 3 В 9 и мышиным 3 В 9 при рН 7,4, 150 мМ , 25 С МА-660200 4 аффинности гуманизированного 3 В 9 и мышиного 3 В 9 измеряли повторением операций 4 и 2 раза соответственно. Пример 7. Получение характеристики крысиного МА МА 61, выбранное для высоко-аффинного связывания, получали от иммунизированной крысы с использованием протокола иммунизации, описанного для мышей в примере 1. 61 выбирали из гибридом(1987) и полученное значение было равно 210-10 . Гибридома 3426 А 11 С 1 В 9 депонирована 6 октября 1993 г. в Европейской коллекции культур клеток животных , Лаборатория здравоохранения сервисного центра по прикладной микробиологии и исследованиям, Портон Даун, Салисбури, Вильтшайр, 4 01, Великобритания, под каталожным номером 93100620 и акцептирована как патентный депонент в соответствии с Будапештским договором 1977 г., регулирующим депонирование микроорганизмов в целях патентования. Пример 8. Биологическая активность 3 В 9 (гуманизированного) 3 В 9 (мышиного) и 61. Следующие ниже анализы проводили с использованием описанных ниже методик. А. Связывание с гликозилированным 4. Указанные выше антитела индуцировали к не-гликозилированному рекомбинантному человеческому 4( 4), которое продуцировали в Поскольку нативный человеческий 4 является гликозилированным, важно подтвердить связыванием с материалом, секретированным клеточной линией млекопитающих. 3 В 9 в одинаковой степени хорошо присоединяется как к гликозилированному, так и к негликозилированному человеческому рекомбинантному 4 и поэтому направлен к эпитопу, который может быть замаскирован на природном человеческом 4. В. Ингибирование 4 связывания с рецептором. Способность 3 В 9 ингибировать связывание 4 с его рецептором изучалась с использованием 1254 связывания с клеточной линией гибона,/ Т 1 В 201/, которая несет примерно 6000 рецепторов в расчете на клетку.клетки инкубировали с 125-4 в течение 30 минут при 37 С. Поглощение радиоак 21 4496 1 тивности определяли в гамма-счетчике после отделения клеточно-связанного 125-4 центрифугированием через масляный градиент. -специфическое связывание определяли инкубацией в присутствии 100 кратного молярного избытка немеченного 4 / с сотр., . . . 166476-488 (1987)/. Значение 50 для немеченного 4 в таком анализе составило 22 пМ при количестве добавленного 4 83 пМ. Для интактного мышиного 3 В 9 значение 50 составило 63 пМ и 93 пМ дляфрагмента. При другой концентрации 4 (218 пМ) полученное в анализе количество для мышиного 3 В 9 составило 109 пМ. С. Ингибирование пролиферации лимфоцитов. С использованием метода, описанногос сотр., . . 1391142-1147 (1987), человеческие периферические лимфоциты крови инкубировали в течение трех дней в присутствии фитогемаглютинина, Тклеточного митогена, с целью активации 4 рецептора. Полученные в результате бластоидные клетки затем стимулировали в течение трех дней с помощью 4. Пролиферацию измеряли внедрением 3 тимидина. Пролиферацию В-клеток измеряли методом анализа согласнос сотр., Лимфокинез и интерфероны. Практический подход, гл. 19, стр. 345, при следующих модификациях. Очищенные В-клетки человеческих миндалин стимулировали в течение 3 дней с помощью 4 и иммобилизованного анти-. Пролиферацию измеряли внедрением 3 тимидина. Мышиный 3 В 9 ингибировал внедрение 3 Н-тимидина в человеческие перефирические Т-лимфоциты крови, стимулированные 133 пМ 4, и в В-лимфоциты человеческих миндалин, стимулированные 167 пМ 4. 2 - стимулированные Т-лимфоциты не подвергались воздействию. Значение 50 для ингибирования пролиферации -клеток составило 30 п, а для пролиферации В-клеток 103 пМ. Соответствующие значения дляфрагмента мышиного 3 В 9 составили 108 и 393 пМ. Д. Ингибирование С 23 индукции. С 23 представляет собой низко-аффинный рецептор(11) и индуцируется на мембране Влимфоцитов низкими концентрациями 4, что является необходимой предпосылкой дляпродуцирования. Очищенные В-клетки человеческих миндалин стимулировали в течение 2 дней с помощью 4. Процентное количество клеток, экспрессирующих 23 рецептор, определяли методом проточной цитометрии/ с сотр., . . . 1651459-1467 (1987)/. Мышиный 3 В 9 ингибировал С 23 экспрессию на Влимфоцитах человеческих миндалин, стимулированных 8,3 пМ 4 при значении С 50 136 пМ.. Ингибированиесекреции. В отличие от других анализов, в которых 4 добавляли при 50 концентрациях / с сотр., . .. . 856880-6884 (1988),секрецию исследовали в присутствии концентраций 4, обеспечивающих максимальную секрецию с тем, чтобы уменьшить вариабельность, присущую такой системе. Пролиферацию Тклеток измеряли следующим образом. Человеческие лимфоциты периферической крови инкубировали с 4 в течение 10-18, предпочтительно 12 дней. Концентрациюв супернатанте культуры определяли методом.секреция ингибировалась мышиным 3 В 9 ифрагментом 3 В 9 в присутствии 1,7 нМ 4, давая значение С 50 1,9 и 5,0 нМ, соответственно. Эксперимент повторяли с использованием более низкой концентрации 4, 667 пМ, что понижало значение С 50 до 0,65 нМ в случае мышиного 3 В 9. В изученных концентрационных пределах молярное соотношение антителак 4 оставалось неизменным (11).. Резюме и интерпретация данных. Молярные соотношения 4 к различным МА, требуемые для 50 ингибирования функции в биоанализах представлены в таблице 2. Таблица 2 Сравнительная активность МА 389, 61 и гуманизированного 3 В 9 число независимых опытов. 1 и 4 варианты испытывали в различное время. Во всех анализах, за исключениемсекреции, 4 добавляли с примерно ЕД 50 концентрацией. Молярные соотношения между антителом и 4, требуемые для 50 ингибирования, близки для гуманизированно 22 4496 1 го 3 В 9, мышиного 3 В 9 и 61 в двух анализах по пролиферации лимфоцитов, но выше для гуманизированного 3 В 9 в С 23 индукционном анализе. Последний анализ является особенно чувствительным, требующим очень низких (5 ) степеней занятости рецептора (К с сотр.,, 125121, 1993) и, как видно из результатов, полученных при использовании мышиного 3 В 9, и в связи с этим подвержен аналитическим вариациям. Сравнение активностей крысиного 61 и мышиного 3 В 9 демонстрирует аналогичную картину функциональных эффектов, а также неожиданную неспособность 6 полностью ингибировать связывание радиоиодированного 4 с его рецептором. Предполагается, что радиоиодированный 4, используемый в рецепторно-связующем анализе, иодирован по доступному тирозину, остатку 124. При сравнении способности 61 ингибировать С 23 экспрессию, индуцированную немеченным или иодированным 4, было обнаружено,что ингибирование менее эффективно в случае иодированного лиганда. Эти результаты показывают, что 61 связывается с 4 в области тирозина 124, но без специфичности к этому остатку. Таким образом, полученные данные показывают, что 61 представляет собой нейтрализующее антитело высокой аффинности, способное связываться с совершенно другим участком 4, чем 3 В 9. Пример 9. Фармакокинетика Фармакокинетические свойства гуманизированного 3 В 9 изучали на самцах крыс разновидности. Гуманизированное 3 В 9 применяли на четырех животных в видешаровидной массы с дозировкой 1 мг/кг, причем отбор образцов крови продолжали в течение 5 недель после применения. Концентрацию гуманизированного 3 В 9 в плазме определяли с использованием 4/анти-человеческойсэндвичевой ЕА, предназначенного подтвердить не только наличие циркулирующего человеческого , но также его способность связываться с рекомбинантным человеческим 4. Полученные результаты суммированы в таблице 3. Таблица 3 Фармакокинетика гуманизированного 3 В 9 на самцах крыс(доза 1 мг/кг в пилюле)(мл /ч. /кг) Крыса 1 0,442 Крыса 2 0,655 Крыса 3 0,555 Крыса 4 0,447 Среднее значение 0,525 Среднеквадратичное отклонение 0,101 Принято следующее сокращение фармакокинетического параметра , кажущееся очищение плазмы. Полученные данные показывают, что вариабельность между животными относительно мала и исчезновение гуманизированного 3 В 9 из плазмы, по-видимому, является двухфазным. Кажущееся очищение плазмы было низким (0,5 мл/час/кг). Период полураспада составлял 11 дней. Таким образом, фармакокинетические характеристики гуманизированного 3 В 9, являющегося производнымклеток, согласуется с другими гуманизированными моноклональными антителами у крыс. Длительный период циркуляционного полувыведения гуманизированного 3 В 9 у крыс также позволяет предположить, что при применении на людях гуманазированное 3 В 9, по-видимому, будет эффективным в течение длительного периода времени. Многочисленные модификации и вариации настоящего изобретения охватываются приведенным выше описанием и они должны быть очевидны для специалистов в данной области. Так например, человеческие каркасные области или их модификации, отличные от приведенных выше примеров антител, могут использоваться для конструирования гуманизированных антител. Такие модификации и изменения композиций и способов настоящего изобретения охватываются сферой прилагаемой формулы изобретения.