Средство для ингибирования стрептокиназы

07 1/00 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СРЕДСТВО ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ СТРЕПТОКИНАЗЫ(71) Заявитель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Зильберглейт Марк Аронович Пыжова Нелли Семеновна Лисова Валентина Сергеевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии(57) Применение лигносульфонатов в качестве средства для ингибирования стрептокиназы.(56)Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы стендовых сообщений. - М. Наука,1986. - Т. 2. - С.14-15. Савченко Н.Е. и др. Здравоохранение Беларуси. - 1981. -7. - С. 10. Никандров В.Н. и др. Вопросы медицинской химии, 1987, т. 33, вып. 1. - С.84-87. Стрептокиназа в регуляции свертывающей и противосвертывающей систем крови. Минск, 1985. - С. 102-103. Стрептокиназа и другие тромболитические ферменты. - Минск, 1979. - С. 74-75. Чудаков М.И. Промышленное использование лигнина. - М. Лесная промышленность,1983. - С. 38-39. Изобретение относится к области химии полимерных соединений и может быть использовано при отборе стрептокиназных активаторов плазминогена, при изучении механизмов регуляции фибринолиза, при очистке стрептокиназы. Направленное изыскание стрептокиназных активаторов плазминогена для ряда отраслей медико-биологических наук основано на использовании приемов ингибиторного анализа. Это требует применения при данном анализе специфических ингибиторов стрептокиназы. Исследование механизмов регуляции фибринолиза, представляющих собою реакции ограниченного протеолиза, преследует установление типа и конфигурации активных центров ферментов. С этой целью в молекулярной энзимологии широко используются приемы ингибиторного анализа 1. Следовательно, дальнейший прогресс данной области требует изыскания специфических ингибиторов различной структуры. Разработка эффективных приемов очистки белков и ферментов, в том числе и стрептокиназы методами аффинной хроматографии основана на использовании сорбента - какого-либо полимерного носителя с пришитым лигандом, в качестве которого часто используются ингибиторы соответствующих ферментов 2. 5821 1 Эти обстоятельства вызывают необходимость изыскания эффективных для ингибирования стрептокиназы соединений. Известно, что активность стрептокиназы резко подавляется фенолом 3. Однако действие его в качестве ингибитора неспецифично фенол подавляет активность не только стрептокиназы, но и таких протеинкиназ как химотрипсин 4. Более того, фенол является токсичным для человека веществом 5, он характеризуется неустойчивостью, относительно малой растворимостью в воде при комнатной температуре (6,7 г на 100 мл) 6. Задачей настоящего изобретения является изыскание специфического ингибитора стрептокиназы со стабильными ингибиторными свойствами. Поставленная задача решается тем, что для ингибирования активности стрептокиназы используют продукт промышленного процесса переработки древесины - лигносульфонаты. Это вещество с молекулярной массой 4000 дальтон (по данным гель-хроматографии 7), элементным составом С - 66,4 ,- 6,0 ,- 0,5 , О - 27,1 . Продукт имеет следующие функциональные группы 3 (метод высокочастотного титрования 8) - 1,6 общие ОН-группы (метод ацитилирования 8) - 10,4-ОСН 3 (метод расщепления 8) - 15,1 СО (метод оксимирования 8) - 2,3-СООН (кальций-ацетатный метод 8) - 1,5 . Предложенное решение является новым и неочевидным, так как до сих пор не описано применение указанного соединения в качестве ингибитора стрептокиназы. Из известных свойств лигносульфонатов не вытекала с очевидностью возможность использования его для ингибирования активности стрептокиназы. Из известных свойств лигносульфонатов не вытекала с очевидностью возможность использования его для ингибирования активности стрептокиназы. Сущность изобретения поясняется примерами. Пример 1. Водный раствор лигносульфоната (15 г/л) разводили дистиллированной водой в соотношении лигносульфонат вода 21, 14, 114 и 129, получая рабочие растворы лигносульфоната с концентрацией соответственно 10 3,0 1,0 0,5 г/л. Затем каждый из указанных растворов, а также исходный раствор лигносульфоната смешивали с раствором стрептокиназы в 0,06 М фосфатном буфере рН 7,4 в соотношении 11 (конечная концентрация лигносульфоната составляла 7,5 5,0 1,5 0,5 и 0,25 г/л) и оценивали активаторное действие этих образцов по лизису содержащих плазминоген пластин человеческого фибрина в соответствии с 3. В качестве контрольного образца использовали раствор стрептокиназы, в который вместо раствора лигносульфоната вносили равное количество фосфатного буфера. Результаты сведены в табл. 1. Таблица 1 Влияние лигносульфоната на активаторную функцию стрептокиназы (4) Конечная концентрация лиг- Площадь зон фибринолиза,носульфоната, г/л мм 2 контроль 46224 7,5 465 5,0 466 1,5 11610 0,5 18512 0,25 39321 Следовательно, полученное вещество является ингибитором стрептокиназы, его ингибиторное действие наиболее сильно выражено при концентрации 1,5-7,5 г/л. 2 5821 1 Пример 2 (конкретное применение). Раствор лигносульфоната (15,0 г/л) смешивали в соотношении 11 с растворами стрептокиназы, урокиназы, трипсина -химотрипсина, папаина в 0,06 М фосфатном буфере и оценивали интенсивность фибринолиза по лизису пластин человеческого фибрина, как указано в примере 1. В качестве контрольных использовали образцы ферментов, в которые вместо раствора ингибитора вносили равное количество фосфатного буфера. Результаты сведены в табл. 2. Таблица 2 Влияние лигносульфоната на активность ферментов (4) Ферменты стрептокиназа урокиназа трипсин Площадь зон фибринолиза, мм 2 Подавление активнов присутствии ингибисти,в отсутствии ингибитора тора 58331 583 90 61222 56330 8 25412 25618 0 29015 29119 0 2109 20718 0 Следовательно, лигносульфонаты являются специфическим ингибитором стрептокиназы и позволяют проводить отбор стрептокиназных активаторов плазминогена. Технический результат изобретения заключается в том, что заявляемое техническое решение позволяет стабильно достигать избирательное и сильное подавление активаторной функции стрептокиназы, не оказывая влияния на активность урокиназы, трипсина и-химотрипсина. Эта специфичность ингибирования действия стрептокиназы является стабильной, поскольку лигносульфонаты являются отходом промышленного процесса сульфирования целлюлозы. В связи с этим, получение ингибитора стрептокиназы является хорошо воспроизводимым процессом, а сам ингибитор - сульфонат лигнина является доступным и не требует специального процесса получения. Источники информации 1. Березин И.В., Клесов А.А. Практический курс химической и ферментативной кинетики. МГУ. - М., 1976. - С. 84. 2. Туркова Я. Аффинная хроматография. - М. Мир, 1980. - С. 108. 3. Никандров В.Н., Пыжова Н.С., Вотяков В.И. Влияние органических растворителей на инициируемый стрептокиназой фибринолиз // Вопросы медицинской химии. - 1987. - Т. 33.-1. - С. 84-87. 4. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. - М. Наука, 1971. - С. 61. 5. Фенол. Большая медицинская энциклопедия. Издание 3-е. Том 26. - М. Советская энциклопедия,1985. - С. 256-258. 6. Рабинович В.А. Хавкин З.Я. Краткий химический справочник. Издание 2-е. - Л. Химия, 1978. - С. 191. 7. Детерман Г. Гель-хроматография. - М. Мир, 1970. - С. 224-225. 8. Закис Г.Ф. Функциональный анализ лигнинов и их производных. - Рига Зинатне,1987. - С. 19, 58, 87, 151, 185. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3