Способ моделирования позднего дистантного ишемического посткондиционирования миокарда у крысы в эксперименте

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ПОЗДНЕГО ДИСТАНТНОГО ИШЕМИЧЕСКОГО ПОСТКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ МИОКАРДА У КРЫСЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр Кардиология Министерства здравоохранения Республики Беларусь(72) Авторы Мрочек Александр Геннадьевич Булгак Александр Григорьевич Басалай Марина Васильевна Барсукевич Вероника Чеславовна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр Кардиология Министерства здравоохранения Республики Беларусь(57) Способ моделирования позднего дистантного ишемического посткондиционирования миокарда у крысы в эксперименте, заключающийся в том, что при острой ишемии миокарда вскрывают грудную клетку в четвертом межреберном промежутке слева, осуществляют обратимую 30-минутную окклюзию передней нисходящей коронарной артерии посредством наложения лигатуры, после чего осуществляют реперфузию, удалив лигатуру с передней нисходящей коронарной артерии, и создают на 10-й мин реперфузии в течение 15 мин ишемию задних конечностей посредством наложения лигатур на обе бедренные артерии. Изобретение относится к экспериментальной медицине и экспериментальной кардиологии и может быть использовано для изучения феномена ишемического посткондиционирования в эксперименте на лабораторных животных и предназначено для поиска лекарственных препаратов, обладающих кардиопротекторным эффектом. В экспериментальной медицине широко используют способ моделирования локального ишемического прекондиционирования миокарда 1, 2. Известно также множество способов моделирования дистантного ишемического пре- и перкондиционирования миокарда, таких как окклюзия передней и задней конечностей, огибающей, мезентериальной и почечной артерий, осуществляемые до начала острой ишемии миокарда (прекондиционирование) и во время коронарной окклюзии (перкондиционирование) 3. В последнее время был предложен способ моделирования позднего локального ишемического посткондиционирования миокарда 4. Этот способ заключается в том, что лабораторному животному, например мыши, под общей анестезией вскрывают грудную клетку и выполняют обратимую 40-минутную окк 18429 1 2014.08.30 люзию передней нисходящей коронарной артерии при помощи лигатуры. Кратковременные повторные эпизоды ишемии и реперфузии миокарда, представленные тремя 1-минутными циклами ишемии/реперфузии, выполненные через 1, 5, 10, 15, 20 и 30 мин после восстановления коронарного кровотока, приводят к выраженному ограничению окончательного размера некроза в миокарде по сравнению с животными, которые подвергались только 40-минутной окклюзии и 60-минутной реперфузии миокарда. Недостатком позднего локального ишемического посткондиционирования является его инвазивность, что ограничивает возможность его широкого использования в клинической практике. Однако способов позднего дистантного посткондиционирования миокарда у крыс в эксперименте нами в уровне техники не обнаружено, в силу чего не может быть указан ближайший аналог предлагаемого изобретения. Задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, заключается в создании надежного способа моделирования позднего дистантного ишемического посткондиционирования миокарда у крысы в эксперименте, обеспечивающего статистически достоверное уменьшение размеров инфаркта миокарда, т.е. получение достоверного противоишемического эффекта этого феномена. Поставленная задача достигается тем, что в способе моделирования позднего дистантного ишемического посткондиционирования миокарда у крысы в эксперименте, согласно изобретению, при острой ишемии миокарда вскрывают грудную клетку в четвертом межреберном промежутке слева, осуществляют обратимую 30-минутную окклюзию передней нисходящей коронарной артерии посредством наложения лигатуры, после чего осуществляют реперфузию, удалив лигатуру с передней нисходящей коронарной артерии, и создают на 10-й мин реперфузии в течение 15 мин ишемию задних конечностей посредством наложения лигатур на обе бедренные артерии. Все приемы способа осуществляют в соответствии с международными требованиями к научным экспериментам с использованием животных Руководство по уходу и использованию лабораторных животных. Публикация Национального Института Здоровья.85-23, США. Способ осуществляют следующим образом. Крысе под общей анестезией катетеризируют правую общую сонную артерию (для инвазивного измерения артериального давления в ходе эксперимента), левую яремную вену (для внутривенного введения препаратов), фиксируют к конечностям игольчатые электроды для регистрации ЭКГ, после чего вскрывают грудную клетку в четвертом межреберном промежутке слева и выполняют обратимую 30-минутную окклюзию передней нисходящей коронарной артерии при помощи лигатуры. Окклюзия артерии подтверждается цианозом ишемизированной области, снижением АД (на 10-20 мм рт. ст.) и подъемом сегментана ЭКГ. После окончания 30-минутной окклюзии коронарный кровоток восстанавливается, что подтверждается исчезновением цианоза и снижением сегмента . Начиная с 10-й мин реперфузии, животное подвергают 15-минутной ишемии задних конечностей путем пережатия обеих бедренных артерий лигатурами, а затем лигатуры удаляют. Общая длительность реперфузии составляет 120 мин. В ходе всего эксперимента при помощи компьютерной программы 4 регистрируется ЭКГ, давление в трахее,показатели гемодинамики - системное АД, частота сердечных сокращений (ЧСС). Температуру тела животного измеряют в прямой кишке с помощью температурного датчика на протяжении всего эксперимента температура тела поддерживается в пределах 370,5 С. Время всего эксперимента составляет 150 мин. Критериями исключения животных из опыта являются ЧСС до начала эксперимента менее 300 ударов в минуту и АД ср. ниже 60 мм рт. ст. Гипотония (АД ср. ниже 60 мм рт. ст.), продолжающаяся в течение трех и более минут, является основанием для снятия животного с эксперимента. 2 18429 1 2014.08.30 В конце реперфузии производится повторная окклюзия ПНКА. Внутривенно в левую общую яремную вену вводят 0,5 мл 5 раствора синьки Эванса, определяя таким образом зону риска, как не окрашенную в синий цвет. Затем сердце извлекают и отделяют правый желудочек. После замораживания при температуре -20 С левый желудочек разрезают на 6 поперечных срезов. Срезы взвешивают при помощи торсионных весов, затем сканируют с обеих сторон. После этого срезы помещаются в раствор трифенилтетразолия хлорида на 15 мин при температуре 37. Жизнеспособный миокард (клетки, сохранившие дегидрогеназную активность) окрашивается в кирпично-красный цвет, некротизированная ткань остается белесой. После 24-часовой инкубации срезов в 10 растворе формалина срезы сканируются повторно. Зона риска (зона ишемии) и зона некроза ( зоны риска) определяются при помощи компьютерной планиметрии с использованием программы. Пример. 10 нелинейных наркотизированных крыс-самцов массой 250-300 г подвергались 30-минутной окклюзии передней нисходящей коронарной артерии, сопровождающейся 120-минутной реперфузией. С 10 по 25 мин реперфузии животным выполнялась двухсторонняя окклюзия бедренных артерий (группа позднего дистантного ишемического посткондиционирования). Животные контрольной группы - 10 крыс - подвергались только 30-минутной окклюзии передней нисходящей коронарной артерии, сопровождающейся 120-минутной реперфузией. В ходе экспериментов в контрольных точках - до начала острой ишемии миокарда, в начале коронарной окклюзии, в начале реперфузии, в 30, 60, 90 и 120 мин реперфузии - не отмечалось значимых различий показателей АД ср. и ЧСС в опытной и контрольной группах (0,05). Средняя зона риска в опытной и контрольной группах была сопоставима (0,05). Средняя зона некроза в контрольной группе животных составила 443 , в группе позднего дистантного ишемического посткондиционирования - 212(результаты представлены в формате среднеестандартная ошибка среднего). Таким образом, в опытной группе крыс отмечалось ограничение зоны некроза на 52 в сравнении с контрольной группой (0,001). Таким образом, заявляемый способ моделирования позднего дистантного ишемического посткондиционирования обеспечивает получение достоверного противоишемического эффекта и может быть использован для изучения воздействия лекарственных препаратов на развитие противоишемического эффекта этого феномена. Источники информации 1.,,.// . - 1986. - . 74. - . 5. - . 1124-1136. 2. Галагудза М.М. Роль активных форм кислорода в механизмах локальногоидистантногоишемического прекондиционирования миокарда // Регионарное кровобращение и микроциркуляция. - 2005. -4. - С. 72-78. 3., , ,-,-,-.//. - 2011. - . 124.- . 14. - . 2209-2215. 4., - ,,,,,, , - , - ,,, - .// . - 2011. -. 124. - . 12. . 1330-1336. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3