Способ оценки ДНК-повреждающего действия контаминанта окружающей среды

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ ДНК-ПОВРЕЖДАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ КОНТАМИНАНТА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Дудчик Наталья Владимировна Соколов Сергей Михайлович Мельникова Людмила Александровна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(56) ФОНШТЕЙН Л.М. и др. Методы первичного загрязнения генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Методическое указание. - М., 1985. С. 20-23.2105977 С 1, 1998.1784139 А 1, 1992. БУДКИНА Е.А. и др. Проблемы общественного здоровья и здравоохранения Республики Беларусь. Материалы Республиканской научно-практической конференции. - Минск, 2005. С. 332-333.(57) Способ оценки ДНК-повреждающего действия контаминанта окружающей среды,включающий сравнение способности к росту бактерийдикого и мутантного по генамиштаммов в жидкой питательной среде с внесенным контаминантом,отличающийся тем, что способность бактерий к росту оценивают импедиметрически по регистрации времени детекции роста , а оценку ДНК-повреждающего действия контаминанта осуществляют по показателю , который определяют по формуле 2/1,где 1 - время детекции ростадикого штамма 2 - время детекции ростамутантного штамма,причем при значении , равном 1,0, определяют отсутствие ДНК-повреждающего действия, при значенииот 1,1 до 1,4 - незначительную степень ДНК-повреждающего действия и при значении , равном 1,5 или более, - значительную степень ДНК-повреждающего действия контаминанта. Изобретение относится к разделу токсикологии и экологии. Известен способ оценки ДНК-повреждающего действия химических соединений, заключающийся в том, что учитывают рост суспензии бактерийдикого типа(штамм 1) и штамма, имеющего мутации в генахА иА, контролирующих различные этапы репарационных процессов в бактериальной клетке (штамм 2). При наличии ДНК-повреждающего эффекта исследуемого вещества при определенных его концентрациях рост мутантных бактерий не регистрируется, тогда как бактерии дикого типа при данных концентрациях агента проявляют нормальную способность к росту, при этом для 12527 1 2009.10.30 визуализации роста бактерий в питательную среду добавляют раствор индикатора бромкрезолового пурпурного и по изменению его окраски от голубого к желтому судят о росте бактерий и о наличии ДНК-повреждающего эффекта химического вещества 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявленному. Общими признаками для заявляемого способа и прототипа является то, что осуществляют параллельное внесение испытуемых образцов в питательную среду, содержащую суспензию штамма 1, и в такую же по составу среду, содержащую суспензию штамма 2, в той же концентрации, что и штамм 1, проводят их параллельное культивирование при оптимальной температуре, оценивают рост микроорганизмов с последующей обработкой полученных данных. Однако визуальный принцип детекции роста штаммов микроорганизмов, используемый в способе-прототипе, затрудняет анализ непрозрачных, пигментированных, негомогенных образцов, что часто приводит к невозможности провести анализ объектов окружающей среды, т.к. в этом случае маскируются изменения окраски применяемого индикатора. Кроме того, способ-прототип обладает низкой чувствительностью, что приводит к необходимости длительного, до 18 часов, времени проведения испытаний. Отсутствуют также количественные характеристики оценки интегральной токсичности объектов окружающей среды. Задачей заявленного изобретения является разработка высокочувствительного экспресс-способа оценки ДНК-повреждающего действия контаминантов окружающей среды,позволяющего тестировать непрозрачные, пигментированные, негомогенные образцы. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ оценки ДНК-повреждающего действия контаминанта окружающей среды, включающий сравнение способности к росту бактерийдикого и мутантного по генамА иА штаммов в жидкой питательной среде с внесенным контаминантом, при этом способность бактерий к росту оценивают импедиметрически по регистрации времени детекции роста , а оценку ДНК-повреждающего действия контаминанта осуществляют по показателю , который определяют по формуле 2/1 где 1 - время детекции ростадикого штамма 2 - время детекции ростамутантного штамма,причем при значении , равном 1,0, определяют отсутствие ДНК-повреждающего действия, при значенииот 1,1 до 1,4 - незначительную степень ДНК-повреждающего действия и при значении , равном 1,5 и более, - значительную степень ДНК-повреждающего действия контаминанта. Такой прием позволяет повысить чувствительность способа за счет того, что осуществляется импедиметрическая регистрация активной проводимости питательной среды, а это позволяет провести детекцию роста штамма в течение 3-6 часов и определить показатель времени детекции для штамма 1 и для штамма 2, расширить ассортимент исследуемых образцов, включая темноокрашенные, негомогенные, непрозрачные образцы, а также определить количественные характеристики ДНК-повреждающего действия контаминантов окружающей среды. Пример выполнения. Требуется определить степень ДНК-повреждающего действия трех объектов окружающей среды 1-й образец - химическое вещество 1 2-й образец - химическое вещество 2 3-й образец - объект окружающей среды. В качестве питательной среды при проведении исследования используют среду следующего состава (на 1000,0 мл дистиллированной воды), г Хлористый аммоний 1,0 Калий фосфорнокислый однозамещенный 3,0 2 12527 1 2009.10.30 Натрий фосфорнокислый двузамещенный 6,0 Натрий хлористый 0,5.7,2-7,4 Стерилизация 121 С в течение 30 мин. После стерилизации добавляют 10 мл 20 раствора глюкозы. Используют штаммыдикого типа, а также мутантные по репарации штаммы. Для приготовления ночных культур бактерий, для чего культуры с косяков мясопептонного агара петлей высевают в среду указанного состава. Перед опытом готовят инокулят, для чего ночную культуру разводят примерно в 100 раз средой, доводя титр бактерий до 5-7106 клеток/мл. Приготовленную среду разливают в ячейки анализатора, инокулируют штаммом дикого типа, а также мутантным по репарации штаммом, вносят исследуемые образцы или вытяжки из них и инкубируют в термоинкубаторе при 37 С в течение 3-10 ч. Получены следующие результаты (таблица). Номер об- Время детекции Время детекции разца штамма 1 штамма 2 1 1 - образец 1 не показал ДНКповреждающего действия Т 2 - ДНК-повреждающее действие образца 2 значительное 1,4 - ДНК-повреждающее действие образца 3 незначительное- показатель степени ДНКповреждающего действия образца Параллельно было проведено определение ДНК-повреждающего действия трех образцов по способу-прототипу. Получены следующие результаты. Для определения ДНКповреждающего действия образца 1 потребовалось 18 часов. ДНК-повреждающее действие образцов 2 и 3 не могло быть определено с помощью способа-прототипа, т.к. образцы представляли собой темноокрашенные негомогенные суспензии, что приводило к маскирующему эффекту работы индикатора. Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается в точной количественной оценке ДНК-повреждающего действия прозрачных и непрозрачных, пигментированных и непигментированных, гомогенных и ненегомогенных образцов, что дает возможность определить критерии и провести их количественную оценку. Способ позволяет сократить время определения с 18 до 3,0-6,0 часов, что дает основание рекомендовать его в качестве экспресс-метода, а также разработка количественных характеристик ДНК-повреждающего действия контаминантов. Источники информации 1. Фонштейн Л.М. и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем. Методические указания. - М.,1985. - С. 20-23. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3