Биологический микрочип для идентификации трансгенных последовательностей ДНК

Полезная модель относится К области генной инженерии растений, молекулярной биологии, биобезопасности, фитобиотехнологии И защите окружающей среды, в частности К устройству для выявления и идентификации типичных инсерций ДНК, используемых при генетической трансформации растений, в генетически модифицированном растительном материале и продуктах на его основе.Известен 1 биологический микрочип, представляющий собой микроматрицу с ячейками, одни из которых содержат иммобилизованные олигонуклеотиды-зонды, другие содержат олигонуклеотиды для контроля процедуры тестирования, а третьи содержат флуоресцентные красители для правильной ориентации биологического микрочипа при регистрации результатов, причем в качестве зондов использованы олигонуклеотиды, детектирующие 355-промотор, ген 3115, промотор поз, ген прг 11, терминатор ос 5.Недостатком данного микрочипа является малое число маркеров наличия трансгенного материала, т.к. значительная доля (до 30-50 ) трансгенных растений создается с применением иных промоторов и терминаторов. Кроме того, использование фрагментов ДНК фитопатогенов как маркеров может приводить к ложнопозитивным результатам в случае,если исходные растения были заражены соответствующими вирусами и/или бактериями, с другой стороны также намечается отказ от применения в практике генетической инженерии растений регуляторных фрагментов ДНК из патогенных микроорганизмов.Технический результат, на достижение которого направлена данная полезная мо дель, заключается в увеличении надежности определения наличия трансгенного материала в образце.Для достижения данного технического результата в микрочип включены олигонуклеотиды-зонды, детектирующие помимо 355 -промотора, гена 3115, промотора поз, гена прг 11 и терминатора ос 5, также маркеры 1 есйп, 2 е 1 п, Ьаг, сгу 1 АЬ, ЕР 5 Р 5, К и - К. Присутствие трансгенных последовательностей определяют с помощью гибридизации на 10 специально подобранных олигонуклеотидах-зондах, иммобилизованных на изготовленных для этой цели биологических микрочипах.Предложенную полезную модель отличает наличие 10 новых олигонуклеотидовзондов. Благодаря наличию этих зондов многократно повыщается вероятность того, что трансгенная ДНК в образце будет выявлена, причем выявление трансгенного материала осуществляется в одном анализе.Для обнаружения генетических детерминант трансгенности в растительном материале и продуктах на его основе и одновременного определения вида трансгенного и нетрансгенного растения (соя, кукуруза, картофель) с использованием олигонуклеотидного биологического микрочипа выполняют мультиплексную ПЦР с использованием специфичных праймеров, комплементарных последовательностям исследуемых генов и регуляторных элементов, с последующей гибридизацией этих фрагментов на биологическом микрочипе, содержащем оригинальный набор дифференцирующих олигонуклеотидов.Применение указанных праймеров позволяет амплифицировать фрагменты небольшого размера - около 100 п. о. - трансгенной ДНК, если таковая присутствует в геноме испь 1 туемого источника. Получаемые одноцепочечные флуоресцентно меченые фрагменты ДНК способны вступать в специфическое гибридизационное взаимодействие с олигонуклеотидами, иммобилизованными на биологическом микрочипе. Известный порядок расположения олигонуклеотидов на биологическом микрочипе дает возможность установить,какие именно маркерные гены и регуляторные элементы входят в состав трансгенной и нетрансгенной ДНК. Разработанные условия гибридизации обеспечивают высокую степень дифференциации между теми ячейками биологического микрочипа, где произощла гибридизация, и теми, где специфических гибридов не возникло.Дизайн праймеров и олигонуклеотидов обеспечивает абсолютную специфичность их взаимодействия с искомыми трансгенными и нетрансгенными последовательностямиДНК. При этом иммобилизованный олигонуклеотид имеет иную последовательность, чем праймеры для амплификации, что исключает возможность гибридизации в ячейке какойлибо случайно амплифицированной флуоресцентно меченой ДНК. Визуальная регистрация результатов гибридизации дополнена количественной регистрацией на основе специально приспособленной компьютерной программы, позволяющей точно определить степень превышения сигнала над уровнем фона.Набор (измерительный комплекс), содержащий данный биологический микрочип и аппаратно-программный комплекс для анализа флуоресцентных изображений, получаемых на биологических микрочипах, позволяет преобразовать флуоресценцию ячеек биологического микрочипа в цифровой формат, количественно определять флуоресцентный сигнал в любой точке биологического микрочипа, определять отношение флуоресцентного сигнала к фону в каждой ячейке биологического микрочипа и соответственно соотношение флуоресцентных сигналов в ячейках. В качестве такого аппаратно-программного комплекса может использоваться комплекс Евробио-ВТО.Принципиальная схема обнаружения фрагментов трансгенной ДНК.К выделенной из образца ДНК добавляют несколько пар праймеров, специфичных к консервативным областям маркерных генов и регуляторных участков ДНК, обычно используемых при трансформации растений. Проводят реакцию мультиплексной ПЦР в вь 1 бранном режиме. Накопление флуоресцентно меченых одноцепочечных ПЦР-продуктов достигается за счет избытка в каждой из пар одного из праймеров, содержащего на 5 конце флуоресцентную метку. Полученные продукты ПЦР гибридизуют на биологическом микрочипе с иммобилизованными зондами, комплементарными последовательностям фрагментов детектируемых генов и/или регуляторных элементов.Биологический микрочип представляет собой массив микроячеек гидрогеля, закрепленных на поверхности стекла. В ячейках иммобилизован набор олигонуклеотидов, гомологичных фрагментам трансгенных последовательностей ДНК. Каждая из ячеек содержит индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид, причем иммобилизованнь 1 е олигонуклеотиды имеют иную последовательность, чем праймеры на те же гены. Помимо этого, на биологическом микрочипе расположены ячейки с неспецифическими олигонуклеотидами, выполняющие роль отрицательного контроля гибридизации, а также ячейки, маркированные флуоресцентным красителем и предназначенные для правильной ориентации биологического микрочипа. Позиция на биологическом микрочипе всех ячеек,как опытных, так и контрольных, строго детерминирована. Поверхность биологического микрочипа, на которой расположены микроячейки, закрыта пластиковьм корпусом гибридизационной камеры, которая вместе со стеклом образует замкнутое пространство, служащее для проведения гибридизации. Корпус камеры снабжен отогнутым краем для удаления камеры после проведения гибридизации и двумя отверстиями для внесения образца, которые герметизируются при помощи липкой ленты.Изучаемые фрагменты ДНК образуют совершенные стабильные гибридизационные дуплексь 1 только с соответствующими (полностью комплементарными) олигонуклеотидами.Со всеми остальными олигонуклеотидами изучаемые фрагменты ДНК могут формировать лишь нестабильные несовершенные дуплексы. Дифференциацию совершенных и несовершенных дуплексов выполняют путем сравнения интенсивностей флуоресценции ячеек, в которых образовались дуплексы. Интенсивность сигнала в ячейке, в которой образовался совершенный гибридизационный дуплекс, во много раз выше, чем в ячейке, где мог формироваться лишь несовершенный дуплекс. При этом детерминированный порядок расположения олигонуклеотидов в ячейках биологического микрочипа дает возможность установить, какие именно маркерные гены и регуляторные элементы входят в состав трансгенной ДНК. Результаты гибридизации могут быть интерпретированы однозначно как визуально, так и с помощью программы Био-1, входящей в состав аппаратно ВУ 546711 2009.08.30программного комплекса Евробио-ВТО для анализа флуоресцентных Изображений, получаемых на биологических микрочипах.Авторами предложен набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в таблице ниже, используемых в качестве праймеров для ПЦР, продукт которой используется при идентификации трансгенных последовательностей ДНК.Предложенной полезной моделью является биологический микрочип, представляющий собой микроматрицу с ячейками, одни из которых содержат иммобилизованные олигонуклеотидь 1-зондь 1, другие - олигонуклеотиды для контроля на процедуру тестирования,третьи - видовые участки генов нетрансгенных растений, четвертые - флуоресцентные красители для правильной ориентации биологического микрочипа при регистрации результатов, отличающийся тем, что в качестве зондов использованы олигонуклеотиды,приведенные в представленной ниже таблице, комплементарные фрагментам типичных маркерных и вспомогательных последовательностей ДНК, используемых при генетической трансформации растений.Идентификация трансгенных последовательностей ДНК в растительном материале и продуктах на основе такого материала включает стадии, на которыха) ПЦР проводят на препарате ДНК в виде мультиплексной реакции с получением флуоресцентно меченого продукта, при этом используют специфические пары праймеров,один из которых флуоресцентно мечен и присутствует в избытке по отношению ко второму немеченому праймеруб) результаты ПЦР анализируют с помощью гибридизации на биологическом микрочипе ив) результаты анализа регистрируют с помощью аппаратно-программного комплекса,позволяющего отображать флуоресценцию ячеек биологического микрочипа на экране компьютера, количественно определять флуоресцентный сигнал в любой точке биологического микрочипа, определять отнощение флуоресцентного сигнала к фону в каждой ячейке биологического микрочипа и соответственно соотношение флуоресцентных сигналов в ячейках.Регистрация результатов гибридизации на стадии (в) может быть выполнена с помощью аппаратно-программного комплекса Евробио-ВТО, который позволяет преобразовать полученные результаты в цифровом формате и производить последующую математическую обработку.Кроме того, при необходимости усиления гибридизационного сигнала реакцию ПЦР на стадии (а) можно проводить в две стадии, сначала как симметричную мультиплексную ПЦР, а затем как асимметричную мультиплексную ПЦР с включением флуоресцентно меченых праймеров.Предложенный биочип позволяет определить видовые гены растений и их трансгенные аналоги и увеличивает количество определяемых видов ДНК. Предложенный биочип позволяет существенно увеличить число детектируемых мищеней. Предложенные в качестве праймеров олигонуклеотиды позволяют анализировать существенно более деградированную ДНК. Регистрация результатов с помощью измерительного комплекса,содержащего предложенный биологический микрочип и аппаратно-программный комплекс Евробио-ВТО для преобразования полученных результатов в цифровом формате и произведения последующей математической обработки, позволяет установить уровень интенсивности флуоресцентного сигнала в каждой ячейке и однозначно интерпретировать результаты гибридизации.На фиг. 1 представлена схема биологического микрочипа для идентификации трансгенных растительных объектов.Фиг. 2 - результат гибридизации на биологическом микрочипе. Обнаружение маркерных генов пр и 3115, промоторов поз и 355 в образце ДНК из картофеля сорта Везйгее.Фиг. 3 - результат гибридизации на биологическом микрочипе. Обнаружение маркерного гена прг, промотора поз, терминатора ос 5 в образце ДНК из трансгенного табака.Фиг. 4 - результат гибридизации на биологическом микрочипе. Обнаружение маркерного гена пр в образце ДНК из продукта питания.Фиг. 5 - результат гибридизации на биологическом микрочипе образца ДНК из нетрансформированного растения.Непосредственно перед испытанием готовят смесь в микропробирках для проведения мультиплексной ПЦР, в состав которой входят реакционный буфер для ПЦР смесь дезоксинуклеотид-трифосфатов в концентрации 200 мкМ каждого несколько пар праймеров в количестве 5-10 пмолей для флуоресцентно меченых праймеров и 0,5-2 пмолей для немеченых праймеров 12,5 единиц активности термостабильной Тач ДНК-полимеразь 1, а также испь 1 туемая суммарная ДНК в количестве 1-3 мкг на пробу. Состав праймеров представлен в таблице ниже. Микропробирки помещают в программируемый термостаттермоциклер и проводят реакцию ПЦР в следующем режиме денатурация при 95 С - 30 сДля проведения гибридизации аликвоту образца, полученного в результате ПЦР, смещивают с буфером гибридизации с доведением компонентов последнего до следующих концентраций 6115 СН - 1 М, НЕРЕ 5, рН 7,5-50 мМ, ЕВТА - 5 мМ. Полученную смесь помещают на биологический микрочип, герметично закрывают гибридизационной камерой и проводят гибридизацию при 37 С в течение 14-18 ч. После гибридизации биологический микрочип трижды ополаскивают дистиллированной водой при 25 С и высушивают.Регистрацию гибридизационной картины осуществляют, используя аппаратнопрограммный комплекс Евробио-ВТО с программой Био-1.Изготовление олигонуклеотидного биологического микрочипа для обнаружения маркерных генов и регуляторных участков ДНК, используемых при трансформации растений.Олигонуклеотиды синтезируют на автоматическом синтезаторе (типа 394 ВЫА/КЫА 5 уш 11 е 512 ег. Арр 11 е 1 Вйозузгешз, США) и содержат спейсер со свободной аминогруппой 3-Аш 1 по-Мо 11 йег С 7 СРС 500 (61 еп Кезеагсп, США) для последующей иммобилизации в гель или 5-Аш 1 по-Мо 11 йег С 6 (61 еп Кезеагсп, США) для введения флуоресцентной метки. Введение флуоресцентной метки Су-5 (Биочип-ИМБ, Россия) осуществляют в соответствии с рекомендациями производителя.Гелевые ячейки биологического микрочипа наносят на стеклянную подложку в виде капель с максимальной аккуратностью и воспроизводимостью с помощью роботов 2. Каждая сформированная ячейка представляет собой полусферу диаметром 200-250 мкм и периодом около 300 мкм и содержит иммобилизованный олигонуклеотид-зонд, комплементарнь 1 й последовательности гена или регуляторного элемента (промотора или терминатора), используемых при генетической модификации растений.Биологический микрочип содержит десять иммобилизованных олигонуклеотидовзондов, список которых представлен в таблице ниже, три маркерные точки для правильного позиционирования (захвата изображения), выполняемого программой Био-1, и три ячейки, содержащие неспецифичные к исследуемым геномам олигонуклеотиды, вь 1 полняющие роль отрицательного контроля. Расположение иммобилизованных на микрочипе олигонуклеотидов показано на фиг. 1. Последовательности иммобилизованных олигонуклеотидов приведены в таблице ниже.Регистрацию гибридизационной картины осуществляют, используя аппаратнопрограммный комплекс Евробио-ВТО.Интерпретация результатов гибридизации осуществляется путем сравнения интенсивности флуоресцентного сигнала в ячейках 3551, 31151, по 51, прг 1, ос 51, Ьаг, сгу 1, 1 ес 1 йп, 2 е 1 п,ЕР 5 Р 5 с интенсивностью сигнала в ячейках МС (фиг. 1), служащих отрицательным кон