Способ получения биопрепарата для защиты овощных и зеленных культур от болезней в условиях малообъемной гидропоники

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОВОЩНЫХ И ЗЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР ОТ БОЛЕЗНЕЙ В УСЛОВИЯХ МАЛООБЪЕМНОЙ ГИДРОПОНИКИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Коломиец Эмилия Ивановна Сверчкова Наталья Владимировна Купцов Владислав Николаевич Мандрик-Литвинкович Марина Николаевна Евсегнеева Наталья Викторовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56)20100485, 2010.12761 1, 2009. ВОЙТКА Д.В. и др. Интегрированная защита растений. Стратегия и тактика Материалы Международной научнопрактической конференции, 2011. С. 180-184.102199558 , 2011.2092559 1, 1997.98104578 , 1999.20000045843 , 2000. ФЕКЛИСТОВА И.Н. и др. Земляробстваахова раслн. - 2006. -2. С. 42-44.(57) Способ получения биопрепарата для защиты овощных и зеленных культур от болезней в условиях малообъемной гидропоники, при котором суточный посевной материал штамма бактерийБИМ В-446 Д подвергают последовательной термической обработке при температурах 37, 42 и 50 С в течение 10 мин, вносят в жидкую питательную среду и осуществляют глубинное культивирование в течение 24 ч при температуре 282 С, интенсивности аэрации 0,6-0,8 л воздуха/л средымин и скорости вращения мешалки 10020 об/мин до достижения максимального титра клеток. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству биологических препаратов на основе живых культур микроорганизмов, и рекомендуется к применению в сельском хозяйстве для защиты овощных и зеленных культур от болезней в условиях малообъемной гидропоники. Важная роль в рациональном питании отводится овощным и зеленным культурам, содержащим широкий спектр витаминов, минеральных солей, органических кислот, воздействующих на процессы жизнедеятельности человека, в том числе на защитные силы организма. Увеличение производства тепличных культур, повышение их урожайности,улучшение качества продукции и снижение затрат труда зависит от применения новых прогрессивных энергосберегающих технологий и создания современной научно-техни 17575 1 2013.10.30 ческой базы. Одно из таких направлений - выращивание овощных и зеленных культур способом малообъемной гидропоники. Вместе с тем в закрытом грунте существует ряд проблем, связанных с болезнями выращиваемых культур, которые являются серьезным препятствием получения высоких урожаев и значительно снижают качество выпускаемой продукции. Основными возбудителями болезней огурца и зеленных культур являются грибы рода , , , , , . В большинстве случаев для защиты растений и обеззараживания питательного раствора для полива в гидропонных системах используются химические пестициды либо дорогостоящие методы стерилизации, такие как пастеризация, ультрафильтрация и другие. На современном этапе развития овощеводства испытывается потребность в разработке и внедрении экологически безопасных ресурсосберегающих технологий, основанных на использовании бактерий-антагонистов для контроля фитопатогенов. Известен препарат на основе бактерий., активный в отношении таких болезней, как пероноспороз, антракноз, черная ножка, серая и белая гниль, фузариоз. Эффективность препарата в защищенном грунте против пероноспороза, серой и белой гнилей на огурцах составляет 85-90 . Однако способ получения препарата имеет достаточно сложную, энергоемкую схему, включающую культивирование штамма в жидкой среде,адсорбцию на цеолите и высушивание с добавлением декстрина 1. Известен способ получения препарата для предпосевной обработки семян овощных культур на основе штамма бактерийЧ-13, обладающего четко выраженным антибиотическим действием относительно многих фитопатогенных грибов, обитающих в почве или на поверхности семян моркови, свеклы, томатов, салата, петрушки,сельдерея, капусты, редиса, огурцов, кабачков, репы, укропа, кукурузы, гороха, фасоли. Однако эффективность препарата не исследовалась по отношению к патогенам овощных и зеленных культур в условиях гидропонной системы, а способ получения препарата, включающий смешивание эмульсии поливинилацетата 202 , культуральной жидкости 203 , водного разбавителя 202 и наполнителя (стерильный мел или доломит), годится только для предпосевной обработки семян 2. Известен способ получения препарата Экофит для защиты растений от фитопатогенов и повышения урожая путем раздельного культивирования штаммов бактерий,,,, ,,,,,.,. Недостатком данного способа является сложный и длительный процесс получения препарата, включающий раздельное культивирование 12 штаммов на скошенном агаре с последующим смывом культур стерильным физиологическим раствором, смешивание и культивирование культур до достижения титра 500 млн. кл/мл с дальнейшим внесением маточной культуры в производственную питательную среду и последующей ферментацией 3. Известно о способе выращивания растений и их защите от болезней в условиях гидропонной системы непроточного типа путем введения в питательный раствор препарата, содержащего клетки бактерий-антагонистов, таких как 330 ,-331 ,-329 ,-328,ВКПМ -4117. Однако недостатком данного изобретения является его использование только для предотвращения распространения патогенного грибав процессе выращивания черенков элитной гвоздики, а раздельное культивирование антагонистов усложняет процесс получения препарата 4. Известен препарат Фитопротектин на основе штаммаБИМ В-334 Д с широким спектром антибактериального и антифунгального действия, используемый для защиты овощных культур (моркови, капусты, картофеля, огурца, томата) от болезней в условиях открытого и защищенного грунта 5. Способ получения препарата заключается 2 17575 1 2013.10.30 в культивировании штамма-продуцента на недорогой среде с мелассой, однако время культивирования составляет 36-48 ч, а фитозащитный эффект исследовался только по отношению к корневым гнилям, аскохитозу и оливковой пятнистости огурца 6. Биопрепараты на основе бактерий .обладают высокой биологической эффективностью в отношении возбудителей болезней сельскохозяйственных культур, в связи с этим в качестве прототипа выбран препарат на основе штаммов бактерий . . Наиболее близким к заявляемому является способ получения препарата Бинорам на основе комплекса штаммов бактерий. 7 Г, 7 Г 2 К, 17-2 7, взятых в соотношении 121-212, гуматов 5,0-10,0 г/л и микроэлементов 0,02-0,05 г/л 8, 9. Данный препарат обеспечивает защиту растений от фитопатогенов рода , , и повышает урожайность сельскохозяйственных культур. Недостатком препарата является дорогостоящая среда культивирования -бульон и трудоемкий способ получения, заключающийся в раздельном культивировании штаммов и последующем (через 12-16 ч) их внесением в раствор гуматов и микроэлементов. Отсутствуют данные о антимикробной активности в отношении таких патогенов овощных и зеленных культур, как , , . А также технология применения препарата не учитывает особенности гидропонного способа выращивания растений, не изучены процессы приживаемости штаммов-продуцентов на минеральной вате и в питательных растворах гидропонных систем. Задачей изобретения является создание нового высокотехнологичного способа получения биологического препарата, эффективного в отношении грибных (, , , ) патогенов овощных и зеленных культур в условиях гидропонной системы и обладающего ростстимулирующими свойствами. Поставленная задача достигается путем использования в качестве технологического этапа создания препарата физиологической активации штамма-продуцента с помощью стрессового воздействия (теплового шока) на посевной материал, позволяющего повысить эффективность действия препарата использования в качестве основы препарата штамма-антагониста .БИМ В 446, обладающего широким спектром антимикробной активности к фитопатогенным грибам и бактериям различных сельскохозяйственных культур 10 выращивания бактерий на экономически рентабельной среде Мейнелла с мелассой в качестве источника углеродного питания, обеспечивающей максимальный выход биомассы и поддерживающей высокую активность культуры применения эффективной технологии культивирования, включающей экспериментально подобранные параметры интенсивность аэрации 0,6-0,8 л воздуха/л средымин,температуру 282 С, скорость вращения мешалки 10020 об/мин - и обеспечивающей получение полноценного продукта за достаточно короткое время культивирования - 24 ч. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Для получения биопрепарата культуру .БИМ В-446 выращивали на оптимизированной среде следующего состава (г/л) меласса - 30,0 24 - 7,0 24 - 3,0(4)24 - 1,5 4 - 0,1 -цитрат - 0,5 кукурузный экстракт - 2,5 вода водопроводная - 1 л, исх. - 7,0-7,2 - в ферментере-120 компании(Южная Корея) емкостью 120 л. Для инокуляции среды использовался суточный посевной материал в количестве 7,0 от объема питательной среды. Культивирование осуществлялось с соблюдением следующих параметров скорость вращения мешалки - 10020 об/мин интенсивность аэрации - 0,6-0,8 л воздуха/л средымин температура выращивания - (282) С. 3 17575 1 2013.10.30 Предлагаемый способ периодического культивирования позволяет к 24 ч ферментации получить жидкий препарат в виде суспензии желто-коричневого цвета со слабым, специфическим для данного продукта запахом 7,6 титром 2,61010 /мл и высокой антимикробной активностью в отношении грибных и бактериальных патогенов овощных и зеленных культур (табл. 1). Таблица 1 Антимикробная активность бактерий-антагонистов в отношении грибных и бактериальных патогенов овощных и зеленных культур Зоны задержки роста фитопатогенов, мм Штаммы В.БИМ 17-2 В-334 (аналог 7 Г 2 К штаммов антагонистов БИМ В-446 Фитопротектин)( . для прототипа) нет нет нет нет В.17,51,3 16,51,2 данных данных данных данных нет нет нет нет дан 28,00,5 27,00,5. данных данных данных ных нет нет нет нет. 15,00,2 12,70,2 данных данных данных данных бактериальные патогены нет нет нет нет. 30,00,7 нет данных данных данных данных данных нет нет нет нет. 26,50,6 нет данных данных данных данных данных Примечание -- антимикробная активность основы заявляемого биопрепарата штамма .БИМ В-446 и аналога В.БИМ В-334 определялась методом отсроченного антагонизма 11 на искусственной питательной среде. Согласно полученным данным, отличительными особенностями препарата на основе штамма .БИМ В-446 являются активный рост в опытно-промышленных условиях на простой по составу и дешевой питательной среде и высокая активность в отношении наиболее распространенных грибных и бактериальных патогенов овощных и зеленных культур, выращиваемых в условиях малообъемной гидропоники. Указанные свойства выгодно отличают заявляемый препарат от прототипа по технологичности способа получения и широте спектра подавляемых фитопатогенов. Пример 2. Исследовано влияние стресс-фактора теплового шока на эффективность действия препарата на основе штамма .БИМ В-446. Для этого в лабораторных условиях колбы с бактериальной культурой помещали на терморегулируемую качалку, выдерживали в течение 10 мин при температурах 37, 42, 47 С, а также подвергали последовательным трехкратным температурным обработкам при 37-42-47 С и 37-42-50 С. В качестве контроля использовали бактериальную культуру, полученную из термически необработанного посевного материала. Прогретую при различных температурных режимах жидкую культуру бактерий использовали в качестве посевного материала для инокуляции 4 17575 1 2013.10.30 свежей питательной среды. Учет антагонистической активности проводили через 48, 72,96 ч культивирования при 28 С. Максимальная продукция антибактериальных и антифунгальных метаболитов достигалась при использовании трехкратной термической обработки 37-42-50 С посевного материала .БИМ В-446. При этом наблюдалось увеличение зон задержки роста бактериального патогена .649 на 53-77(табл. 2) и грибного патогена.259 на 25-48(табл. 3). При исследовании влияния теплового шока на других культурах значительного увеличения антимикробной активности не выявлено. Таблица 2 Антибактериальная активность .БИМ В-446,выращенной после тепловой обработки Возраст культуры Диаметр зоны задержки роста . ,Температура теплового шока 37 С 42 С 47 С 37-42-47 С 37-42-50 С 92 100 138 169 177 92 140 146 123 153 Таблица 3 Антифунгальная активность .БИМ В-446,выращенной после тепловой обработки Возраст культуры Диаметр зоны задержки роста .259,Температура теплового шока 37 С 42 С 47 С 37-42-47 С 37-42-50 С 115 100 115 115 125 131 112 112 125 148 Таким образом, полученные в лабораторных условиях результаты свидетельствуют о целесообразности использования трехкратной термической обработки культуры (37-4250 С) .БИМ В-446 как технологичного этапа получения биологического пестицида, позволяющего повысить эффективность действия препарата на 25-48 и 53-77 в отношении грибных и бактериальных патогенов растений. Пример 3. Разработанный способ физиологической активации штамма-продуцента был масштабирован в опытно-промышленных условиях. Апробация способа проводилась в Биотехнологическом центре Института микробиологии НАН Беларуси в ферментере-120 (Южная Корея) емкостью 120 л. Культивирование осуществлялось с соблюдением следующих параметров скорость вращения мешалки - 10020 об/мин интенсивность аэрации - 0,6-0,8 л воздуха/л средымин температура выращивания - (282) С. Для инокуляции среды использовался суточный посевной материал бактерий .БИМ В-446, последовательно прогретый в течении 10 мин при 37, 42 и 50 С в количестве 7,0 от общего объема питательной среды. В качестве контроля для засева использовали посевной материал без температурной обработки. Изучение процесса глубинного культивирования бактерий-продуцентов выявило положительное влияние стрессового воздействия как на ростовые характеристики культуры,так и на проявление ею антимикробной активности. Отмечено увеличение титра клеток.БИМ В-446 в 3,3 раза к 24 ч культивирования по сравнению с контрольным 5 17575 1 2013.10.30 вариантом (с 2,7109 до 9,0109). Стрессовое воздействие позволило повысить антимикробную активность бактерий .БИМ В-446 в отношении возбудителей фузариоза(. ) и антракноза ( ) огурца на 10-13(табл. 4). Таблица 4 Антагонистическая активность бактерий .БИМ В-446 в отношении грибов .и С.в процессе глубинного культивирования Время культивирования Культура после термической обработки диаметр зоны задержки роста Следует отметить, что наибольшие различия в антагонистической активности бактерий .БИМ В-446, подвергнутых стрессовому воздействию, наблюдаются в экспоненциальной фазе роста, соответствующей максимальной скорости роста и быстрому накоплению антимикробных метаболитов. Так, при получении в опытно-промышленных условиях биопрепарата с помощью использования теплового шока эффективность антимикробного действия увеличилась на 10-13 по сравнению с контролем без температурной обработки и на 21 по сравнению с прототипом. Пример 4. Оценка биологической эффективности биопестицида в защите огурца и зеленных культур от фитопатогенов в условиях малообъемной гидропоники. В условиях УП Минский парниково-тепличный комбинат совместно с сотрудниками РУП Институт защиты растений проведена производственная проверка биологической эффективности биопрепарата в защите от болезней при малообъемной технологии выращивания на минеральной вате. Схема применения препарата предполагала четырехкратное профилактическое внесение препарата способом полива под корень первое - в рассадный период в фазе 2-х настоящих листьев, второе - через 3-4 дня после высадки растений на постоянное место в теплице, последующие - с интервалом 7 дней. Эталонным вариантом служило применение аналога препарата Фитопротектин, Ж. 5, 6 (2 -ая рабочая жидкость) по идентичной схеме. Контролем служили защитные мероприятия, проводимые в хозяйстве. Защитное действие препарата оценивали на светокультуре огурца Церез 1. С учетом фитосанитарной ситуации помимо профилактических внесений препарат применяли трехкратно путем опрыскивания 2 -ой р. ж. с интервалом 7 дней с момента появления первых признаков поражения растений стеблевой формой серой гнили (.). Результаты свидетельствуют о значительной эффективности препарата в сдерживании развития и распространения болезни биологическая эффективность составляла 52,9 на протяжении двух недель (табл. 5). Эффективность биопрепарата по отношению к стеблевой форме серой гнили составила 62,1 . Средний балл поражения растений по сравнению с контрольным вариантом был ниже на 62 , распространенность болезни - на 62,5 , развитие - на 30,7 . Биологическая эффективность при использовании аналога Фитопротектина за весь период исследования не превысила 15,8 . 6 17575 1 2013.10.30 Таблица 5 Эффективность применения биопрепарата на основе штамма .БИМ В-446 и аналога Фитопротектина против серой гнили огурца Вариант опыта Биопрепарат на основе штамма Р.БИМ В-446 Фитопротектин, Ж. Контроль 03 Распростра- Развитие Количество поненность бо- болезни, гибших растелезни,Биопрепарат на основе штамма Р. - 0,75 37,5 18,8 13 62,1 БИМ В-446 Фитопротектин, Ж. 1,67 68,8 41,7 17 15,8 Контроль 1,98 100,0 49,5 8 05 0,86 Исследования по оценке защитного действия биопрепарата были продолжены на культуре огурца зимне-весеннего оборота (Яни 1). Согласно результатам анализа биометрических показателей растений огурца в начальный период роста высота растений в варианте с применением биопрепарата по сравнению с контрольным была меньше (табл. 6). Несмотря на это, растения, обработанные биопрепаратом, в целом имели хорошо выраженный продуктивный морфотип большие размеры листовой пластинки, интенсивную зеленую окраску, выполненные междоузлия. Растения, обработанные Фитопротектином,уступали по показателям высоты растений и количества образовавшихся плодов препарату на основе штамма .БИМ В-446. Таблица 6 Биометрические показатели растений огурца Время учета Вариант Биопрепарат на основе штамма .БИМ В-446 Фитопротектин, Ж. Контроль на начало через 7 дней через 14 дней через 30 дней опыта Высота Высота растений,Высота Высота растений,растений,см/ количество растений,см/ количество см цветков, шт. см плодов, шт. 18,3 Учет урожайности показал увеличение общей массы плодов, собранных с учетных делянок, равных по площади, на 2,5-5,4 в варианте с применением биопрепарата по сравнению с контрольным. Средний балл поражения растений огурца корневой гнилью в конце вегетации в контрольном варианте составил 1,11, распространенность болезни - 71,9 , развитие болезни 7 17575 1 2013.10.30 29,9 , в варианте с применением биопрепарата (2 -ная рабочая жидкость) - 0,59, 39,1,16,8 , Фитопротектина, Ж., (2 -ая рабочая жидкость) - 0,34, 29,7, 9,1 соответственно. Прибавка урожая при применении биопрепарата в период массового плодоношения составила 10,3 , в конце вегетации - 9,2 , в варианте с применением Фитопротектина, Ж. - 8,4 и 24,2 соответственно. Полевые испытания по защитному и ростостимулирующему действию препарата на зеленных культурах (укроп сорта, петрушка сорта ) при выращивании способом проточной гидропоники проводили в УП Минский парниково-тепличный комбинат совместно с сотрудниками РУП Институт защиты растений. В период вегетации проводили биометрические исследования растений и оценивали пораженность корневой гнилью. В сериях отмечено положительное влияние препарата на высоту растений и длину корня. Так, высота растений петрушки в варианте с применением биопрепарата увеличивалась на 4,5 , длина корня - на 5,2 , укропа - на 11 и на 15,3 соответственно (табл. 7). Биологическая эффективность препарата на основе штамма .БИМ В-446 против корневой гнили составила на петрушке 26,9(23-е сутки), на укропе 69,8(20-е сутки). Биологическая эффективность Фитопротектина на укропе соответствовала 53,5 . Исходя из полученных данных, эффективность действия биопрепарата по отношению к патогенам огурца и зеленных культур в исследуемых условиях выше аналога Фитопротектина. Таким образом, использование биопрепарата на основе штамма .БИМ В-446 для обеззараживания вегетирующих растений, питательного раствора и субстратов при выращивании овощных и зеленных культур является перспективным и экологически безопасным методом борьбы с фитопатогенами в условиях малообъемной гидропоники. Таблица 7 Влияние биопрепарата на основе штамма .БИМ В-446 на рост,развитие и пораженность корневой гнилью растений укропа и петрушки,тивмм щий лист тва,жения болезни ность Укроп Биопрепарат на основе штаммаБИМ В-446 Биопрепарат на основе штамма .БИМ В-446 17575 1 2013.10.30 Таким образом, предлагаемое техническое решение позволяет получить следующие преимущества по сравнению с прототипом 1) разработан высокотехнологичный способ получения биологического препарата за счет удешевления питательной среды 2) повышена антимикробная активность биопрепарата в опытно-промышленных условиях за счет использования посевного материала, предварительно подвергнутого стрессовому воздействию (тепловому шоку) на 10-13 по сравнению с контролем и на 21 по сравнению с прототипом 3) в качестве основы препарата использован высокоэффективный штамм .БИМ В-446 с широким спектром антимикробной активности к фитопатогенным грибам и бактериям различных сельскохозяйственных культур Источники информации 1. Патент 2069953, МПК 01 63/00, 1996. 2. Патент 2130261 МПК 01 1/06, 1999. 3. Патент 2170510, МПК 01 63/00,12 39/00, 1999. 4. Патент 2019958, МПК 01 31/00, 1994. 5. Патент 8396, МПК 01 63/00,12 1/20, 2005 (аналог). 6. Попов Ф.А., Прищепа И.А., Коломиец Э.И., Т.В. Романовская. Биологический контроль болезней огурца и томата в защищенном грунте при применении Фитопротектина // Информационный бюллетень. -41 МОББ/ВПРС. - 2010. - С. 150-157. 7. Патент 2130265, МПК 601 63/00,01 1/00, 1999 (прототип). 8. Патент 2130264, МПК 01 63/00, 1999 (прототип). 9. Патент 2130263, МПК 601 63/00,12 1/20, 1999 (прототип). 10. Патент 12761, МПК 01 63/00, 2009. 11. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. - М. Высшая школа, 1986. - 448 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9