Биоспецифический иммуносорбент для селективной элиминации аутоантител к тироидной пероксидазе человека из плазмы или сыворотки крови человека (варианты)

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ БИОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ИММУНОСОРБЕНТ ДЛЯ СЕЛЕКТИВНОЙ ЭЛИМИНАЦИИ АУТОАНТИТЕЛ К ТИРОИДНОЙ ПЕРОКСИДАЗЕ ЧЕЛОВЕКА ИЗ ПЛАЗМЫ ИЛИ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Грибовская Ольга Викторовна Шутова Ирина Владимировна Цыганова Олеся Васильевна Макаревич Денис Александрович Мартинович Вера Павловна Свиридов Олег Васильевич Голубович Владимир Петрович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Биоспецифический иммуносорбент для селективной элиминации аутоантител к тироидной пероксидазе человека из плазмы или сыворотки крови человека, содержащий в качестве матрицы -сефарозу, а в качестве биоселективного лиганда - тетрапептид и имеющий следующую химическую формулу где- число звеньев цепи -сефарозы между центрами иммобилизации тетрапептидных лигандов, которое имеет значение от 15 до 35. 2. Биоспецифический иммуносорбент для селективной элиминации аутоантител к тироидной пероксидазе человека из плазмы или сыворотки крови человека, содержащий в качестве матрицы полиакриламидный гель, а в качестве биоселективного лиганда - тетрапептид и имеющий следующую химическую формулу где- число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации тетрапептидных лигандов, которое имеет значение от 1 до 70- число участков цепи с лигандом, имеющее значение от 50 до 10000. Изобретение относится к области биоорганической химии, биохимии и медицины, а именно к биоспецифическим иммуносорбентам, которые селективно элиминируют специфические аутоантитела к тиропероксидазе человека из плазмы или сыворотки крови больных с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы и могут найти применение в медицине и экспериментальной биохимии. Аутоиммунные заболевания щитовидной железы (АЗЩЖ) являются наиболее распространенными органоспецифическими аутоиммунными заболеваниями. Установлено, что АЗЩЖ развиваются в результате реакции иммунной системы на собственные белки щитовидной железы - тироидную пероксидазу (ТПО), тироглобулин и рецептор тиротропного гормона 1, которая проявляется появлением в высокой концентрации специфических аутоантител (ААТ) к указанным тироидным аутоантигенам в сыворотке крови больных. ААТ к ТПО присутствуют в сыворотке у большинства пациентов с болезнью Грейвса (более 80 ), тироидитом Хашимото (более 90 ), послеродовым тироидитом (66 ) и являются маркером аутоиммунных заболеваний щитовидной железы 2-5. Установлено, что ААТ к ТПО обладают способностью индуцировать комплементзависимую цитотоксичность и вызывать цитотоксические изменения в структурных элементах фолликулов щитовидной железы, играя важную роль в патогенезе заболевания данного органа. Выявлена прямая корреляция между титром этих антител и гистологическими изменениями в щитовидной железе, которые наблюдаются при АЗЩЖ 6. В связи с этим создание биоспецифических иммуносорбентов для элиминации патогенных ААТ к ТПО при АЗЩЖ представляется весьма актуальной и важной задачей. В клинической практике применяются сорбенты с иммобилизованными поликлональными антителами к иммуноглобулинам человека ( Адсопак, НПФ ПОКАРД, Россия,, Германия) 7, 8, а также колонки с иммобилизованным белком( и ,, Германия) 9, 10. Однако указанные сорбенты обладают рядом существенных недостатков, а именно не являются специфическими по отношению к анти-ТПО ААТ (связывают общие иммуноглобулины классов , А и М), крайне сложны в получении и весьма дорогостоящи. В некоторых случаях была отмечена утечка лиганда с носителя 11, 12. Сорбенты, селективно элиминирующие ААТ к ТПО из сыворотки крови человека, на данный момент не известны. 2 12635 1 2009.12.30 Задачей данного изобретения является создание новых иммуносорбентов для избирательной сорбции ААТ к ТПО человека из плазмы или сыворотки крови человека. Для решения данной задачи в качестве полимера-матрицы используют полиакриламидный гель и -сефарозу, а в качестве биоселективного лиганда - синтетический аналог антигенной детерминанты ТПО человека тетрапептид . Заявляемый иммуносорбент в качестве матрицы содержит -сефарозу, ковалентно связанную с лигандом, и имеет следующую химическую формулу где- число звеньев цепи -сефарозы между центрами иммобилизации тетрапептидных лигандов, которое имеет значение от 15 до 35. Выбор -сефарозы обусловлен возможностью иммобилизации лиганда на ее поверхности, что делает все молекулы лиганда доступными для связывания с молекулами ААТ к ТПО человека и повышает сорбционную емкость заявляемого иммуносорбента. Иммуносорбент получают путем иммобилизации тетрапептида Нна -активированную сефарозу (, США) в среде бикарбонатного буфера ( 8,3). Инкубирование полученного сорбента с 0,2 М раствором глицина вызывает блокирование-групп, оставшихся свободными после присоединения тетрапептида. Последующие промывки сорбента бикарбонатным ( 8,3) и ацетатным буферами ( 4,0) способствуют избавлению от неспецифически адсорбировавшегося тетрапептида и глицина 13. Способ получения иммуносорбента приведен в примере 2. Заявляемый иммуносорбент в качестве матрицы содержит полиакриламидный гель, в качестве биоселективного лиганда - тетрапептид и имеет следующую химическую формулу 3 где- число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации тетрапептидных лигандов, которое имеет значение от 1 до 70- число участков цепи с лигандом, имеющее значение от 50 до 10000. Выбор полиакриламидной матрицы обусловлен ее стабильностью, биологической инертностью, возможностью введения лиганда на стадии полимеризации. Для превращения вводимого в качестве лиганда пептида в мономер проводят его ацилирование акрилоилхлоридом. Полученное производное используют как мономер при сополимеризации акриламида, ,-метиленбисакриламида в присутствии персульфата аммония и -тетраметилендиамина в качестве инициаторов полимеризации. Способ получения иммуносорбента приведен в примере 3. Способ получения тетрапептида , выступающего в качестве лиганда в заявляемых иммуносорбентах, приведен в примере 1. Пример 1 Получение тетрапептида . В примере приведены хроматографические подвижности в системах (А) - хлороформ метанол - 20-ный аммиак, 604010, (Б) - бутанол - уксусная кислота - вода, 401010,(С) - хлороформ - уксусная кислота - вода, 302010. Удельное вращение определяют на спектрополяриметре -20 (, Япония). Стадия 1. Получение (-)- . К раствору 1,20 г (4,2 ммоль) хлоргидрата метилового эфира Н-карбобензокси-лизина в 4,0 мл ДМФ прибавляют 0,6 мл триэтиламина (4,4 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение 15 минут и затем вносят 0,75 г (4,0 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-аланина. После охлаждения до 0 С в реакционный сосуд прибавляют последовательно 0,56 г (4,2 ммоль) гидроксибензатриазолаи 0,90 г (4,4 ммоль) дициклогексилкарбодиимида . Реакционную смесь перемешивают в течение 2 часов при 0 С и 5 часов при комнатной температуре. После окончания реакции осадки дициклогексилмочевины(ДЦГМ) и ТЕАНС отфильтровывают, промывают на фильтре 2,0 мл ДМФ. В фильтрат добавляют 15 мл этилацетата и полученный раствор промывают 9 -ным раствором лимонной кислоты, 5 -ным раствором 3, насыщенным раствором натрия хлорида,водой, сушат над 24. После сушки этилацетат упаривают, а образовавшийся маслообразный остаток переосаждают из эфира петролейным эфиром и сушат над 25. Получают 1,52 г (выход 88 ) соединения 0,62 (Б). Стадия 2. Получение (-)- . К раствору 1,50 г (3,4 ммоль) (-)- в 0,8 мл этилацетата добавляют 13,9 мл 4,4 н раствора НС в этилацетате. Перемешивают образовавшуюся взвесь в течение 40 минут, затем осадок отделяют фильтрованием, промывают на фильтре этилацетатом, эфиром, сушат в эксикаторе над . Получают 1,23 г (выход 99 ) соединения 20 - 10,0 (С 1, МеОН)0,58 (А). Стадия 3. Получение (-)- . К раствору 1,19 г (3,2 ммоль)(-)-в 4,0 мл ДМФ добавляют 0,53 мл (3,8 ммоль) триэтиламина ( 8-9). Реакционную смесь перемешивают в тече 4 12635 1 2009.12.30 ние 20 минут и затем вносят 0,79 г (3,2 ммоль) трет.бутилоксикарбонил-глутамина. Охладив реакционную колбу до 0 С, вносят последовательно 0,45 г (3,3 ммоль)и 0,78 г(3,8 ммоль) . Время прохождения реакции - 4 часа. После окончания реакции осадок ДЦГМ и ТЭАНС отфильтровывают, промывают небольшим количеством ДМФ, а к фильтрату добавляют 20,0 мл этилацетата и полученный раствор промывают 9 -ным раствором лимонной кислоты, 5 -ным раствором 3, насыщенным раствором натрия хлорида, водой, сушат над 24. После сушки этилацетат упаривают, а образовавшийся маслообразный остаток переосаждают из эфира петролейным эфиром и сушат над 25. Получают 0,65 г (выход 68 ) соединения 20 - 14,5 (С 1, МеОН)0,88 (А). Стадия 4. Получение (-)- . К суспензии 0,51 г (0,9 ммоль) (-)-в 1,0 мл этилацетата добавляют 4,6 мл 4,4 н раствора НС в этилацетате. Реакционную смесь перемешивают около часа, затем растворитель упаривают, а остаток промывают этилацетатом, эфиром. Сушат в эксикаторе над . Получают 0,43 г (выход 98 ) соединения 20 11,1 (С 1, МеОН)0,36 (С). Стадия 5. Получение -(-)(-)- . К раствору 0,40 г (0,8 ммоль) соединенияв 2,5 мл ДМФ добавляют 0,41 г (0,8 ммоль) дициклогексиламмонийной соли-трет.бутилоксикарбонилбензилового эфира глутаминовой кислоты ( 8-9). Реакционную смесь перемешивают в течение 20 минут,выпадает осадок НС. Охладив реакционную колбу до 0 С, вносят последовательно 0,12 г (0,9 ммоль)и 0,21 г (1,0 ммоль) . Время прохождения реакции - 6 часов. После окончания реакции осадок ДЦГМ и НС отфильтровывают, промывают небольшим количеством ДМФ, а к фильтрату добавляют 20,0 мл этилацетата и полученный раствор промывают 9 -ным раствором лимонной кислоты, 5 -ным раствором аНСО 3, насыщенным раствором натрия хлорида, водой, сушат над 24. Этилацетат упаривают, образовавшийся остаток переосаждают из метанола эфиром. После сушки в эксикаторе над Р 2 О 5 получают 0,42 г (выход 68 ) соединения 20 - 13,6 (С 1, МеОН)0,79 (А). Стадия 6. Получение тетрапептида . Через раствор 0,35 г (0,40 ммоль) соединения -(-)(-)в смеси 0,5 мл уксусной кислоты и 4,0 мл метанола пропускают в течение 2 часов ток водорода в присутствии катализатора - 0,0025 г палладиевой черни - при постоянном перемешивании. После деблокирования пептида (контроль ТСХ) катализатор отделяют фильтрованием, фильтрат упаривают, осадок переосаждают из метанола эфиром, сушат в вакууме над Р 2 О 5. Получают 0,22 г (94 ) соединения Вос 20 - 20,8 (С 1, МеОН)0,39 (А). Стадия 7. Получение тетрапептида . К раствору 0,15 г (2,5 ммоль) в 0,2 мл этилацетата добавляют 1,3 мл 4,4 н раствора НС в этилацетате. Перемешивают образовавшуюся взвесь в течение 40 минут, затем осадок отделяют фильтрованием, промывают на фильтре этилацетатом, эфиром, сушат в эксикаторе над . Получают 0,13 г (выход 99 ) соединения 0,58. Пример 2 Получение иммуносорбента, содержащего в качестве матрицы -сефарозу, а в качестве биоселективного лиганда - тетрапептид . 7,5 г -сефарозы подвергают набуханию в 75,0 мл 1 мМ НС в течение 15 минут,затем переносят сорбент на фильтр и промывают 1,5 л 1 мМ НС и 0,2 л 0,1 М аНСО 3/0,5 М,8,3. К раствору 0,07 г пептида в 10,0 мл 0,1 М 3/0,5,8,3, добавляют активированную сефарозу и встряхивают реакционную смесь в течение 15 часов при 4 С. После окончания реакции сорбент отфильтро 5 12635 1 2009.12.30 вывают, добавляют к нему 50 мл 0,2 М глицина и встряхивают образовавшуюся взвесь в течение 16 часов при 4 С. Сорбент снова переносят на фильтр и промывают 20,0 мл 0,1 М 3/0,5,8,3, и 20,0 мл 0,1 М 3/3,4,0. Отмытый гель хранят в 0,02 М НФБ,7,5, содержащем 0,2 Ми 0,13, при 4 С. Пример 3 Получение иммуносорбента, содержащего в качестве матрицы полиакриламидный гель, а в качестве биоселективного лиганда - тетрапептид . К раствору 0,13 г (0,26 ммоль) хлоргидрата метилового эфира глутамил-гутаминил-аланил-лизина в 50 мл 2 раствора бикарбоната натрия по каплям прибавляют 0,04 мл(0,54 ммоль) акрилоилхлорида и перемешивают реакционную смесь в течение 45 минут,затем вносят 4,42 г акриламида и 0,46 г ,-метиленбисакриламида. После растворения компонентов к реакционной смеси прибавляют 0,23 г персульфата аммония и 0,15 мл-тетраметилендиамина. Через 2 минуты образуется гель белого цвета. Гель оставляют на 1 час, затем измельчают с использованием шприца с диаметром выходного отверстия 2 мм. Образовавшиеся гранулы геля сначала многократно промывают дистиллированной водой (общий объем 1,0 л), а затем 0,9 раствором(общий объем 0,5 л). Содержание метилового эфира глутамил-гутаминилаланил-лизина в набухшем геле составляет 0,8-1,1 мг/мл. Отмытый гель хранят в 0,9 растворепри 4 С. Биоспецифическое связывание ААТ к ТПО человека иммуносорбентами, приведенное в примерах 4 и 5 соответственно, доказывает, что заявляемые иммуносорбенты селективно удаляют ААТ к ТПО из аутоиммунной сыворотки и могут найти применение в медицине и экспериментальной биохимии в качестве иммуносорбентов для избирательной элиминации патогенных аутоантител при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы. Пример 4 Биоспецифическое связывание ААТ к ТПО человека заявляемым иммуносорбентом,содержащим в качестве матрицы -сефарозу, а в качестве биоселективного лиганда тетрапептид . Для определения биоспецифического связывания ААТ к ТПО человека заявляемым иммуносорбентом его исследуют методом аффинной хроматографии. Эксперимент по исследованию иммуносорбента проводят в режиме рециркуляции с использованием универсального перистальтического насоса при температуре 37 С со средней скоростью протока 102 мл/мин объем иммуносорбента в колонке 5 мл, объем аутоиммунной сыворотки 40 мл, концентрация ААТ к ТПО в сыворотке 400 МЕ/мл, время сорбции 120 минут. После окончания сорбции иммуносорбент промывают 500 мл 0,9 раствора , а связавшийся белок элюируют 40 мл 0,2 М глицин- буфера,2,2, и доводятдо 7,4 с помощью 1 М Трис-,8,0, и 1 М . Концентрацию ААТ к ТПО в элюате определяют методом иммуноферментного анализа (ИФА). Способность заявляемого иммуносорбента специфически связывать ААТ к ТПО из сыворотки крови человека подтверждают тестированием элюата. Методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия показано, что элюат с заявляемого иммуносорбента содержит иммуноглобулины. Методом ИФА определено,что концентрация анти-ТПО ААТ в элюате составляет 640 МЕ/мл из расчета на 1 мл иммуносорбента. В элюате также обнаружено незначительное количество альбумина, присутствие других белков крови не выявлено. Пример 5 Биоспецифическое связывание ААТ к ТПО человека заявляемым иммуносорбентом,содержащим в качестве матрицы полиакриламидный гель, а в качестве биоселективного лиганда - тетрапептид . Для определения биоспецифического связывания ААТ к ТПО человека заявляемым иммуносорбентом его и полиакриламидный гель без лиганда исследуют методом аффинной хроматографии. Эксперименты по исследованию сорбентов проводят в режиме ре 6 12635 1 2009.12.30 циркуляции с использованием универсального перистальтического насоса при температуре 37 С со средней скоростью протока 102 мл/мин при одинаковых условиях объем сорбента в колонке 20 мл, объем аутоиммунной сыворотки 40 мл, концентрация ААТ к ТПО в сыворотке 980 МЕ/мл, время сорбции 240 минут. После окончания сорбции каждый сорбент промывают 500 мл 0,9 раствора , а связавшийся белок элюируют 40 мл 0,2 М глицин-НС буфера,2,2, и доводятдо 7,4 с помощью 1 М Трис-,8,0 и 1 М. Концентрацию ААТ к ТПО в элюатах определяют методом иммуноферментного анализа. Способность иммуносорбента специфически связывать ААТ к ТПО из сыворотки крови человека подтверждают тестированием элюатов с заявляемого иммуносорбента и с сорбента полиакриламид без лиганда. Методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия показано, что элюат с заявляемого иммуносорбента содержит иммуноглобулины. Методом ИФА определено, что концентрация анти-ТПО ААТ в элюате составляет 350 МЕ/мл из расчета на 1 мл иммуносорбента. В элюате с полиакриламидного геля без лиганда иммуноглобулины не обнаружены ни электрофорезом,ни ИФА. В обоих элюатах обнаружено незначительное количество альбумина, присутствие других белков крови не выявлено. Полученные данные о содержании биохимического агента в сыворотке крови полностью отождествляются с его концентрацией в плазме крови, так как в отношении агентов приобретенного иммунитета, к которым относятся аутоантитела к тиропероксидазе, плазма и сыворотка (плазма, лишенная фибриногена) крови являются идентичными биологическими жидкостями. Сыворотка чаще используется в качестве образца для анализа в клинической лабораторной практике. Приведенные в примерах 4 и 5 данные свидетельствуют о том, что заявляемые иммуносорбенты обладают избирательной сорбцией по отношению к аутоантителам к тироидной пероксидазе человека. Источники информации 1.В./ В. , // . . . 2001. - . 108. - . 9. - . 1253-1259. 2..-/ .. // . . . . 1986. - . 62. - . 928-933. 3.. -/ ..//. . . . - 1990. - . 71. - . 661-669. 4../ .. // . - 1991. - . 9. . 237-244. 5./ ,//. . . . . - 2005. - . 19. - . 1-15. 6..4/ .. // . - 2003. - . 144. - . 12. - . 54225429. 7. Коновалов Г.А. Аферез иммуноглобулинов - новый подход к лечению тяжелых форм дилатационной кардиомиопатии / Коновалов Г.А и др. // Кардиология. - 2002. Т. 6. С. 92-96. 8. -,/ . // . . - 1996. - . 20. - . 4. - . 356-359. 13. Северин С.Е. Практикум по биохимии / Северин С.Е., Соловьева Г.А. - 2-ое изд. М. Изд-во МГУ, 1989. - С. 509. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8