Способ фотодинамической терапии перевитой подкожно карциномы РЛ-67 у мыши

2-я - введение АЬА без облучения опухоли3-я - лазерное облучение опухоли без предварительного введения АЬАС целью максимального приближения условий эксперимента К клиническим фотодинамическую терапию проводили у мышей после формирования опухоли ( 12-14 сутки после перевивки 31313), когда ее объем достигал 0,25 1 0,03 смз.Перед сеансом фотодинамической терапии в зоне роста опухоли удаляли шерсть путем вь 1 щипь 1 вания. В качестве фотосенсибилизатора использовали гидрохлорид АЬА(ЫН 2 СН 2 СОСН 2 СН 2 СО 2 Н), растворенный в физиологическом растворе хлорида натрия. Препарат вводили перорально в дозе 500 мг/кг массы тела (0,3 мл). Облучение проводили через 4 ч после введения препарата. В качестве источника излучения использовали гелийнеоновые лазеры ЛГ-111 с длиной волны излучения 633 нм, при плотности мощности 130-150 мВт/см 2 и экспозиции 20-25 мин. Исходная мощность одного такого лазера составляла 30-40 мВт. Чтобы достигнуть необходимой для облучения экспериментальной опухоли плотности мощности, применяли кварцевые светодиодные системы (ПО Фотоника плюс). Световод от каждого лазера заводили в специально разработанное устройство,которое позволяло сконцентрировать излучение от нескольких лазеров в один световой пучок. Световод устанавливали с таким расчетом, чтобы диаметр светового пятна составил 1,2 см. Мощность излучения контролировали с помощью измерителя ИМО-2.Критерием оценки являлось замедление метастазирования карциномы 31313, которое оценивали на 21-е сутки по частоте метастазирования, изменению массы легких, количеству метастазов у мышей каждой группы.АЬА - ФДТ существенно влияет на процесс образования метастазов 3 ЬЬ в легких. У животных 4-й группы частота метастазирования была на 67 ниже, чем в остальных группах, где этот показатель составил 100 . Среднее число метастазов в легких у мышей 4-й группы было в 5,1 раза меньше по сравнению с таковыми в 3-й, в 4,7 раза - во 2-й, в 5,9 раза - в контрольной группах. При этом средний объем метастазов у животных 4-й группы был в 4 раза меньшим по сравнению с таковым в контрольной. Следовательно,фотодинамическая терапия с использованием в качестве фотосенсибилизатора АЬА сопровождается уменьшением количества и объема метастазов карциномы 3 ЬЬ в легких.Однако известный способ при своем использовании имеет недостаткипероральное введение АЬА не позволяет точно контролировать дозу введенного препарата мышамфотодинамическую терапию проводят через 4 ч после перорального введения препарата, что является длительным и трудоемким процессом.В настоящее время в ОАО Белмедпрепараты разработана мазь Фотолон для местного применения при фотодинамической терапии злокачественных опухолей. Мазь Фотолон представляет собой молекулярный комплекс Хлорина Е 6 и его производных с поливинилпирролидоном.Задача изобретения - оценить влияние ультразвука на интенсивность процесса метастазирования при его воздействии на первичную опухоль - карциному легких РЛ-67, а также при совместном применении с мазью Фотолон при проведении комбинированной фотодинамической терапии в эксперименте на мышах линии С 57 В 16.Техническим результатом является отсутствие увеличения частоты метастазирования первичной опухоли РЛ-67 в легкие при проведении озвучивания опухоли и комбинированной фотодинамической терапии на основе фонофоретического введения фотосенсибилизатора.Технический результат достигается в результате проведения озвучивания опухоли и фонофореза фотосенсибилизатора с использованием оптимальных параметров ультразвукового воздействия, что не приводит к увеличению интенсивности процесса метастазирования карциномы РЛ-67 мышей линии С 57 В 16 в легкие по сравнению с контролем.Способ осуществляют следующим образом.В работу берут Мышей линии С 57 В 16 разводки вивария ГУ НПЦ института фармакологии и биохимии НАН Беларуси. В качестве экспериментальной модели опухоли используют штамм метастазирующей карциномы легкого РЛ-67. Все исследования проводят в соответствии с существующими международными этическими и научными стандартами качества планирования и проведения исследований на животных, в частности, с учетом Методических указаний по проведению доклинических исследований фармакокинетики фармакологических веществ и лекарственных средств 2. Опухоль перевивают подкожно в паховую область путем введения 0,2 мл 10 опухолевой взвеси в растворе Хенкса. Все дальнейшие манипуляции на животных осуществляют после введения последних в состояние нейролептоанальгезии (раствор дроперидола из расчета 0,1 мл на мышь).С целью максимального приближения условий эксперимента к клиническим исследованиям выполняют на 7-8 сутки, когда опухоль является сформированной и ее объем достигает 0,8 1 0,01 смз.Все животные (150 мышей С 57 В 16 весом 20 1 3 г) распределены на 6 групп в зависимости от интенсивности воздействия ультразвука1-я группа - озвучивание опухоли при интенсивности воздействия ультразвуком 0,7 Вт/см 2 в течение 10 мин2-я группа - озвучивание опухоли при интенсивности воздействия ультразвуком 0,4 Вт/см 2 в течение 10 мин3-я группа - проведение фотодинамической терапии с использованием фотосенсибилизатора мазь Фотолон при экспозиции 2 ч4-я группа - проведение комбинированной фотодинамической терапии с фонофорезом мази Фотолон при интенсивности ультразвуковых колебаний 0,4 Вт/см 2 в течение 10 мин при экспозиции 2 ч5-я группа - проведение комбинированной фотодинамической терапии с фонофорезом мази Фотолон при интенсивности ультразвуковых колебаний 0,7 Вт/см 2 в течение 10 мин при экспозиции 2 чМышам линии С 57 В 16 с перевитой метастатической карциномой РЛ-67 после фиксации наносят тонкий слой 0,3 мл 5 мази Фотолон (группы 3, 4, 5) или тонкий слой 0,3 мл вазелинового масла (группы 1, 2). Процедуру фонофореза мази Фотолон(группы 4, 5) и процедуру озвучивания опухоли (группы 1, 2) проводят, используя аппарат УЗТ 1.04-0 (завод Эмма, Россия) с излучателем 1 см 2, ультразвуком частотой 880 кГц в непрерывном режиме при интенсивности 0,4 и 0,7 Вт/см 2 соответственно в течение 10 мин. Место воздействия закрывают полиэтиленовой пленкой и фольгой для предотвращения действия света и высыхания. Экспозиция мази Фотолон составляет 2 ч. Сеанс фото динамической терапии проводят животным (3, 4, 5 группы), используя установку ЛД 680-2000, на основе полупроводникового лазерного диода с длиной волны излучения 670 нм (Биоспек, Москва), при этом экспозиционная доза составляет 100 Дж/см 2, мощность на выходе 0,4 Вт, плотность потока мощности - 0,51 Вт/см 2, диаметр светового пятна - 1 см, время облучения - 3 мин 27 сек.На 24 день после перевивки метастатической карциномы РЛ-67 всех мышей линии С 57 В 16 умерщвляют хлороформом по общепринятой методике. Легкие иссекают, фиксируют в жидкости Карнуа и подсчитывают слепым методом число метастазов в каждой группе с помощью стереомикроскопа МБИ-3 при увеличении 8.Интенсивность метастазирования карциномы РЛ-67 оценивают по следующим показателямобщее число метастазов в группесреднее число метастазов (в пересчете на мышей с развившимися метастазами)Индекс торможения (стимуляции) метастазирования по формуле ЗВк и В - среднее число метастазов в легкие у животных контрольной и опытной групп.При проведении озвучивания опухоли РЛ-67 мышей с выбранными параметрами воздействия ультразвуком не наблюдается статистически значимого изменения процесса метастазирования по сравнению с контрольной группой, то есть данное воздействие не способствует повышению интенсивности процесса метастазирования опухоли РЛ-67.Проведение комбинированной фотодинамической терапии на основе фонофореза 5 мази Фотолон оказывает влияние на интенсивность процессов метастазирования, при этом замедляется срок развития метастазов (табл. 1 и 2).Среди существенных признаков, характеризующих способ влияния ультразвука на интенсивность процессов метастазирования при фотодинамической терапии в эксперименте,отличительными являютсянанесение на поверхность опухоли 0,3 мл 5 мази Фотолонпроведение озвучивания опухоли и фонофореза фотосенсибилизатора с использованием оптимальных параметров ультразвукового воздействия, не приводящих к интенсификации процесса метастазирования (ультразвук с частотой 880 кГц при интенсивности 0,4 Вт/см 2 и 0,7 Вт/см 2 в течение 10 мин в непрерывном режиме (излучатель 1 см 2экспозиция опухоли без доступа света в течение 2 чпроведение лазерного облучения опухоли светом с длиной волны 670 нм экспозиционная доза - 100 Дж/см 2, мощность на выходе - 0,4 Вт, плотность потока мощности 0,51 Вт/см 2, диаметр светового пятна - 1 см, время облучения - 3 мин 27 с.Реализация предложенного способа и влияние ультразвука на интенсивность процессов метастазирования при фотодинамической терапии в эксперименте иллюстрируется следующими примерамиМышь линии С 57 В 16 весом 21 г с перевитой метастатической опухолью РЛ-67 (0,9 см в диаметре) взяли в эксперимент на 8 сутки после перевивки опухоли. Животное ввели в наркоз, фиксировали, нанесли на область проекции опухоли 0,3 мл вазелинового масла и провели процедуру озвучивания опухоли ультразвуком частотой 880 кГц в непрерывном режиме при интенсивности 0,7 Вт/см 2 в течение 10 мин по стабильной методике (излучатель 1 см). На 24 день после перевивки карциномы РЛ-67 мышь умертвили хлороформом по общепринятой методике. Легкие иссекли, фиксировали в жидкости Карнуа и подсчитали число метастазов с помощью стереомикроскопа МБИ - 3 при увеличении 8 (фиг. 1). Общее число метастазов - 27, большие - 17, малые - 10 (группа 1).Мышь линии С 57 В 16 весом 21 г с перевитой метастатической опухолью РЛ-67 (0,9 см в диаметре) взяли в эксперимент на 8 сутки после перевивки опухоли. Животное ввели в наркоз, фиксировали, нанесли на область проекции опухоли 0,3 мл 5 мази Фотолон и провели процедуру фонофореза ультразвуком частотой 880 кГц в непрерывном режиме при интенсивности 0,7 Вт/см 2 в течение 10 мин по стабильной методике (излучатель 1 см). Место воздействия (опухоль с мазью) закрыли светонепроницаемым материалом и вь 1 держивали без доступа света 2 ч. Остатки мази тщательно удалили с поверхности опухоли.ИТМ -100 , Влияние ультразвука на метастазирование опухоли РЛ-б 7Число ЖИВОТ- Частота ме- Общее число Торможение ,Группа Среднее число метаПроЦедурь 1 нь 1 х с метаста- тастазирова- Метастазов в стимуляция (-) роста животных стазов в группе зами ния, группе опухоли, 1 УЗ-0,7 Вт/см 2 10 мин 13/13 100 249 19,15 1 2,83 13,5 2 У 3-0,4 Вт/смд 10 мин 15/15 100 307 20,47 1 4,52 7,5 Мазь Фотолон 3 ФДТ Через 2 Ч 15/15 100 328 21,87 1 3,38 1,2 Мазь Фотолон 4 УЗ-0,4 Вт/см 2 10 мин 13/11 85 279 21,46 1 3,49 17,6 ФДТ через 2 ч Мазь Фотолон 5 У 3-0,7 Вт/см 2 10 мин 12/12 100 256 21,33 1 3,39 3,7 ФДТ через 2 ч 6 (Контроль) - 28/28 100 620 22,14 1 2,76 Таблица 2 Влияние ультразвука на соотношение больших и малых метастазов РЛ-б 7 Большие метастазы до 1 мм Малые метастазы до 0,5 мм Группа П Количество Среднее число ЖИВОТНЫХ РОЦВДУРЫ М ста стаз ОБ М ста Стаз ОБ Кол-во ме- Среднее число Кол-во ме- Среднее числотастазов метастазов тастазов метастазов