Биопрепарат для ликвидации аварийных разливов нефти на воде и почве

(51)02 3/34 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛИКВИДАЦИИ АВАРИЙНЫХ РАЗЛИВОВ НЕФТИ НА ВОДЕ И ПОЧВЕ(71) Заявители Министерство по чрезвычайным ситуациям Республики Беларусь Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Самсонова Алисса Самуиловна Алещенкова Зинаида Михайловна Семочкина Наталья Федоровна Котов Сергей Григорьевич Лупей Алексей Юрьевич(73) Патентообладатели Министерство по чрезвычайным ситуациям Республики Беларусь Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Биопрепарат для ликвидации аварийных разливов нефти на воде и почве, содержащий микроорганизмы-деструкторы нефти, отличающийся тем, что получен с использованием штаммовБИМ -298 Д,БИМ В-301 Д,БИМ В-299 Д иБИМ В-300 Д, взятых в соотношении 1111, причем 1 г препарата содержит не менее 1010 жизнеспособных клеток. Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для ликвидации последствий аварий, приводящих к экологическим катастрофам. Известны бактериальные препараты на основе монокультур микроорганизмовдеструкторов нефти Путидойл и Бациспецин 1, 2. Эффективность применения Путидойла в естественных условиях составляет 29,33. Использование препарата Бациспецин для интенсификации разрушения нефти в почве при соотношении нефтьпрепарат 10,02 обеспечивает разрушение нефти за 2 месяца на 432. Одним из наиболее перспективных направлений повышения эффективности биопрепаратов является создание их на основе смешанных культур микроорганизмов, способных потреблять нефть в качестве источника углерода. Известен консорциум микроорганизмов, состоящий из бактерий рода ,и дрожжей ,для очистки почвенных и водных экосистем от нефти 4. Однако производство и использование препаратав промышленных условиях затруднено, так как входящие в его состав микроорганизмы имеют различные характеристики роста. 8260 1 2006.08.30 Наиболее близким по технической сущности является состав для очистки воды и почвы от нефти, включающий штаммы.1418 и. 1715 в присутствии фосфор-, азот- и калийсодержащих солей 5. Эффективность действия состава обеспечивается не только микроорганизмами, входящими в состав препарата, но и источниками минерального питания, интенсифицирующими развитие как аборигенных, так и интродуцированных микроорганизмов-деструкторов. Целью предлагаемого изобретения является создание высокоэффективного бактериального препарата Экобел, способного активизировать процесс деградации разлившейся на поверхности воды и почвы нефти. Поставленная цель достигается использованием четырех природных высокоактивных штаммов бактерий рода , потребляющих нефть в качестве единственного источника углерода. Учитывая, что параметры роста штаммовБИМ -298 Д,БИМ В-301 Д,БИМ В-299 Д,БИМ В-300 Д одинаковы и выращивание их проводится одновременно в одном ферментере, соотношение указанных штаммов в препарате 1111. Описание штаммов микроорганизмов-деструкторов нефти, входящих в состав препарата Экобел. ШтаммБИМ В-299 Д выделен из почвы, подвергавшейся длительному загрязнению промвыбросами предприятия органического синтеза. В дальнейшем штамм адаптировался к нефти в возрастающей концентрации (1-20 ). Клетки грамположительные, неподвижные, через 18 ч роста на МПА прямые или слегка искривленные, иногда слабоветвящиеся располагаются часто -образно, через 24 ч укорачиваются до кокковидных. Колонии нарозово-кремовые, круглые, диаметром 1-5 мм, выпуклые, неблестящие, сухие, легко снимаются с агара. В клеточной стенке обнаружены галактоза, арабиноза, мезодиаминопимелиновая кислота (мезо-ДАПК), липид - ( тип). Аэроб, некислотоустойчив, оксидазоотрицателен, имеет каталазу, уреазу, ДНК-азу,анаэробный тест Хью-Лейфсона с глюкозой отрицательный, желатин не разжижает, крахмал не гидролизует, но разлагает казеин, ксантин и тирозин. Образует кислоту из глюкозы, сахарозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, маннита и глицерина, но не из арабинозы,лактозы, рамнозы, дульцита и сорбита. Усваивает натриевые соли органических кислот лимонной, пропионовой, бензойной, молочной, уксусной, -кетоглутаровой, но не щавелевой. Восстанавливает нитраты в нитриты, растет на нитритном агаре, на безазотистой среде Эжби, в присутствии 5 , не образует индол, устойчив к тетрациклину (10 ед.),слабо чувствителен к бензилпенициллину (10 ед.), не токсичен, не патогенен. Штамм деградирует нефть, содержащуюся в жидкой минеральной среде в концентрации 10 , в течение 28 дней на 45 . ШтаммБИМ В-300 Д выделен из активного ила очистных сооружений. В дальнейшем штамм подвергался адаптации к нефти в возрастающей концентрации(1-20 ). Клетки грамположительные, неподвижные. На ранней стадии развития образуется рудиментарный мицелий, который в дальнейшем распадается на фрагменты, превращающиеся в результате последовательных делений в палочки, а затем в кокки. На МПА клетки через 16-20 ч длинные, обильно ветвящиеся, к 24-30 ч фрагментируются на палочки, а через 48 ч - на кокки. Колонии наоранжево-красные, круглые, диаметром 1-5 мм, выпуклые, неблестящие, сухие, легко снимаются с агара. В клеточной стенке содержатся галактоза, арабиноза, мезодиаминопимелиновая кислота (мезо-ДАПК), липид - ( тип). 8260 1 2006.08.30 Аэроб, некислотоустойчив, оксидазоотрицателен, каталазо-положителен, анаэробный тест Хью-Лейфсона с глюкозой отрицательный, желатин не разжижает, казеин не разлагает, крахмал не гидролизует. Образует кислоту из глюкозы, фруктозы, сорбита, инозита,глицерина. Хорошо ассимилирует цитрат, пропионат, -кетоглутарат, лактат, ацетат натрия, но не оксалат натрия. Восстанавливает нитраты в нитриты, не имеет уреазы, растет в присутствии 7 , не токсичен, не патогенен. Штамм деградирует нефть, содержащуюся в жидкой минеральной среде в концентрации 10 , в течение 28 дней на 65 . ШтаммБИМ В-301 Д выделен из почвы, подвергавшейся длительному загрязнению промвыбросами предприятия органического синтеза. В дальнейшем штамм адаптировался к нефти в возрастающей концентрации (1-20 ). Клетки грамположительные, неподвижные, морфологический цикл развития которых включает кокки-палочки-кокки. Колонии нарозово-кремовые, круглые, диаметром 1-5 мм, выпуклые, неблестящие, сухие, легко снимаются с агара. В клеточной стенке обнаружены галактоза, арабиноза, мезодиаминопимелиновая кислота (мезо-ДАПК), липид - ( тип). Аэроб, некислотоустойчив, оксидазоотрицателен, имеет каталазу, уреазу, не имеет ДНК-азу и нитратредуктазу, анаэробный тест Хью-Лейфсона с глюкозой отрицательный,желатин не разжижает, крахмал не гидролизует, казеин не разлагает. Образует кислоту из глюкозы, фруктозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, глицерина, но не использует арабинозу, сахарозу, лактозу, рамнозу, дульцит, маннит и сорбит. Усваивает натриевые соли органических кислот лимонной, пропионовой, бензойной, молочной, уксусной, кетоглутаровой, цис-аконитовой, но не щавелевой. Растет на нитритном агаре, на безазотистой среде Эжби, в присутствии 5 , не токсичен, не патогенен. Штамм деградирует нефть, содержащуюся в жидкой минеральной среде в концентрации 10 , в течение 28 дней на 50 . ШтаммБИМ В-298 Д выделен из почвы, подвергавшейся длительному загрязнению промвыбросами предприятия органического синтеза. В дальнейшем штамм адаптировался к нефти в возрастающей концентрации (1-20 ). Клетки грамположительные, неподвижные, первичный мицелий не выражен, клетки прямые или слегка искривленные, иногда слабоветвящиеся располагаются часто образно, быстро фрагментируются до кокков. Колонии нарозово-кремовые, круглые, диаметром 1-5 мм, выпуклые, неблестящие, сухие, легко снимаются с агара. В клеточной стенке обнаружены галактоза, арабиноза, мезодиаминопимелиновая кислота (мезо-ДАПК), липид - ( тип). Аэроб, некислотоустойчив, оксидазоотрицателен, имеет каталазу, уреазу, нет ДНКазы и нитратредуктазы, анаэробный тест Хью-Лейфсона с глюкозой отрицательный, желатин не разжижает, крахмал не гидролизует, не разлагает казеин, разлагает тирозин. Образует кислоту из глюкозы, фруктозы, галактозы, лактозы, ксилозы, мальтозы, но не из арабинозы, сахарозы, рамнозы, дульцита, маннита, сорбита и глицерина. Усваивает натриевые соли органических кислот лимонной, пропионовой, бензойной, молочной, уксусной, -кетоглутаровой, цис-аконитовой, но не щавелевой. Растет на нитритном агаре,на безазотистой среде Эжби, в присутствии 5 , не токсичен, не патогенен. Штамм деградирует нефть, содержащуюся в жидкой минеральной среде в концентрации 10 , в течение 28 дней на 54 . Штаммы родококков, составляющие препарат Экобел, характеризуются высоким содержанием липидов в клетках (до 30 ) и способностью развиваться непосредственно в нефтяной пленке, что существенно ускоряет процесс очистки от нефтяного загрязнения. 8260 1 2006.08.30 Штаммы хранятся на минеральной среде -8 следующего состава (г/л)- 0,5 4 72 - 0,8 24 - 0,7 (4)24 - 1,5 нефть или гексадекан в концентрации 0,1 ,7,2-7,5 при 4 С с обязательными пересевами 1 раз в 6 месяцев. Инкубирование после пересева ведут при оптимальной температуре (28-30 С) в течение 3-5 дней. Для наработки микробного препарата Экобел использовали стандартное оборудование Новополоцкого завода БВК. Культуры микроорганизмов выращивали при соотношении 1111 в условиях аэрации на среде Е-8 с 0,1 гексана или гексадекана в качестве единственного источника углерода. Биомассу отделяли сепарацией и высушивали до влажности не более 15 . Полученный таким образом препарат представляет собой порошок кремово-розового цвета с титром жизнеспособных клеток 1010 кл/г, хорошо сохраняется в бумажных мешках. Мешки с упакованным в них готовым продуктом хранят в проветриваемых закрытых помещениях, защищенных от атмосферных осадков и прямых солнечных лучей. Срок хранения сухого препарата - 1 год со дня изготовления. При очистке водоемов целесообразнее использовать биопрепарат в виде порошка, а при очистке почвы - в виде суспензии. Пример 1. В модельных условиях проводили очистку водной поверхности, загрязненной нефтью,в стеклянных сосудах объемом 250 мл. Разлив нефти на воде осуществляли внесением 1 и 10 мл нефти на поверхность 100 мл воды. В модели использовали нефть следующего состава 0,85 г/см 3, С - 85,6 , Н - 12,7 ,- 1,7 . Микробный препарат Экобел,состоящий из культур микроорганизмов-деструкторов нефти -БИМ В-298 Д,БИМ В-301 Д,БИМ В 299 Д,БИМ В-300 Д, в виде порошка наносили на поверхность разлитой нефти в количественном соотношении нефтькультура - 10,025. Съемы проводили через 7, 14, 28, 42 и 60 дней, на каждый съем использовали отдельные сосуды. Испытания осуществляли при комнатной температуре. Нефть экстрагировали хлороформом из 100 мл воды и определяли гравитационным методом 6. Результаты испытаний деградирующей активности опытной партии препарата Экобел при ликвидации аварийного разлива нефти на воде, представленные в табл. 1, показывают, что биопрепарат способствует ускорению разрушения нефти в концентрации 1 и 10 . Эффективность применения препарата составляет 50 по сравнению с контролем. Таблица 1 Использование препарата Экобел для ускорения деградации нефти на поверхности воды Остаточное содержание нефти,Варианты опыта 7 дней 14 дней 28 дней 42 дня 60 дней Вода 1 нефти 90,0 57,3 82,0 75,1 63,0 Вода 1 нефтипрепарат (10,025) 70,0 57,2 40,3 32,2 13,0 Вода 10 нефти 98,0 96,1 95,0 91,0 88,5 Вода 10 нефтипрепарат (10,025) 95,1 81,2 68,0 61,0 38,8 Таблица 2 Использование препарата Экобел для ускорения деградации нефти в почве Варианты опыта Остаточное содержание нефти,7 дней 14 дней 28 дней 42 дня 60 дней Почва 1 нефти 92,0 85,0 80,0 72,0 56,0 Почва 1 нефтипрепарат (10,025) 65,1 50,3 30,0 12,0 3,5 Почва 10 нефти 95,6 93,2 90,0 88,0 82,0 Почва 10 нефтипрепарат 90,1 79,9 60,5 45,0 30,1 8260 1 2006.08.30 Пример 2. В условиях лабораторной модели осуществляли очистку поверхности почвы от нефти. Испытания деструктивной способности препарата Экобел проводили в условиях постоянной влажности почвы, доведенной до 60 от полной влагоемкости. Разлив нефти на почве осуществляли внесением 1 и 10 мл нефти на поверхность 100 г почвы. Для приготовления суспензии микроорганизмов-деструкторов из сухой биомассы использовали отдельные сосуды, в которых замачивали биопрепарат Экобел не менее 1/2 ч (в 14 мл воды, необходимых для внесения в почву с целью создания соответствующей влажности). Количество внесенного препарата по отношению к разлитой нефти составляло 10,025. Почва тщательно перемешивалась. Съемы опыта проводили через 7, 14, 28, 42 и 60 дней. Нефть из 100 г почвы экстрагировали хлороформом и определяли весовым методом 6. Испытания проводили при комнатной температуре в условиях постоянной влажности почвы, без внесения источников минерального питания. Результаты испытаний, представленные в табл. 2, свидетельствуют о том, что в почве нефть в концентрации 1 и 10 разрушается за 60 дней на 96,5 и 69,9 соответственно. Испытания препарата в модельных условиях продемонстрировали его высокую эффективность при ликвидации разливов нефти на воде и почве. Источники информации 1. А.с. СССР 1428809, МПК 02 В 15/04, 1988. 2. Патент 2077397 1, МПК В 09 С 1/10, С 09 К 3/32, 1997. 3. Новиков Ю.В., Козлова .В. Исследование бактериального препарата Путидойл,предназначенного для очистки водоемов от нефти // Водное хозяйство. - 1992. -2. С. 121-123. 4. Патент 2023686 1, МПК 02 3/34,02 В 15/04, С 12 39/00, 1994. 5. Патент 2090697 1, МПК 02 В 15/04, С 02 3/34, 1997. 6. Гончарук Е.И., Сидоренко Г.И. Гигиеническое нормирование химических веществ в почве. - . Мир, 1998. - С 298. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5