Способ получения трансгенных свиней

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕПАРУСЬ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ СВИНЕЙ(71) Заявитель Готтфрид Брем (ВЕ)(73) Патентообладатель ГоттфрИд Брем (ПЕ)Способ получения трансгенных свиней, в организме которых образуются полные антитела определенной специфичности, заключающийся в том, что в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки свиньи вводят ДНК-последовательности, кодирующие легкие и тяжелые цепи полного антитела, свободные от чулсеродньпс бактериальных последовательностей, им плантируют ЯЙЦВКПБТКУ В ЯЙЦББОД СЗМКИ СБИНЬИ И ВЫРЕЩИВИЮТ ПОТОМСТВО.Аналогов в научно-технической и патентной литературе не обнаружено.Изобретение относится к способу Получения трансгенных свиней, в организме которых образуются полные антитела заданной специфичности.Задача настоящего изобретения заключается в разработке способа, с помощью которого можно получать большое количество антител из организма трансгенных животных.Сущность изобретения заключается в получении трансгенных свиней, когда путем микроинъекции вводят одну или несколько заданных последовательностей ДНК, кодирующих нужные антитела, в мужской Пронуютеус оплодотворенной яйцеклетки свиньи, имплантируют яйцеклетки в яйцевод свиньи, выращивают потомков и затем обычным образом выделяют антитела. При этом используемые для микроинъекции последовательности ДНК свободны от бактериальных чужеродных последовательностей.При осуществлении изобретения полные гены для легкой и тяжелой цепей антитела вводят в оплодотворенные яйцеклетки свиньи, При этом возможна экспрессия антител всех изотипов. Предпочтительно использовать у- и к-цепи. Антитела могут иметь любое происхождение. Особенно предпочтительна экспрессия антител человека. Кодирующие антитела человека гены могут быть получены известными способам, из соответствующих гибридомных линий. Кроме того, изобретение обеспечивает Получение хиМерНЬш антител, гетеробиспецифичестсих антител, фрагментов антител, слитых антител, а также антитела с измененными свойствами, например, обладаюцпах повышенной активностью к связыванию комплемента, усиленными цитолитическими свойствами и т.д.Благодаря предлагаемому способу можно иммунизировать животных. Гены антител против определенных патогенных организмов, в частности, вызывающих у свиней опасные заболевания, например инфлюэнцу или чуму, можно ввести в зародышевый путь этих хсивотных. Затем при выращивании потомков можно получить животных, имеющих сопротивляемость данным инфекционным заболеваниям.Благодаря заявленному способу возможно обеспечение секреции терапевтически значимых белков в молоко.Гены, кодирующие ЫА можно слить с генами ДРУГИХ белков, например фактора свертывания крови УТП, активатора плазминогена тканевого типа и т.д. Слитые гены можно ввести в зародышевый путь хшвотньш и получить потомков, в молоко которых секретируется гибридный белок.На основании изложенного выше становится ясно, что настоящее изобретение относится к способу получения трансгенных свиней, согласно которому в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки свиньи вводят одну или несколько ДНК-последовательностей, кодирующих антитело,свободных от чуэкеродньпс последовательностей, иштлантируют яйщеклеттси в Яйцевод сашш и выращивают потомков. При этом молодо использовать, например, ДНК-последовательности, кодирующие антитела, направленных против возбудителей опасных заболеваний. Подобные заболеваъшя известны специалистам, как и вызывалшше их патогены. Таким образом можно получить,например, трансгенное хсивотное, которое обладает иммунитетом против определенного заболевая-пая.Изобретение поясняется подробнее на следующих примерах со ссылкой на фиг.1. На фиг.1 охарактеризованы гены антитела, применяемые для микроинъекции.Исходными векторами являются плазмиды рВМ 51 (ВБМ 5229) и рВМ 52 (ПБМ 5230). Векторы содержат к-ген и урген антитела мыши в различной ориентации. Данные гены были выделены из клеток гибридомы, которая секретирует 1361-антитело, обозначенное А 20/44 А 20/44 представляет собой анти-идиотипическое антитело, направленное против специфического для гаптена ЫР /4-г 1 ищрокси-3 титрофенилацетат/ антитела. Последнее антитело имеет легкую Ж-Цепь и да-тяжелую цепь ( 15 С 2 а).Описанные в патенте ЕР-А 0388964 векторы содержат К-ген в виде 5,5 кв 5 а 1 Х-фрагмента, у,ген в виде 9,25 кв 5 а 1 Ьфрагмента. Кроме того, векторы содержат гены неофосфотрансферазьх и дигидрофолатредуктазьт мыши под Контролем раннего Промотора БУ 40.рВМ 51 и рВМ 52 (содержащие по 3 сайта рестрикции для 3 а 1 1) частично расщепляют с помощью За 1, обрабатывают нуютеазой 51 (1 мкт частично расщепленной 55.1 1, инкубируют с 10 единицами Зънуютеазы в течение 60 минут при 30 С в 50 ммоль/л ацетата натрия, рН 4,5 1 ммоль/л 2 пО 4 и 0,5 вес. глицерина), выделяют линеаризированную плазшиьду из низкоплавкого геля агарозы и концы лигируют Т 4-лигазой. Лигированньте конструкции трансинфицируют в штамм НВ 1 О 1 кишечной палочки Е. со 11, и устойчивые к ампициллин-ту (50 шаг/мл) колонии изолируют на агаровых пластинках. Путем рестритщионного эндонуклеазного анализа определяют те плазмиды, у которых вследствие вьшеописанной манипуляции делегирован 5 а 1 1-сайт, расположенный между К-геном и щ-геном. Полученные плазмиды обозначают как рВМ 51 (А 5 а 1) и рВМ 2 (А 5 а 1).рВМ 51 (А 5 а 1) и рВМ 52 (АБа 1) расщепляют с помощью 5 а 1 1, и фрагмент 5 а 1 1, содержащий К-ген и м-ген антитела изолируют с помощью низкоплавкого геля агарозы и затем растворяютТаким образом, гены антитела отделяют от последовательностей вектора для последующего эксперимента по микроинъекции ( см. фиг.1)Получение трансгенных млекопитающих включает в себя приготовление инъецируемого раствора ДНК, получение оплодотворенных яйцеклеток и эмбрионов, микроинъекцию раствора ДНК в пронуклеусы и ядра, перенос инъецированных зигот синхронизированным животнЫм-реципиентам и исследование родившихся животных на интеграцию. При этом для отдельных видов млекопитающих, например мыши, кролика и свиньи, следует учитывать некоторые обусловленные видом различия при подготовке экивотньтх-переносчиков и животных-рсципиентов, при Получении и переносе эмбрионов, а также при микроинъекции.1. Приготовление инъецируемого раствора ДНК.После изолирования фрагмента ДНК и определения содержания ДНК, раствор ДНК разбавляют трио-буферным раствором так, чтобы в пиколитре раствора содержалось до 1000 копий генного конструктора. Все применяемые для микроинъещии растворы ДНК должны быть тщательно очищены во избежание закупорки инъекционных пипеток.Для получения эмбрионов свиньи можно использовать препубертатных молодых самок,имеющих вес от 60 до 90 кг. В день 0 хсивотньш-доноров переводят в другие станки и вечером вводят 1250 Е РБМС. Через 72 часа после этого генерируют овуляцию с помощью 750 1 Е НСС. Через 24-36 часов после введения НСС животных осеменяют. Эмбрионы получают через 24-27 часов после оплодотворения. Для хирургического получения эмбрионов экивотных подвергают наркозу с помощью 160 мг азаперона (стресснила) и 400 мг метомидатгидрохлорида. После подготовки поля операции кожу открывают разрезом около 10 см длиной по срединной линии на высоте последних двух пар сосков и выкладывают матку, яйцевод и яичник. Матку перфорируют тупым инструментом так, что в полость можно ввести и закрепить стеклянную канюлю длиной около 5 см. В яйцевод через воронку фибрии вводят и закрепляют изогнутую глазную канюлю длиной около 8 см, которая соединена с резиновым шлангом длиной около 30 см, Яйцевод прополаскивают 50 мл раствора РВЗ. Промывочную экидкость сливают в чашку Петри и исследуют на эмбрионы. Эмбрионы можно получать после убоя животных-доноров.Для микроинъетщии применяют инверсионный микроскоп, два микроманипулятора и инъекционный аппарат. На одном манипуляторе закрепляют фиксирующую пипетку, с помощью которой эмбрион может фиксироваться под действием пониженного давления. На втором микроманипуляторе закрепляют И соединяют с инъекционным аппаратом наполненную раствором ДНК инъекционную пипетку. Острие инъекционной пипетки имеет диаметр от 1 до 2 мкм. Для микроинъекции острие пипетки вводят через (Иона Ре 11 цс 1 с 1 а) клеточную мембрану и ядерную мембрану в полость ядра и оставляют здесь около 1-2 пиколитра раствора ДНК. Увеличение объема пронуклеуса свидетельствует об успешной микроинъекции. Микроинъекцию ядер эмбрионов осуществляют и на стадии двух клеток.В противоположность мыши или кролику у большинства видов сельскохозяйственных животных (свинья, крупный рогатый скот) яйцеклетки и эмбрионы необходимо предварительно обработать, чтобы сделать видимыми пронуклеусы и клеточные ядра (центрифугирование при 15000 а в течение 3-5 минут). Микроиньскцию осуществляют в капле среды на покровном стекле или в так называемой инъекционной камере. После микроинъекции яйцеклетки или эмбрионы культивируют до переноса.В качестве хсивотньш-реципиентов также можно использовать препубертатных молодых свиней. Через 12 часов после свиней-доноров свиньям-реципиентам вводят 750 междед. /1 Е/ РМБС и еще через 72 часа 750 междед. /1 Е/ НСС. Эта 12-часовая асинхронность между хсивотньтмидонорами и животными-реципиентами увеличивает шансы вьвкивания эмбрионов после переноса. Через 135-136 часов после начала программы (час 0 инъектгия РМЗС животным-донорам) производят перенос эмбрионов. Все инъецированные эмбрионы (35-45 штук) переносят хирургическим путем в яйцевод свиньи-реципиента. Эмбрионы равномерно распределяются на обоих маточных рогах. Предложенный способ позволяет осуществлять бескровный перенос эмбрионов в матку свиньи. Рождение молодых животных происходит через 113-116 дней после переноса.Для исследования инъецированньтх ДНК на интеграцию необходимо получить у родившихся животных пробы ткани (ткань хвоста, кровь или биопсия). Из этих проб ткани изолируют выеокомолекулярную геномную ДНК. Для доказательства интеграции проводят анализы.Положительных животных (животные с интегрированными генетическими конструкциями) выращивают и по достижении племенной зрелости спаривают с нетрансгенньтми половыми партнерами. Родившихся от этого спаривания потомков исследуют на то, унаследовали ли они трансген от трансгенного родителя. Путем спаривания гемизиготных трансгенных животных выводят затем гомозиготных трансгенных Р 2-потомков.Для исследования продукции антител у трансгенных Животных после взятия крови получают сыворотку. Пробу крови отбирают из яремной вены (Уепа ртвтнагйз) или ДРУГИХ доступных вен свиньи при убое животных.Определение титра антител в сыворотке трансгенных свиней.На пластинки для микротитрования наносят антитела против гаптена ПРИ-гидроксиднитро-фенилацетата/. Эти антитела относятся к изотипу 156 За/легкая цепь - х, тяжелая цепь у 2 а/. Буферный раствор для нанесения состоит из 0,2 ммоль /л карбоната/ бикарбоната, рН9,4. Через 2 часа пластинки инкубируют с буферным раствором для нанесения следующего слоя (50 ммоль/л НЕРЕБ, 0,15 моль/л ЪТаС 1, 1 кротеин С, рН 7,0). Все реакции проводят при комнатной температуре со встряхиванием. Градуировочную кривую строят при использовании содержащего антитело А 20 /44/ 1561/ основного раствора (ряд разбавлений). Эталонные про бы и сьтворотки разбавляют с буферным раствором для инкубирования /50 ммоль/л НЕРЕЗа0,15 моль/л ЫаС 1, 1 кротеина С, рН 7,0, 0,2 моль/л динатрийтартрата, 0,75 полиэтиленгликоля /РЕ 6/ 0,5 плюроника Р 68, 0,75 РЕО 40.000, 0 О 1 фенола/ и выдерживают в течение 2 часов при комнатной температуре. После отсасывания из лунок раствора и двукратного промывания их инкубационным буфером в лунки на два часа вносят конъюгат Рас-фрагментов антитела, направленного против ЫР, с пероксидазой /РО 1 Э/. Предварительно конъюгат разбавляют в инкубационном буферном растворе до 150 мЕ/мл РОВ - активности. После удаления из лунок конъюгата и трехкратного отмывания их специальным буферным раствором /50 ммоль/л НЕРЕЗа, 0,15 ммоль/л ЫаС 1, 0,1 плюроника Р 68 рН 7,О/ лунки в течение 60 минут инкубируют с АВТЗ /22 азинощи-З-этил-бензтиазолинюульфонатом /6/ в качестве субстрата. Погло Щение определяют с помощью фотометра при 405 нм против 490 нм. Концентрацию антител определяют по стандартной градуировочной кривой. Она составляет 1000 мкг/мл сыворотки.Изоэлектрическое фокусирование проводят в геле (Рпагтпасша) по указах-паям изготовителя. Сыворотки трансгенной и контрольной свиньи разбавляют в соотношении 111000 и наносят на гель в неденатурирутощих условиях. Градиент рН в теле /рН 5-8/ визуализирутот с помощью стандартного беша (Рпаппасша). Время разлет-пси геля составляет 30 шип-туг. Затем в течение 45 минут его инкубируют оо 100 мкг поштклонатгьното анштела (овцы к Е, у шляпки) в объеме 150 шпат и накрывают полосками ацетатцелдполозът. Нереагиругтоцше белки удаляют оттиьтватпитем в буферном растворе, содержащем 50 юдоль/л фосфата катая, 0,15 моль/л МаС 1, 0,05 твина, рН 7,2, при всфяхиванитт в течение ночи. В заключение иммунокомплексы выявляют при окрашивании серебром (Р 1 тапттас 1 т 1 а). В качестве контроля используют антитело А 20/44, полученное из асцитной жидкостиВ сыворотке трансгенной свиньи идентифицируют те же самые цепи, что и у очищенного антитела 20/44, В сыворотке контрольного животного они не обнаруживаются.б) Выделение антитела 20/44 из сыворотки трансгенной свиньи и его очистка.А 2 О/44 является анти-идиотипическим антителом, направленным к антителу (136 2 а), которое связывается с гаптеном ЫР. Последнее выделяют из асцитной жидкости и связывают с активированной бромистым Цианом сефарозой по предписанию изготовителя. Антитело А 20/44 адсорбируется на полученной таким образом колонке после нанесения на нее 100 мл сыворотки трансгенной свиньи, затем его элюируют и идентифицируют, Оно по всем своим свойствам соответствует выделенному из асцитной жидкости антителу А 20/44.Плазмиды рГСН 1 М и ркарра СН 1 М, описанные в Европейской патентной заявке 0 460 674,содержат последовательности ДНК, кодирующие легкие(1) или тяжелые (у) цепи Моноклонапьного антитела С 10/ 179, направленного против ать-цепочки рецептора интерлейкина-2.