Способ комбинированной соно-фотодинамической терапии опухоли саркомы М-1 у крысы в эксперименте

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КОМБИНИРОВАННОЙ СОНО-ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ ОПУХОЛИ САРКОМЫ М-1 У КРЫСЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.Александрова(72) Авторы Истомин Юрий Петрович Александрова Елена Николаевна Чалов Вадим Николаевич Церковский Дмитрий Александрович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н.Александрова(56).. 2009. - . 4. - Р. 179-193. СПИЧЕНКОВА И.С. Сочетанная фотодинамическая и рентгенотерапия саркомы М 1 Автореф. дис. - Обнинск,2005. - С. 3-11, 22-23. СЫРЧИКОВА Е.А. и др. Сибирский онкологический журнал. - 2008. Приложение 1. - С. 126-127. МИХАЙЛОВСКАЯ А.А. и др. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2009. - Т. 147. -1. - С. 9598. БУРМИСТРОВА Н.В. Фотодинамическая терапия саркомы М-1 с фотосенсибилизаторами Фотогем, Фотосенс,Фотодитазин Автореф. дис. - Обнинск, 2005. - С. 4-7, 10-11, 21.(57) Способ комбинированной соно-фотодинамической терапии опухоли саркомы М-1 у крысы в эксперименте, отличающийся тем, что крысе однократно вводят фотосенсибилизатор на основе хлорина е 6 и низкомолекулярного поливинилпирролидона в дозе 2,5 мг/кг массы внутривенно, непосредственно после введения фотосенсибилизатора воздействуют на опухоль ультразвуком с частотой 880 кГц в непрерывном режиме интенсивностью 0,7 Вт/см 2 в течение 10 мин и через 3 ч проводят лазерное облучение опухоли экспозиционной дозой 50-100 Дж/см 2 при длине волны 670 нм, выходной мощности 0,491 Вт,плотности потока мощности излучения 0,28 Вт/см 2 и диаметре светового пятна 1,0-1,5 см. Изобретение относится к медицине, в частности к экспериментальной онкологии, а именно к комбинированной соно-фотодинамической терапии перевитой под кожу саркомы -1 у крысы, и предназначено для высокоэффективного разрушения опухоли. Способ соно-фотодинамической терапии характеризуется селективным и органощадящим действием, что позволяет использовать его в случаях, когда другие способы неэффективны или противопоказаны, характеризуется высокой эффективностью и практически не имеет противопоказаний. 17355 1 2013.08.30 Известен способ сонодинамической терапии с предварительным введением в основание опухоли пирогенала в дозе 40-1000 мкг/см 2 с регистрацией температуры опухоли до достижения стойкой гиперемии опухолевой ткани в течение 12-24 ч с последующим нанесением на опухоль композиции, содержащей 3-10 мг фотосенсибилизатора Фотосенс, геля Ультрамикс и 20-200 мкг пирогенала 1. Далее проводят воздействие ультразвуком с интенсивностью 0,2-0,4 Вт/см 2, лабильно, непрерывно в течение 5-8 мин. После этого композицию оставляют на коже на 1-2 ч. Затем проводят сеанс фотодинамической терапии (ФДТ) равномерно по всей площади опухоли, всего на курс 3-5 процедур. Предложенный способ обеспечивает пролонгированное поддержание оптимальной дозы фотосенсибилизатора (ФС) в опухоли, достаточной для эффективного действия ФДТ. Однако известный способ при своем использовании имеет следующие недостатки накопление ФС в здоровых тканях организма, что приводит к развитию фототоксической реакции кожных покровов при воздействии солнечного света, нарушению функциональной активности органов с высокой метаболической активностью длительный период выведения ФС из организма, что приводит к возникновению частых побочных реакций риск инфицирования сложность использования и значительная продолжительность сроков терапии. Наиболее близким, принятым за прототип, является способ комбинированной соно- и фотодинамической терапии с сублингвальным введением фотосенсибилизатора, представляющего собой металлокомплексное производное хлорина, -1 2. Работа выполнена на крысах с перевитой экспериментальной опухолью -180 . Фотооблучение опухолей крыс, которым сублингвально в течение 2-5 ч вводили 1, проводили через 48 ч после введения препарата при длинах волн излучения 660 и 940 нм(30 нм). Сонодинамическое воздействие производили с интенсивностью 0,3-1,2 Вт/см 2 и частотой 1,0 мГц. Соно- и фотодинамическое воздействие производили в течение 3 дней. Осуществляли динамическое наблюдение за животными, оценивали процент торможения роста опухоли и производили гистологическое исследование опухолей, подвергнутых воздействиям. Однако известный, принятый за прототип, способ обладает рядом недостатков, таких как сложность схемы использования, сублингвальное введение фотосенсибилизаторов(ФС) и низкая эффективность компонентов в качестве монотерапии. Задача, на решение которой направлено изобретение, заключается в повышении эффективности комбинированного лечения перевитой под кожу саркомы -1 у крысы путем увеличения глубины возникающих некрозов за счет суммирования противоопухолевых эффектов каждого из компонентов способа лечения. Поставленная задача решается за счет того, что в предлагаемом способе комбинированного лечения экспериментальной опухоли саркомы -1 крысе внутривенно однократно вводят фотосенсибилизатор на основе порфиринов 3, содержащий в качестве основного действующего вещества хлорин е 6 и низкомолекулярный медицинский поливинилпирролидон, в дозе 2,5 мг/кг массы тела животного, непосредственно после внутривенного введения фотосенсибилизатора экспериментальную опухоль облучают ультразвуком в непрерывном режиме с частотой 880 кГц, интенсивностью 0,7 Вт/см 2 в течение 10 мин, через 3 ч проводят дополнительное лазерное облучение опухоли экспозиционной дозой 50-100 Дж/см 2 при длине волны 670 нм, мощности излучения на выходе 0,491 Вт, плотности потока мощности излучения 0,28 Вт/см 2 и диаметре светового пятна 1,0-1,5 см. Способ осуществляется следующим образом. Белой беспородной крысе выполняют перевивку опухоли -1 (саркома -1), закупленную в банке опухолевых штаммов ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Опухоль перевивают подкожно, в левую паховую область путем введения 0,5 мл 10 опухолевой 2 17355 1 2013.08.30 взвеси в растворе Хенкса. Животное берут в эксперимент через 9-11 дней по достижению размеров опухоли 1,5-2,0 см в диаметре. Все манипуляции на животном осуществляют после введения последнего в состояние нейролептоаналгезии (0,25 раствор дроперидола и 0,005 раствор фентанила в соотношении 21 по 0,3 мл на 100 г массы животного,внутримышечно). Все животные (10 белых беспородных крыс, весом 18020 г, разводки вивария РНПЦ ОМР им. Н.Н. Александрова) распределены на 2 группы в зависимости от параметров ультразвукового и фотодинамического облучения опухоли. Наркотизированную крысу с перевитой опухолью -1 фиксируют, депилируют шерсть над опухолью и внутривенно вводят фотосенсибилизатор на основе хлорина е 6 и низкомолекулярного поливинилпирролидона в дозе 2,5 мг/кг. Сеанс ультразвукового облучения (аппарат УЗТ 1.04-0 с излучателем площадью 1,0 2 смРоссия) проводят непосредственно после введения ФС ультразвуком частотой 880 кГц при интенсивности 0,7 Вт/см 2 в течение 10 мин в непрерывном режиме. Фотооблучение опухоли осуществляют через 3 ч с использованием лазерного аппарата-680-2000 (Биоспек) экспозиционной дозой 50-100 Дж/см 2 при длине волны 670 нм,мощности излучения на выходе 0,491 Вт, плотности потока мощности излучения 0,28 Вт/см 2 и диаметре светового пятна 1,0-1,5 см. В контрольной группе ФС вводят без последующего облучения опухоли ультразвуком,но с фотодинамическим воздействием в экспозиционных дозах 50 и 100 Дж/см 2. Через 24 ч после облучения наркотизированной крысе проводят витальное окрашивание синьки Эванса. Для этого в хвостовую вену крысы вводят 1 раствор синьки Эванса из расчета 1 мл на 100 г. Умерщвление животного осуществляют с помощью общепринятого метода эвтаназии. Опухоль иссекают, фиксируют в 10 растворе формалина и делают поперечные срезы по наибольшему диаметру новообразования. Срезы регистрируют цифровой камерой, сопряженной с компьютером. Расчет площади некрозов опухоли проводят с помощью компьютерных программ. Наибольший процент площади некроза опухоли -1 крысы наблюдается при введении ФС в дозе 2,5 мг/кг массы тела животного с последующим проведением ультразвукового облучения с интенсивностью 0,7 Вт/см 2 в течение 10 мин непосредственно после введения препарата и фотооблучением опухоли в экспозиционных дозах 50 и 100 Дж/см 2 при длине волны лазера 670 нм, мощности излучения на выходе 0,491 Вт, плотности потока мощности излучения 0,28 Вт/см 2 и диаметре светового пятна 1,0-1,5 см через 3 ч после введения Фотолона (фиг. 1, 2). На фиг. 1 и 2 отмечена зависимость возникновения площадей некрозов экспериментальной опухоли саркомы -1 от экспозиционной дозы света. При дозе 50 Дж/см 2 данный показатель составляет 94,3 , при 100 Дж/см 2 100 . Отличительными признаками от прототипа являются внутривенное введение фотосенсибилизатора на основе порфиринов, содержащего в качестве основного действующего вещества хлорин е 6 и поливинилпирролидон низкомолекулярный медицинский, в дозе 2,5 мг/кг проведение ультразвукового облучения опухоли с интенсивностью 0,7 Вт/см 2, частотой 880 кГц и длительностью сеанса 10 мин фотооблучение опухоли в экспозиционных дозах 50 и 100 Дж/см 2 при длине волны лазера 670 нм, мощности излучения на выходе 0,491 Вт, плотности потока мощности излучения 0,28 Вт/см 2 и диаметре светового пятна 1,5 см. Техническим результатом является создание эффективной концентрации ФС в опухолевой ткани и существенное повышение эффективности комбинированной терапии при минимальном риске возникновения побочных реакций. Предлагаемый способ позволяет направленно воздействовать на опухолевый очаг. Облучение накопившегося в ткани опухоли ФС ультразвуком соответствующих параметров приводит к его активации, вызывая 3 17355 1 2013.08.30 индуцированную фотохимическую реакцию с образованием синглетного кислорода, обладающего высокой окислительной способностью. Одним из механизмов, обуславливающих механические, физико-химические и термические нарушения в опухолевой ткани, является эффект кавитации. Пример 1. Лабораторной крысе массой 190 г с перевитой опухолью -1 (1,8 см в диаметре) после введения в состояние нейролептоаналгезии и фиксации выполнили депиляцию шерсти над опухолью. В хвостовую вену через тонкий катетер ввели фотосенсибилизатор на основе хлорина е 6 и низкомолекулярного поливинилпирролидона в дозе 2,5 мг/кг. Непосредственно после введения ФС осуществлено облучение экспериментальной опухоли ультразвуком с интенсивностью ультразвука 0,7 Вт/см 2, частотой 880 кГц и длительностью воздействия 10 мин. Через 3 ч проведен сеанс фотодинамической терапии в экспозиционной дозе 50 Дж/см 2 при длине волны 670 нм, мощности излучения на выходе 0,491 Вт,плотности потока мощности излучения 0,28 Вт/см 2 и диаметре светового пятна 1,0 см в течение 3 мин. Через 24 ч после облучения в хвостовую вену крысы ввели 1 раствор синьки Эванса из расчета 1,0 мл на 100 г массы тела животного. Умерщвление осуществили спустя 2 ч,прибегнув к общепринятому методу эвтаназии (хлороформ). Опухоль иссекли, в течение 2 ч зафиксировали в 10 растворе формалина и сделали поперечные срезы по наибольшему диаметру новообразования. Срезы зафиксировали цифровой камерой, сопряженной с компьютером. Расчет площади некрозов опухоли осуществляли с использованием специальной компьютерной программы. Площадь гистотопографического среза опухоли -1 - 1,12 см 2, площадь некроза опухоли - 1,06 см 2, процент площади некроза опухоли - 94,31,32(фиг. 1). Пример 2. Лабораторной крысе массой 185 г с перевитой опухолью -1 (2,1 см в диаметре) после введения в состояние нейролептоаналгезии и фиксации выполнили депиляцию шерсти над опухолью. В хвостовую вену через тонкий катетер ввели фотосенсибилизатор на основе хлорина е 6 и низкомолекулярного поливинилпирролидона в дозе 2,5 мг/кг. Непосредственно после введения ФС осуществлено облучение экспериментальной опухоли ультразвуком с интенсивностью ультразвука 0,7 Вт/см 2, частотой 880 кГц и длительностью воздействия 10 мин. Через 3 ч проведен сеанс фотодинамической терапии в экспозиционной дозе 100 Дж/см 2 при длине волны 670 нм, мощности излучения на выходе 0,491 Вт,плотности потока мощности излучения 0,28 Вт/см 2 и диаметре светового пятна 1,5 см в течение 6 мин. Через 24 часа после облучения в хвостовую вену крысы ввели 1 раствор синьки Эванса из расчета 1,0 мл на 100 г массы тела животного. Умерщвление осуществили спустя 2 ч, прибегнув к общепринятому методу эвтаназии (хлороформ). Опухоль иссекли, в течение 2 ч зафиксировали в 10 растворе формалина и сделали поперечные срезы по наибольшему диаметру новообразования. Срезы зафиксировали цифровой камерой, сопряженной с компьютером. Расчет площади некрозов опухоли осуществляли с использованием специальной компьютерной программы. Площадь гистотопографического среза опухоли -1 - 1,25 см 2, площадь некроза опухоли - 1,25 см 2, процент площади некроза опухоли - 100(фиг. 2). Таким образом, предлагаемый способ комбинированной соно-фотодинамической терапии опухоли саркомы -1 у крысы позволяет существенно повысить эффективность лечения за счет значительного увеличения площади и глубины развившихся некрозов. 17355 1 2013.08.30 Источники информации 1. Патент РФ на изобретение 2300403, МПК 615/067, 617/02, 6131/739,6131/409, 619/06, 6135/00, 2006. 2.,,.-1154. -. - 2009. - о. 4. - . 179-193 (прототип). 3.5651, МПК 6131/409, 6135/02. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5