Способ отбора семян рапса для селекции

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОТБОРА СЕМЯН РАПСА ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф.Купревича Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Домаш Валентина Иосифовна Пилюк Ядвига Эдвардовна Зеленяк Вадим Вадимович Шарпио Тамара Петровна Забрейко Светлана Алексеевна Безлюдный Виктор Николаевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф.Купревича Национальной академии наук Беларуси(57) Способ отбора семян рапса для селекции, заключающийся в том, что пробу семян измельчают в муку, которую экстрагируют трис- буфером,7,0, содержащим сахарозу в концентрации 0,25 М, этилендиаминтетрауксусную кислоту в концентрации 2,0 М и аскорбат натрия в концентрации 0,01 М, при соотношении мука и буфер 110, в течение 2-2,5 ч при температуре 20-23 С, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15-20 мин, полученный экстракт белка подвергают денатурации путем кипячения в течение 2-3 мин в 100 мМ трис- буфере,6,8, содержащем 2 додецилсульфата натрия и 5-меркаптоэтанола, центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин, раствор наносят на пластинку,содержащую 15 -ный полиакриламидный гель, которую помещают в 0,05 М трисглициновый буфер,8,3, через который пропускают электрический ток силой 10-20 мА 17675 1 2013.10.30 и напряжением 120 Вт в течение 1,5-2,0 ч, затем пластинку окрашивают 0,15 -ным раствором кумасси -250 в 20 -ном этаноле и 10 -ной уксусной кислоте, отмывают от красителя в 20 -ном этаноле и 10 -ной уксусной кислоте, анализируют полученный полипептидный электрофоретический спектр белков семян рапса и при отсутствии полипептида в области 66 кДа делают вывод о пригодности семян для селекции, а при наличии полипептида в области 66 кДа делают вывод о непригодности семян рапса для селекции. Изобретение относится к биохимии растений и сельскому хозяйству, а именно к способу отбора семян рапса по содержанию глюкозинолатов для использования в селекции растений при создании низкоглюкозинолатных сортов рапса. В семенах рапса присутствуют антипитательные вещества глюкозинолаты, токсическое соединение серы, содержание которых в зависимости от сорта варьируется в пределах 0,5-6,0 . При определенных условиях глюкозинолаты расщепляются с образованием ряда соединений, обладающих разными физиологическими свойствами, вплоть до токсических. Например, глюкозинолаты вызывают раздражение слизистой оболочки, обладают слабой антибиотической активностью, подавляют деятельность щитовидной железы. Их количество, переходящее в масло, в значительной степени зависит не только от исходного содержания в семенах, но и от технологии их переработки. Известен способ отбора семян рапса по содержанию глюкозинолатов, включающий отбор семян рапса, их измельчение, извлечение из измельченных семян петролейным эфиром масла, обезжиренную муку помещают в кипящую водяную баню на 5 мин, после центрифугирования супернатант хроматографируют на колонке с ДЕАЕ-сефарозой А-25,которую промывают 0,5 М ацетатом пиридина и используют для газожидкостной хроматографии. Определение содержания глюкозинолатов проводят по площади пиков. Недостатками данного способа являются длительность и очень сложная подготовка пробы, требующая большого количества химических реактивов 1. Известен способ отбора семян рапса, основанный на гидролизе глюкозинолатов концентрированной щелочью с образованием сульфида. Сероводород, выделяющийся при взаимодействии сульфида с концентрированной соляной кислотой, отгоняют с паром,улавливают и определяют количество йодометрическим способом. По количеству выделенной с сероводородом серы рассчитывают содержание глюкозинолатов в семенах рапса. Недостатком данного способа является необходимость работы с использованием вредных и опасных реактивов, например концентрированной соляной кислоты и щелочи 2. Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ отбора пробы для селекции низкоглюкозинолатных семян рапса, ее экстрагирования буфером при 7,0 в присутствии аскорбиновой кислоты, центрифугирования раствора, определения глюкозинолатов методом, основанным на полуколичественном (по цветной шкале) расчете глюкозы, образующейся при ферментативном распаде глюкозинолатов ортотолуидиновым реактивом. Но данный способ требует вредных реактивов и является приблизительным 3. Задачей настоящего изобретения является разработка способа, повышение точности и ускорение отбора семян рапса на присутствие глюкозинолатов для дальнейшего использования семян для селекции. Способ отбора семян рапса для селекции заключается в том, что пробу семян измельчают в муку, которую экстрагируют трисбуфером,7,0, содержащим сахарозу в концентрации 0,25 М, этилендиаминтетрауксусную кислоту в концентрации 2,0 М и аскорбат натрия в концентрации 0,01 М, при соотношении мука и буфер 110, в течение 2-2,5 ч при температуре 20-23 С, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15-20 мин, полученный экстракт белка подвергают денатурации путем кипячения в течение 2-3 мин в 100 мМ трис- буфере,6,8,содержащем 2 -ный раствор додецилсульфата натрия и 5-меркапто 2 17675 1 2013.10.30 этанола, центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин, раствор наносят на пластинку,содержащую 15 -ный полиакриламидный гель, которую помещают в 0,05 М трис-глициновый буфер,8,3, через который пропускают электрический ток силой 10-20 мА и напряжением 120 Вт в течение 1,5-2 ч, затем пластинку окрашивают 0,15 -ным раствором кумасси -250 в 20 -ном этаноле и 10 -ной уксусной кислоте, отмывают от красителя в 20 -ном этаноле и 10 -ной уксусной кислоте, анализируют полученный полипептидный электрофоретический спектр белков семян рапса и при отсутствии полипептида в области 66 кДа делают вывод о пригодности семян для селекции, а при наличии полипептида в области 66 кДа делают вывод о непригодности семян рапса для селекции. Благодаря совокупности заявленных признаков возможно достижение более высокой эффективности отбора за счет возможности целенаправленного выделения образцов рапса с генетически обусловленным более низким содержанием глюкозинолатов. Заявляемый способ поясняется фигурой, где 1 - пластинка, на которой размещен слой геля 2 и имеется ячейка 3, в которой размещены белки-маркеры 4, имеющие разную молекулярную массу, обозначенную на шкале 5. Пластинка 1 снабжена шкалой 6, на которой размещены лунки 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 и 14 с обозначением молекулярной массы полипептидов семян рапса с различным содержанием глюкозинолатов. Пример. Пробу семян рапса измельчают в муку, экстрагируют трис- буфером,7,0, содержащим сахарозу в концентрации 0,25 М, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) в концентрации 2,0 М и аскорбат натрия в концентрации 0,01 М, при соотношении мука и буфер 110, в течение 2-2,5 ч при температуре 20-23 С, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 15-20 мин и получают прозрачный экстракт белка, который денатурируют путем кипячения в течение 2-3 мин в 100 мМ трис- буфере,6,8, содержащем 2 -ный раствор додецилсульфата натрия и 5 -ный раствор -меркаптоэтанола. Раствор центрифугируют в течение 5 мин при 3000 об/мин. Электрофорез белков семян рапса проводят,например, на приборе -250(Англия). Для этого раствор белка 40-50 мкл(10-15 мкг) вносят в лунки (ячейки) стеклянной пластинки, содержащей 15 -ный полиакриламидный гель, которую помещают в 0,05 М трис-глициновый буфер,8,3, через которую пропускают электрический ток силой 10-20 мА и напряжением 120 Вт в течение 1,5-2 ч. Гелевую пластинку окрашивают 0,15 -ным раствором кумасси -250 в 20 -ном этаноле и 10 -ной уксусной кислоте. После этого гель отмывают от красителя в 20 -ном этаноле и 10 -ной уксусной кислоте и получают полипептидный электрофоретический спектр белков семян рапса, различных по содержанию глюкозинолатов, который анализируют и при отсутствии полипептида в области 66 кДа делают вывод о пригодности семян для селекции, а при наличии полипептида в области 66 кДа судят делают вывод о непригодности семян рапса для селекции. Так, в лунке 7 - образец, содержащий 10,9 мкМ/г, в лунке 8 - 10,1 мкМ/г, в лунке 9 9,9 мкМ/г, в лунке 10 - 11,8 мкМ/г, в лунке 11 - 13 мкМ /г, в лунке 12 - 7,6 мкМ/г, в лунке 13 14,2 мкМ/г, в лунке 14 - 15,1 мкМ/г глюкозинолатов. Способ дает возможность использовать небольшое количество семян и проводить анализ сразу 10 образцов. Использование предложенного способа отбора семян рапса с низким содержанием глюкозинолатов для селекции обеспечивает ускорение процесса за счет целенаправленного выделения образцов рапса с генетически обусловленным меньшим содержанием глюкозинолатов. Источники информации 1..,.,.. .-//. - 2005.- . 38. - . 343-353. 3 17675 1 2013.10.30 2. А.с. СССР 1406481, 1988. 3. Демьянчук Г.Т. Метод массового отбора низкогликозинолатных семян // Масличные культуры. - 1985. -3. - С. 34 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4