Аллерген для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота, способ его получения и способ использования

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ АЛЛЕРГЕН ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГИПОДЕРМАТОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И СПОСОБ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(72) Авторы Степанова Елена Анатольевна Якубовский Мирослав Викторович Лысенко Александр Павлович(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н. Вышелесского(56) СТЕПАНОВА Е.А. Иммунодиагностика, эпизоотология и ранняя профилактика гиподерматоза крупного рогатого скота Автореф. дис.- Минск, 2004.- С. 5-6, 8-9.2204383 1, 2003.2121831 С 1, 1998.(57) 1. Аллерген для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота, содержащий водорастворимые белки личинок 2-3 стадий в количестве 0,8-0,9 мг на 1 мл раствора, содержащего 0,3-0,4 г фенола и физиологический раствор до 100 мл. 2. Способ получения аллергена по п. 1, заключающийся в том, что отмывают личинки 2-3 стадий физиологическим раствором, механически гомогенизируют,гомогенат в физиологическом растворе, содержащем 0,350,05 фенола, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют при 5000 в течение 20 мин, фильтруют через полупроницаемый мембранный фильтр из пленочного материала на основе смеси ацетатов целлюлозы с общей пористостью 80-85 и размером пор 4,0-4,5 мкм и разводят физиологическим раствором, содержащим фенол, до концентрации белков 0,8-0,9 мг/мл. 3. Способ диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота с использованием аллергена по п. 1, заключающийся в том, что аллерген вводят внутрикожно в среднюю треть шеи в дозе 0,2 мл однократно, причем диагностируют гиподерматоз при выявлении утолщения кожной складки на месте введения аллергена на 2 мм или более через 24 ч. Изобретение относится к области ветеринарной паразитологии, в частности к ранней иммунодиагностике гиподерматоза крупного рогатого скота. Установлено, что заболевание крупного рогатого скота гиподерматозом имеет два этапа бессимптомный (с момента заражения до появления свищей и желваков) и период выраженных клинических признаков (с момента образования желваков и свищей до выпадения личинок из тела животного) 1. 12492 1 2009.10.30 Первоначально диагноз ставят в период проявления клинических признаков гиподерматоза на основании осмотра и пальпации (прощупывания) кожи животного в местах скопления личинок 2-й и 3-й стадий на всем протяжении спины от холки до крестца и выявления желваков и отверстий (до 3 мм в диаметре) в коже, выделения экссудата, заметным дыхальцам личинок 2. Однако этот способ имеет ряд недостатков. Так, например, не позволяет диагностировать болезнь на первых этапах заражения, потому что личинки подкожного овода ( ) находятся в организме животного в течение 8-9 месяцев (после откладывания подкожным оводом яиц на шерсть животного) и они могут быть выявлены при визуальном осмотре животного только в последние 1-2 месяца своего цикла. Кроме того, этот способ нельзя использовать для постановки диагноза на гиподерматоз всему стаду одновременно, так как заболевание не проявляется у всех животных в одно и то же время. В связи с тем, что невозможно выявить больных животных на ранних стадиях заболевания,приходится применять лечебно-профилактические обработки ко всем животным, что увеличивает расход препаратов и повышает в связи с этим себестоимость сельскохозяйственной продукции. Более перспективными считаются направления по выявлению животных на начальных стадиях развития личинок подкожного овода с помощью аллергена, содержащего белок личинок подкожного овода. Известен аллерген, содержащий белок личинок подкожного овода ( ),применяемый для диагностики гиподерматоза в реакции двойной диффузии в агаровом геле по Оухтерлони 3. Но недостатком данного аллергена является то, что полученный аллерген при применении его для диагностики гиподерматоза оказался слабоэффективным. При использовании полученного аллергена результаты исследований оказались отрицательными, а для получения выраженной реакции необходимо подвергать испытуемые сыворотки животных концентрированию в 4-5 раз путем выветривания (сушка при комнатной температуре), что неприемлемо для использования аллергена в производственных условиях 4. Ближайшим аналогом, т.е. прототипом, можно считать аллерген для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота, содержащий все белки, входящие в состав личинок подкожного овода ( ) 2-3 стадий (как водорастворимые, так и не водорастворимые), фенол, растворитель - дистиллированную воду 5. Недостатком данного аллергена является то, что содержание белков личинок подкожного овода -стадий составляет 1-1,2 мг/мл, что требует значительного количества личинок для получения больших объемов аллергена, сбор которых является трудоемким в силу их незначительного размера. Также в состав аллергена (для стабилизации его) добавляется фенол до 0,5(максимально допустимая концентрация). Фенол является токсичным веществом, обладает тератогенными и канцерогенными свойствами. Известны различные способы получения аллергена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота. При получении аллергена, применяемого для диагностики гиподерматоза в реакции двойной диффузии в агаровом геле по Оухтерлони, используется экстракт личинок подкожного овода 6. Но недостатком данного аллергена является то, что полученный аллерген при применении его для диагностики гиподерматоза оказался слабоэффективным, что связано с отсутствием очистки полученного экстракта. Также аллерген, приготовленный из личинок-ей стадии, является низкоэффективным и выявляет только 75,4-83,9 инвазированных животных. Более эффективным является применение аллергена из личинокстадии, однако сбор личинок -ой стадии является проблематичным, так как они располагаются в спинномозговом канале и имеют незначительные размеры 0,6-5,0 мм, что делает практи 2 12492 1 2009.10.30 чески невозможным сбор необходимого количества личинок для диагностики животных хотя бы 1-ого хозяйства (несколько тысяч животных). Ближайшим аналогом, т.е. прототипом, можно считать способ получения аллергена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота путем отмывания личинок 2-3 стадий физиологическим раствором, механической гомогенизацией с последующим центрифугированием и ультразвуковой дезинтеграцией 7. Недостатком данного способа получения аллергена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота является то, что в связи с высоким содержанием белка (1-1,2 мг/мл) (как водорастворимых, так и не водорастворимых) для его изготовления требуется значительное количество личинок, сбор которых является трудоемким в силу их незначительного размера. Для стабилизации аллергена используется фенол в максимально допустимой концентрации (до 0,5 ). Фенол является токсичным веществом, обладает тератогенными и канцерогенными свойствами. Стоит отметить, что указанный способ получения аллергена не позволяет получить достаточно очищенный гомогенат и содержит все белки, находящиеся в личинке подкожного овода, а также частицы низкой плотности,которые не полностью удаляются центрифугированием, что также снижает его диагностическую эффективность. Известными способами получить предлагаемый аллерген для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота нельзя. Известны различные способы применения аллергена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота. Известен способ применения аллергена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота путем выявления антител в сыворотке крови пораженных гиподерматозом животных - в реакции двойной диффузии в агаровом геле по Оухтерлони 8. Сущность реакции двойной диффузии в агаровом геле по Оухтерлони заключается в том, что специфические антигены (подкожного овода) и антитела (исследуемых сывороток крови животных, инвазированных личинками подкожного овода) диффундируют в геле агара из мест локализации навстречу друг другу и, взаимодействуя, образуют полосы преципитации (комплекс антиген-антитело), которые хорошо видны на фоне прозрачного геля 9. Для чего расплавленный агаровый гель в количестве 25 мл наливают в чашку Петри,после застывания нарезают с помощью стандартного штампа в агаре лунки. Аллерген вносят в центральные лунки, положительную контрольную сыворотку, заливают через одну в периферические лунки, а в оставшиеся лунки - сыворотку крови заведомо здоровых животных. Чашки закрывают крышкой, инкубируют при температуре от 18 до 26 С в эксикаторе в течение 72 ч. Учет реакции проводят в проходящем луче света осветителя 10. В геле должны сформироваться 1-2 линии преципитации с положительной контрольной сывороткой, расположенные на равном расстоянии между центральной и периферическими лунками. Линии преципитации не должны образовываться возле лунок с сыворотками крови здоровых животных 11. Но недостатком данного способа является необходимость использования сывороток крови обследуемых животных. Взятие крови требует дополнительных людских затрат, необходимых для фиксации животных. Также эта процедура оказывает негативное действие на самих животных, способствуя возникновению стресса, что приводит у них к снижению продуктивности. Недостатком данного способа также является его не достаточно высокая эффективность, которая составляет около 88,8 . Также известен способ диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью реакции непрямой гемагглютинации 12, 13. 12492 1 2009.10.30 Принцип данного способа основан на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, способны аглютинироваться в присутствии гомологичных антител или антигенов 14. Для чего получают суспензию эритроцитов барана, отмывают физ. раствором, стабилизируют их 3 раствором формалина, танизируют раствором танина для повышения сорбционной способности и осаждаемости, сенсибилизируют раствором антигена 15 15. Исследуемые сыворотки разводят (начиная с разведения 1200) нормальной кроличьей сывороткой, разведенной фосфатно-солевым буфером, и вносят по 0,5 мл каждого разведения в луночки пластин, добавляют 1-2 капли диагностикума. Реакцию учитывают спустя 18-20 ч по характеру осадка на дне лунок 16. Однако описанный способ подготовки сенсибилизированных эритроцитов и других компонентов для реакции непрямой гемагглютинации трудоемок. Недостатком данного способа, несмотря на его достаточно высокую эффективность (98,5-100 ), также является необходимость использования сывороток крови обследуемых животных. Мероприятие,связанное с взятием крови от исследуемых животных, требует дополнительных людских затра, необходимых для фиксации крупного рогатого скота. Взятие крови оказывает негативное действие на самих животных, способствуя возникновению стресса, что приводит у них к снижению продуктивности. Ближайшим аналогом, т.е. прототипом, можно считать способ использования аллергена во внутрикожной аллергической реакции с выявлением положительно реагирующих животных спустя 48 ч 17. Способ аллергической диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота основан на возникновении у животных, инвазированных личинками подкожного овода, реакции гиперчувствительности замедленного типа на гиподерматозный антиген 18. На месте введения аллергена у инвазированных личинками подкожного овода животных развивается местная воспалительная реакция в виде плотной инфильтрации, клеточную основу которой составляют специфически взаимодействующие с антигеном лимфоциты и моноциты. Недостатком этого способа является то, что учет реакции производится через 48 ч после введения аллергена, что удлиняет процесс диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота. Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является создание дешевого, высокоэффективного аллергена, способа получения и применения его для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота, позволяющей диагностировать заболевание на начальных этапах развития заболевания. Поставленная задача достигается тем, что в аллергене для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота содержатся водорастворимые белки личинок 2-3 стадии в количестве 0,8-0,9 мг на 1 мл раствора, содержащего 0,3-0,4 г фенола и физиологический раствор до 100 мл. Кроме того, в способе получения аллергена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота, заключающемся в том, что отмывают личинки 2-3 стадий физиологическим раствором, механически гомогенизируют, гомогенат в физиологическом растворе, содержащем 0,350,05 фенола, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют при 5000 в течение 20 мин, фильтруют через полупроницаемый мембранный фильтр из пленочного материала на основе смеси ацетатов целлюлозы с общей пористостью 80-85 и с размером пор 4,0-4,5 мкм и разводят физиологическим раствором, содержащим фенол,до концентрации белков 0,8-0,9 мг/мл. И в способе диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота с использованием аллергена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота, заключающемся в том, что аллерген вводят внутрикожно в среднюю треть шеи в дозе 0,2 мл однократно, 4 12492 1 2009.10.30 причем диагностируют гиподерматоз при выявлении утолщения кожной складки на месте введения аллергена на 2 мм и более через 24 ч. Это позволяет за счет снижения содержания белка до 0,8-0,9 мг/мл снизить количество необходимых для приготовления аллергена личинок, сбор которых изза их малых размеров трудоемок, что позволяет снизить его стоимость, использование только водорастворимого белка позволяет не снизить эффективность полученного аллергена при снижении массовой доли белка. Применение в качестве растворителя физиологического (изотонического) раствора хлористого натрия позволило избежать осложнений у животных при введении аллергена, что также способствует повышению его эффективности. Снижение количества фенола до 0,3-0,4 позволяет получить более безопасный для животных аллерген, а значит и более эффективный, но в то же время снижение количества консервирующего вещества не снизило его физико-химические и биологические характеристики (стерильность, срок годности). Применение дополнительной очистки при получении аллергена- фильтрации на мембранном фильтре полупроницаемом из пленочного материала на основе ацетатов целлюлозы с общей пористостью 80-85 и с размером пор 4,0-4,5 мкм, позволило получить очищенный аллерген, содержащий только водорастворимые белки личинок. Именно использование фильтрации на пленочном материале на основе ацетатов целлюлозы с общей пористостью 80-85 и с размером пор 4,0-4,5 исключает из аллергена все остальные балансные белки, находящиеся в личинке подкожного овода, а также частицы низкой плотности, что также позволило повысить его диагностическую эффективность. Улучшенная очистка белка и возросшая его эффективность позволила сократить время диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота с применением аллергической пробы до 24 ч, что снижает экономические затраты на проведение диагностики этого заболевания и ускоряет процесс выявления больных животных. Для изготовления аллергена в качестве сырья используются личинки подкожного овода. Личинки подкожного овода являются промежуточной стадией метаморфоза имаго подкожного овода рода , отряда(двукрылые), подотряда(короткоусые) 19. Вылупившаяся из яйца личинкастадии проникает через волосяные фолликулы кожи хозяина в подкожную клетчатку. Затем личинки Н.мигрируют вдоль крупных сосудов и нервов к позвоночнику и через межпозвоночные отверстия попадают в жировую ткань спинномозгового канала. Общая продолжительность пребывания личинок в спинномозговом канале составляет 5-6 месяцев. По истечении этого времени личинки мигрируют в область спины и поясницы, где формируют соединительнотканные капсулы. Для дальнейшего развития они нуждаются в кислороде, для чего личинки образуют в коже свищевые отверстия. Через 1-8 дней после этого личинки линяют и переходят востадию 20. Личинкистадии крупнее (18-20 мм), на месте ротовых крючков у них небольшие пигментированные участки 21. Сроки и продолжительность развития личинок под кожей спины животных различны. Обычно через 3-4 недели личинкастадии совершает линьку и превращается в личинкустадии 22. Личинкистадии Н.в длину до 28 мм, более темного оттенка, тело массивное,продолговато-овальной формы. К концу созревания кутикула личинки утолщается и приобретает шероховатую поверхность 23. Созревшие личинкистадии через свищевые отверстия в коже выходят из капсулы и падают на землю, где во внешней среде происходит их окукливание. Выпавшие личинки малоактивны, окукливаются они в течение 1-2 и реже в течение 7 суток 24. По своим органолептическим, физико-химическим и биологическим показателям аллерген должен соответствовать требованиям и нормам, указанным в табл. 1. 5 12492 1 2009.10.30 Таблица 1 Наименование показателя Внешний вид, цвет, запах Характеристика и норма Опалесцирующая жидкость желтоватого цвета со слабым специфическим запахом, допускается осадок серо-коричневого цвета с различными оттенками,который легко разбивается при встряхивании 0,350,05 Стерилен Безвреден Объемная доля фенола,Стерильность Безвредность Содержание белка (водораствори 0,850,05 мого), мг/мл Отсутствие сенсибилизирующих Не обладает сенсибилизирующими свойствами свойств Специфичность Специфичен В качестве разбавителя используется физиологический (изотонический) раствор хлористого натрияс массовой долей 0,9- бесцветная прозрачная жидкость солоноватого вкуса, который получается растворением в мерной колбе с 100 мл дистиллированной воды - 0,9 г хлористого натрия, взвешенного с точностью до 0,1 мг 25. В качестве консервирующего вещества используется фенол, объемная доля которого не должна находиться в пределах 0,350,05 . Фенол (кислота карболовая кристаллическая) С 6 Н 6 О 6 представляет собой бесцветную кристаллическую массу со специфическим запахом. Растворы фенола оказывают сильное бактерицидное действие в отношении вегетативных форм микроорганизмов. В фармацевтической практике применяют фенол (0,5-0,1 ) для консервирования лекарственных веществ, сывороток, свечей и др. 26. Способ получения аллергена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота. Для приготовления аллергена личинки подкожного овода -ой и -ей стадий отмывают физиологическим раствором и механически гомогенизируют. Водорастворимые антигены личинок выделяют с помощью ультразвуковой дезинтеграции на УЗДН-1 при 35 кГц 20 мин и центрифугируют при 5000 в течение 20 мин с последующей фильтрацией на полупроницаемом мембранном фильтре из пленочного материала на основе ацетатов целлюлозы с общей пористостью 80-85 и с размером пор 4,0-4,5 мкм. Содержание белка в дезинтеграте доводят до 0,850,05 мг/мл физиологическим раствором, содержащим 0,350,05 фенола. Аллерген фасуют в стерильные стеклянные флаконы вместимостью 10,0 и 20,0 мл, которые укупоривают резиновыми пробками. Срок годности аллергена, 12 месяцев со дня изготовления при условии хранения его в темном месте при температуре от 0 до 10 С. Способ использования аллергена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота. Исследования животных на гиподерматоз с применением аллергической пробы проводят до обработки животных противооводовыми препаратами с начала сентября до конца октября. Место инъекции аллергена выстригают и обрабатывают 70 этиловым спиртом. Аллерген вводят крупному рогатому скоту внутрикожно в объеме 0,2 см 3 в среднюю треть шеи с использованием безыгольных инъекторов или шприцов вместимостью 1-2 см 3 и игл для внутрикожных инъекций. Учет реакции на внутрикожное введение аллергена проводят через 24 ч путем пальпации места инъекции и измерения толщины кожной складки с помощью кутиметра. Реагирующим считается животное с утолщением кожной складки на месте инъекции 2 мм и более. 6 12492 1 2009.10.30 Пример 1. Определение оптимального содержания белка в одной дозе аллергена определили при помощи аллергической внутрикожной реакции различных доз аллергена на крупном рогатом скоте. Для приготовления экспериментальных серий аллергена личинки подкожного овода-ой и -ей стадий отмывали физиологическим раствором и механически гомогенизировали. Водорастворимые антигены личинок выделяли с помощью ультразвуковой дезинтеграции на УЗДН-1 при 35 кГц 20 мин и центрифугированием при 5000 в течение 20 мин.) Был получен аллерген с концентрацией белка 0,50 мг/мл. Б) Был получен аллерген с концентрацией 1,20 мг/мл.) Был получен аллерген с концентрацией белка 0,80 мг/мл. Трем группам животных (по 5 голов в каждой) с клиническими признаками гиподерматоза крупного рогатого скота (наличие в области спины гиподерматозных желваков) вводили внутрикожно в среднюю треть шеи в дозе 0,2 мл аллерген из личинок подкожного овода с различной концентрацией белка. 1-ой опытной группе вводили аллерген с концентрацией белка 0,50 мг/мл. 2-ой опытной группе вводили аллерген с концентрацией белка 1,20 мг/мл. 3-ей опытной группе вводили аллерген с концентрацией белка 0,80 мг/мл. Проявление аллергической реакции во всех трех опытах учитывали через 12-24-36-4872 ч после инъекции путем измерения толщины кожной складки кутиметром и сравнения интенсивности реакции на аллерген. Положительная реакция характеризовалась мягкой болезненной припухлостью ткани,форма припухлости была почти круглая. Таблица 2 Результаты оценки активности аллергена с различными дозами белка в опыте на крупном рогатом скоте, пораженном личинками Н.Содержание Утолщение кожной складки, мм Доза белка Через Через Через мл/гол Через 12 ч. Через 36 ч. мг/мл 24 ч. 48 ч. 72 ч. 1 0,50 0,00 0,00 0,00 1,810,23 1,990,36 0,2 2 0,80 0,00 2,390,89 2,480,25 2,310,28 0,510,04 3 1,20 0,00 2,410,29 2,490,12 2,370,37 0,420,07 Как видно из табл. 2, при концентрации белка в аллергене 1,20 мг/мл (группа 2) положительная реакция на введение аллергена появлялась спустя 24 часа и выражалась утолщением кожной складки на 2,410,29 мм, достигая разницы в 2,490,12 мм к 36 ч. При концентрации белка 0,80 мг/мл (группа 3) реакция проявлялась утолщением кожной складки на 2,390,89 мм спустя 24 ч. При концентрации белка 0,50 мг/мл (группа 1) отмечалось утолщение кожной складки на 1,810,23 мм спустя 48 ч. По анализу результатов, полученных в вышеописанных экспериментах, пришли к заключению, что наиболее приемлемые результаты показал аллерген из личинок подкожного овода с концентрацией белка 0,80 мг/мл (группа 3), с наибольшей диагностической эффективностью через 24 ч после введения препарата. Пример 2. В целях изучения диагностических свойств аллергена с различной степенью очистки провели испытания их на крупном рогатом скоте с клиническими признаками гиподерматоза. Были получены три экспериментальные серии аллергена из личинок подкожного овода - -ей стадий. Для приготовления 1-ой экспериментальной серии аллергена личинки подкожного овода -ой и -ей стадий отмывали физиологическим раствором и механически гомогенизировали. Водорастворимые антигены личинок выделяли с помощью ультГруппа 12492 1 2009.10.30 развуковой дезинтеграции на УЗДН-1 при 35 кГц 20 мин и центрифугированием при 5000 в течение 20 мин с последующей фильтрацией на полупроницаемом мембранном фильтре из пленочного материала на основе ацетатов целлюлозы с общей пористостью 80-85 и с размером пор 2,0-3,0 мкм. Для приготовления 2-ой экспериментальной серии аллергена личинки обрабатывали, как и для приготовления 1-ой экспериментальной серии, только после центрифугирования фильтрацию повели на полупроницаемом мембранном фильтре из пленочного материала на основе ацетатов целлюлозы с общей пористостью 80-85 и с размером пор 3,1-3,9 мкм. Для приготовления 3-ей экспериментальной серии аллергена личинки обрабатывали аналогично, как и для приготовления 1-ой экспериментальной серии, только после центрифугирования фильтрацию повели на полупроницаемом мембранном фильтре из пленочного материала на основе ацетатов целлюлозы с общей пористостью 80-85 и с размером пор 4,0-4,5 мкм. В качестве контроля использовали аллерген, приготовленный без фильтрации на полупроницаемом мембранном фильтре. Концентрацию белка во всех 3-х экспериментальных и контрольной сериях аллергена доводили до 0,80 мг/мл. Для исследования диагностической эффективности экспериментальных серий аллергена были сформированы 3 опытные группы животных по 15 коров, пораженных личинками подкожного овода. Животным 1-ой опытной группы вводили аллерген 1-ой экспериментальной серии. Животным 2-ой опытной группы вводили аллерген 2-ой экспериментальной серии. Животным 3-ей опытной группы вводили аллерген 3-ей экспериментальной серии. В качестве контроля с противоположной стороны шей животным вводили аллерген,приготовленный без фильтрации на полупроницаемом мембранном фильтре. Аллерген вводили животным опытных групп в среднюю треть шеи в дозе 0,2 мл внутрикожно безыгольным инъектором однократно. Учет реакции проводили через 6-9-12-24-36-48-72 часа после инъекции путем измерения толщины кожной складки и сравнения интенсивности реакции на аллерген. Таблица 3 Результаты оценки активности аллергена из личинок подкожного овода с различнойстепенью очистки Утолщение кожной складки в месте инъекции, мм Серия аллергена Через Через Через Через Через Через 9 ч. Через 36 ч. 6 ч. 12 ч. 24 ч. 48 ч. 72 ч. 1-ая экспер. се 0,00 0,00 1,910,15 2,010,09 2350,17 2,140,18 0,470,04 рия 2-ая экспер. се 0,00 0,00 1,540,11 2,11031 2,290,85 2,170,56 0,520,51 рия 3-я экспер. се 0,00 0,910,11 2,150,54 3,560,81 2,480,52 2,160,41 0,91037 рия Контроль(без 0,00 0,00 0,00 2,390,89 2,480,25 2,310,28 0,510,04 очистки) Как видно из табл. 3, при введении 1-ой экспериментальной серии аллергена положительная реакция на введение аллергена появлялась спустя 12 ч и выражалась утолщением кожной складки на 1,910,15 мм, достигая разницы в 2,350,17 мм к 36 часам. При введении 2-ой экспериментальной серии аллергена положительная реакция на введение аллергена появлялась спустя 12 ч и выражалась утолщением кожной складки на 1,540,11 мм,достигая разницы в 2,290,85 мм к 36 ч. При введении 3-ей экспериментальной серии аллергена положительная реакция на введение аллергена появлялась спустя 9 часов и выра 8 12492 1 2009.10.30 жалась утолщением кожной складки на 0,910,11 мм, достигая разницы в 3,560,81 мм к 24 ч. При введении контрольной серии аллергена (без дополнительной очистки) положительная реакция на введение аллергена появлялась утолщением кожной складки на 2,390,89 мм спустя 24 ч. По анализу результатов, полученных в вышеописанном опыте, пришли к заключению,что наиболее приемлемые результаты показал аллерген из 3-ей экспериментальной серии(с дополнительной очисткой на полупроницаемом мембранном фильтре из пленочного материала на основе ацетатов целлюлозы с общей пористостью 80-85 и с размером пор 4,0-4,5 мкм) с наибольшей диагностической эффективностью через 24 ч после введения препарата. Пример 3. Провели изучение возможности снижения концентрации консервирующего вещества на сохранность аллергена, стерильность, срок его годности, токсических свойств. С этой целью приготовили аллерген, при изготовлении которого в качестве растворителя использовали физиологический раствор натрия хлористого, содержащего 0,350,05 фенола. Изучение токсических свойств диагностического препарата провели согласно Методическим указаниям по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве, изложенных в справочнике Ветеринарные препараты(1988) 27. При изучении острой токсичности установлено, что в течение 10 дней после однократного применения препарата падежа белых мышей и крыс не наблюдалось. В течение всего периода наблюдений животные всех групп были подвижны, поедали корм, состояние шерстного покрова, слизистых оболочек было в норме. Следовательно, препарат является нетоксичным. Отсутствие раздражающего действия препарата на слизистую конъюнктивы установили путем внесения 0,1 мл препарата. Покраснения, воспалений, отеков кожи не наблюдали. Безвредность аллергена определяли на 10 клинически здоровых белых мышах. Животным вводили подкожно в область паха по 0,05 см 3 препарата. За белыми мышами вели наблюдение в течение 1-2 дней. Препарат не вызывал гибели животных и на месте его введения не наблюдалась воспалительная реакция, следовательно, его можно считать безвредным. Аллергизирующим действием препарат не обладает. После применения препарата в разрешающей дозе покраснения и инфильтрации кожи не наблюдали. Определение срока годности приготовленных аллергенов определяли путем исследования сывороток крови иммунизированных бычков с аллергенами в РИД, которые хранили при различных температурах (при комнатной температуре (15 18 С) и в холодильнике (2 4 С. Результаты исследований показали, что образец, который хранили при комнатной температуре (15 18 С), сохраняет свою диагностическую эффективность в течение 1,5 месяцев. У образца, который поместили в холодильник(2 4 С), диагностическая эффективность сохранялась в течение 12 месяцев. Стерильность антигена исследовали путем посева на мясопептонный бульон и мясопептонный агар. Установлено, что рост микроорганизмов в исследуемых опытных образцах аллергена не был выявлен. Таким образом, установлено, что аллерген, при изготовлении которого в качестве растворителя использовали физиологический раствор натрия хлористого, содержащего 0,350,05 фенола, безвреден, не токсичен, не обладает раздражающим и аллергизирующим действием, стерилен. Срок годности аллергена - 12 месяцев со дня изготовления при условии хранения его в темном месте при температуре от 0 до 10 С. 9 12492 1 2009.10.30 Пример 4. Провели серию опытов для испытания полученного аллергена в качестве средства ранней диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота. В первом опыте первая (опытная) группа состояла из 82 животных, не обработанных с профилактической целью противооводовыми препаратами, а вторая (контрольная) группа включала 20 голов, обработанных препаратами против личинок подкожного овода, во втором опыте было использовано 100 и 54 голов соответственно. Производственные испытания аллергена были проведены в третьем опыте. Для опыта были подобраны две группы животных 351 коров, не обработанных препаратами против подкожного овода, и 46 животных, обработанных в сентябре-октябре года противооводовыми препаратами. Животным опытных групп ввели экспериментальную серию аллергена в среднюю треть шеи в дозе 0,2 мл внутрикожно безыгольным инъектором однократно. Учет реакции проводили через 3-6-9-12-24-48-72 ч после инъекции путем измерения толщины кожной складки и сравнения интенсивности реакции на аллерген. Положительная реакция характеризовалась мягкой, болезненной припухлостью, почти круглой формы диаметром 2,0 мм и более. Первое появление положительной реакции было зарегистрировано через 3 ч после введения, самое позднее через 72 ч. Сомнительная реакция на введение аллергена у животных сопровождалась утолщением кожной складки менее чем на 2 мм (в среднем 1-1,5 мм), которое исчезало в течение 24 ч. У животных с отрицательной реакцией припухлость на месте введения аллергена отсутствовала или она была незначительной (менее 1,0 мм). Максимальное количество положительно реагирующих животных с клинической формой гиподерматоза (100 от всех реагирующих) было выявлено через 24 ч после инъекции аллергена, причем в этом же интервале регистрировалось максимальное утолщение кожной складки (в среднем на 2,710,22 мм больше, чем до введения) в месте инъекции у большинства реагирующих животных. Совпадение результатов проведенной диагностической аллергической реакции с клиническими проявлениями заболевания гиподерматозом крупного рогатого скота у опытных и контрольных групп животных определяли весной следующего года. Наблюдения за животными обеих групп вели в период с марта по август. С момента образования желваков и до начала выпадения личинок животных осматривали раз в 5-10 дней. Анализируя данные, полученные в первом опыте, следует отметить, что все животные(77 голов), у которых осенью наблюдалась выраженная реакция (2 мм и более) на введение аллергена, оказались пораженными личинками подкожного овода весной с интенсивностью инвазии 4-18 личинок на животном. Тогда как из числа отрицательно прореагировавших было выявлено только 3 животных с личинками подкожного овода. В контрольной группе животных, пораженных личинками подкожного овода, выявлено не было. Таким образом, результаты внутрикожного исследования в первом опыте показали,что аллерген выявил 100 инвазированных животных, соответственно обладал чувствительностью - 96,25 и специфичностью -100 на ранних стадиях заболевания крупного рогатого скота гиподерматозом. Во втором опыте максимальное количество реагирующих животных при ранней осенней диагностике гиподерматоза крупного рогатого скота было выявлено через 24 часа после инъекции аллергена, причем утолщение кожной складки во втором опыте в этот период у них в среднем было на 3,3 0,2 мм больше в месте инъекции, чем до введения. По результатам второго опыта было установлено, что из 95 голов крупного рогатого скота, у которых наблюдалась выраженная реакция (2 мм и более) на введение аллергена осенью года, 92 животных оказались пораженными личинками подкожного овода весной,а у 3 из них личинки выявлены не были. Тогда как из числа отрицательно прореагировавших было выявлено только 1 животное с единичными личинками подкожного овода. 10 12492 1 2009.10.30 В контрольной группе животных, пораженных личинками подкожного овода, выявлено не было. Таким образом, результаты внутрикожного исследования во втором опыте показали,что аллерген обладал специфичностью - 96,7 и чувствительностью - 95,9 на ранних стадиях заболевания крупного рогатого скота гиподерматозом. Производственные испытания аллергена показали, что из 24 голов крупного рогатого скота, у которых осенью наблюдалась выраженная реакция (2 мм и более) на введение аллергена, 23 животных оказались пораженными личинками подкожного овода весной, а у 1 из них личинки выявлены не были. Тогда как в группе отрицательно прореагировавших было выявлено 1 животное с личинками подкожного овода. В контрольной группе животных (46 голов) личинки выявлены не были. Таким образом, в производственных испытаниях аллергический способ диагностики гиподерматоза показал чувствительность - 93,5 и специфичность 99,7 на ранних стадиях заболевания крупного рогатого скота гиподерматозом. Максимальное количество животных, положительно реагирующих во всех опытах,было выявлено через 24 ч после инъекции аллергена, причем в этом же интервале регистрировалось максимальное утолщение кожной складки (в среднем на 3,20,4 мм больше,чем до введения) в месте инъекции. Таким образом, средняя чувствительность аллергена на ранних стадиях гиподерматоза крупного рогатого скота по данным трех исследований составляет 98,51,2 , а специфичность - 95,51,9 . Экономический эффект от применения аллергена (в расчете на одну голову) рассчитывали по Методике определения экономической эффективности использования в сельском хозяйстве результатов научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ,новой техники, изобретений и рационализаторских предложений 26. Экономическая эффективность применения аллергена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота составляет 4,66 условных единиц на 1 условную единицу. Себестоимость одной дозы аллергена для выявления животных, инвазированных личинками подкожного овода, составляет 0,002 условные единицы. Таким образом, использование вышеуказанных компонентов в заявленных процентных соотношениях с дополнительной фильтрацией на мембранном фильтре полупроницаемом из пленочного материала на основе ацетатов целлюлозы с общей пористостью 8085 и с размером пор 4,0-4,5 мкм позволило создать высокоочищенный аллерген из личинок подкожного овода для ранней аллергической диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота. Аллерген из личинок подкожного овода предназначен для выявления животных, инвазированных личинкамина ранних стадиях развития заболевания. Способ аллергической диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота основан на возникновении у животных, инвазированных личинками подкожного овода, реакции гиперчувствительности замедленного типа на гиподерматозный антиген. Аллерген, описанный в примере 4, был испытан в производственных условиях для диагностики гиподерматоза и обладает чувствительностью - 93,5 и специфичностью 99,7 , что позволяет выявлять инвазированных личинками подкожного овода животных на ранних стадиях развития паразита, что позволяет более эффективно использовать препараты и исключить поголовную обработку животных против личинок подкожного овода. Источники информации 1. Ершов Антипин Д.Н., Золоторев Н.А., Саляев В.А. Ветеринарная энтомология. Паразитология и инвазионные болезни сельскохозяйственных животных / Под ред. 12492 1 2009.10.30 2. Ершов , Антипин Д.Н., Золоторев Н.А., Саляев В.А. Ветеринарная энтомология. Паразитология и инвазионные болезни сельскохозяйственных животных / Под ред. В.С. Ершова.- 3-е изд. испр. и доп.- М. Колос, 1964.- С. 318-319. 3. Калинина Н.Г. Динамика иммунобиологических реакций при гиподерматозе крупного рогатого скота. Науч.-технический бюлл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии.- Тюмень, 1978. Вып. 14.- С. 62-71. 4. Калинина Н.Г. Динамика иммунобиологических реакций при гиподерматозе крупного рогатого скота. Науч.-технический бюлл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии.- Тюмень, 1978. Вып. 14.- С. 62-71. 5. Степанова Е.А. Иммунодиагностика, эпизоотология и ранняя профилактика гиподерматоза крупного рогатого скота Автореф. дис.канд. вет. наук 03.00.19.- Минск,2004.- С. 5-6 (прототип). 6. Ямов В., Потемкин В., Калинина Н. Ранняя диагностика гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью реакции непрямой гемагглютинации. Науч.-технический бюлл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии.- Тюмень, 1976.- Вып. 7.- С. 45. 7. Степанова Е.А. Иммунодиагностика, эпизоотология и ранняя профилактика гиподерматоза крупного рогатого скота Автореф. дис.канд. вет. наук 03.00.19.- Минск,2004.- С. 5 (прототип). 8. Калинина Н.Г. Динамика иммунобиологических реакций при гиподерматозе крупного рогатого скота. Науч.-технический бюлл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии.- Тюмень, 1978.- Вып. 14.- С. 62-71. 9. Практикум по вирусологии / Под редакцией В.М. Жавненко.- Минск ДизайнПРО,1998.- С. 114. 10. Практикум по вирусологии / Под редакцией В.М. Жавненко.- Минск ДизайнПРО,1998.- С.116-117. 11. Практикум по вирусологии / Под редакцией В.М. Жавненко.- Минск ДизайнПРО,1998.- С. 119-121. 12. Ямов В., Потемкин В., Калинина Н. Ранняя диагностика гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью реакции непрямой гемагглютинации. Науч.- технический бюлл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии.- Тюмень, 1976. Вып. 7.- С.44-50. 13. Калинина Н.Г. Динамика иммунобиологических реакций при гиподерматозе крупного рогатого скота. Науч.-технический бюлл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии.- Тюмень, 1978. Вып. 14.- С.62-71. 14. Практикум по вирусологии / Под редакцией В.М. Жавненко.- Минск ДизайнПРО,1998.- С. 102. 15. Ямов В., Потемкин В., Калинина Н. Ранняя диагностика гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью реакции непрямой гемагглютинации. Науч.-технический бюлл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии.- Тюмень, 1976. Вып. 7.- С. 45-46. 16. Ямов В., Потемкин В., Калинина Н. Ранняя диагностика гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью реакции непрямой гемагглютинации. Науч.- технический бюлл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии.- Тюмень, 1976. Вып. 7.- С. 46-47. 17. Степанова Е.А. Иммунодиагностика, эпизоотология и ранняя профилактика гиподерматоза крупного рогатого скота Автореф. дис.канд. вет. наук 03.00.19 / Е.А. Степанова.- Минск, 2004.- С. 8-9 (прототип). 18. Иммунологические методы очистки белка / Под ред. Г. Фримеля Пер. с нем. А.П. Тарасова.- М. Медицина, 1987.- С. 338-348. 19. Грунин К.Я. Подкожный овод . Фауна СССР.- М., 1962.- 237 с. 20. Антипин Д.Н., Ершов , Золоторев Н.А., Саляев В.А. Ветеринарная энтомология. Паразитология и инвазионные болезни сельскохозяйственных животных / Под ред. В.С. Ершова.- 3-е изд. испр. и доп.- М. Колос, 1964.- С. 316-320. 21.//. . .- 1992.- . 3-17. 12 12492 1 2009.10.30 22.// . . .- 1992.- . 3-17. 23. Ершов , Антипин Д.Н., Золоторев Н.А., Саляев В.А. Ветеринарная энтомология. Паразитология и инвазионные болезни сельскохозяйственных животных / Под ред. В.С. Ершова.- 3-е изд. испр. и доп.- М. Колос, 1964.- С. 316-320. 24. Антипин Д.Н., Ершов , Золоторев Н.А., Саляев В.А. Ветеринарная энтомология. Паразитология и инвазионные болезни сельскохозяйственных животных / Под ред. В.С. Ершова.- 3-е изд. испр. и доп.- М. Колос, 1964.- С. 317. 25. Машковский М.Д. Лекарственные средства Пособие по фармакотерапии для врачей.- Минск Беларусь, 1987.- Т. 2.- С. 93-94. 26. Машковский М.Д. Лекарственные средства Пособие по фармакотерапии для врачей.- Минск Беларусь, 1987. - Т. 2.- С. 357-358. 27. Ветеринарные препараты / Под ред. А.Д. Третьякова.- М. ВО Агропромиздат,1988.- С. 240-246. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 13