Способ очистки почвы от дихлорфенолов

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ ДИХЛОРФЕНОЛОВ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Глушень Елена Михайловна Самсонова Алисса Самуиловна Алещенкова Зинаида Михайловна Смочкина Наталья Фдоровна Филипшанова Людмила Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56)90/10079 1..., 1986. - . 25. -1. . 68-75.2008252 1, 1991.2041943 1, 1995.3418 1, 2000. БЕЛЬКОВ В.М. Методы, технологии и концепции утилизации углеродсодержащих промышленных и твердых бытовых отходов, 2002 ////38 Каталог культур микроорганизмов. Мн., 2006. - С. 30-31.90/01465 1. ТОМСОН А.Э. и др. Физика и химия торфа в решении проблем экологии. Тез. докл. - Мн., 2002. - С. 158-160.(57) Способ очистки почвы от дихлорфенолов путем интродукции в загрязненную почву культуры микроорганизма-деструктора рода , иммобилизованной на носителе, отличающийся тем, что в качестве культуры микроорганизма-деструктора используют штаммБИМ В-299 Д, а в качестве носителя - торф. Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для микробиологической очистки почвы от хлорированных фенолов. Одним из способов интенсификации разрушения ксенобиотиков в почве является интродукция чистых культур микроорганизмов активных инициаторов деструкции токсикантов 2-4. В качестве интродуцентов широко используются представители рода 5-7. Эффективность деградации хлорфенолов значительно повышает иммобилизация клеток микроорганизмов-деструкторов. Иммобилизация дает возможность а) интенсифицировать процесс при высоких субстратных нагрузках б) осуществлять глубокую очистку в условиях низких концентраций веществ в) создавать условия, благоприятные для автоселекции штаммов, обмена генетическим материалом. Наиболее близким из аналогов изобретения по совокупности существенных признаков и достигаемому эффекту является способ биоремедиации почвы, загрязненной хлорированными фенолами с использованием микроорганизмов-деструкторов родаи, иммобилизованных на твердом пористом носителе из полиуретана и разрушающих хлорфенолы в концентрации до 186 мг/100 г почвы 1. Недостатками прототипа являются использование искусственного носителя для иммобилизации клеток микроорганизмов-деструкторов отсутствие у данного штамма способности разрушать хлорфенолы в концентрациях выше 186 мг/100 г почвы необходимость добавления в среду дополнительных источников питания для улучшения эффективности деградации токсикантов. Цель изобретения - повышение степени очистки почвы от хлорорганических соединений. Цель достигается путем иммобилизации микроорганизма-деструктора на природном носителе из торфа. Изобретение заключается в получении штаммаБИМ В-299 Д,деградирующего 2,3- и 3,4-дихлорфенол. Культура, иммобилизованная на носителе из торфа, полностью разлагает дихлорфенолы в концентрации 312,5 мг/100 г почвы, используя их в качестве единственного источника углерода. Успех интродукции основан на внесении в почву большого количества биомассы микроорганизмов-деструкторов, иммобилизованных на природном носителе из торфа, являющегося экологически безопасным материалом. Иммобилизация микроорганизмовдеструкторов на торфе защищает их от неблагоприятного воздействия физико-химических факторов окружающей среды, а используемый в качестве носителя торф стимулирует жизнедеятельность как аборигенных, так и интродуцированных микроорганизмовдеструкторов, что способствует эффективному разрушению ксенобиотиков и созданию условий для повышения плодородия почвы 8, 9. ШтаммБИМ В-299 Д выделен из почвы, подвергавшейся длительному загрязнению промвыбросами предприятия органического синтеза. В дальнейшем штамм подвергался адаптации к хлорфенолам в возрастающей концентрации, депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси подБИМ В-299 Д. ШтаммБИМ В-299 грамположительный, неподвижный. При развитии хорошо заметны изменения вида культуры типа кокки-палочки-кокки. Клетки через 18 ч роста на МПА прямые или слегка искривленные, иногда слабоветвящиеся располагаются часто -образно или палисадовидно, а также одиночно. Они быстро (через 24 ч) укорачиваются до кокковидных клеток. Штамм имееттип клеточной стенки. В клеточной стенке обнаружены галактоза, арабиноза, мезодиаминопимелиновая кислота(мезо-ДАПК), липид -. Колонии на МСА розово-кремовые, круглые, диаметром 15 мм, выпуклые, неблестящие, сухие. Консистенция мягкая, легко снимается с агара. Аэроб, некислотоустойчив, оксидазоотрицателен, имеет каталазу, уреазу, ДНК-азу,анаэробный тест Хью-Лейфсона отрицательный, желатин не разжижает, крахмал не гидролизует, но разлагает казеин, ксантин и тирозин. Образует кислоту из глюкозы, сахарозы, галактозы, ксилозы, мальтозы, маннита и глицерина, но не из арабинозы, лактозы,рамнозы, дульцита и сорбита. Усваивает натриевые соли органических кислот цитрат,пропионат, бензоат, лактат, ацетат, -кетоглутарат, но не оксалат. Восстанавливает нитраты в нитриты, растет на нитритном агаре, на безазотистой среде Эжби, в присутствии 5, не образует индол. Штамм устойчив к тетрациклину (10 ед.), слабо чувствителен к бензилпенициллину (10 ед.). Пример. В качестве носителя для иммобилизации микроорганизмов-деструкторов использовали торф осоковый (20-25 ,0,5-1,0 мм). Использовалась дерново-подзолистая почва Биологической опытной станции Института генетики и цитологии НАН Беларуси со следующими агрономическими показателями- 6,3 25 - 19,2 мг/100 г почвы К 2 О 15,8 мг/100 г почвы сумма поглощенных оснований - 4,9 мгэкв на 100 г почвы степень насыщенности основаниями - 68 гумус - 1,6 азот общий - 0,15 . 2 11836 1 2009.04.30 Хлорфенолы (0,3 ), культуру (5 мл) и торф (7 г) вносили в соответствии со схемой 1. Почва 312,5 мг хлорфенола. 2. Почва 312,5 мг хлорфенолакультура. 3. Почва 312,5 мг хлорфенолакультура, иммобилизованная на торфе. Компостирование загрязненной почвы вели в течение 50 дней в условиях постоянной температуры (25 С) и влажности (60 от полной влагоемкости). Образцы почвы для микробиологических и биохимических исследований отбирали в день закладки опыта и через 7, 14, 21, 28 и 50 суток. Хлорфенолы из почвы экстрагировали этиловым спиртом. Для качественного и количественного анализа галогенсодержащих соединений в почве использовали метод газожидкостной хроматографии на газовом хроматографе(ПИД и ДЭЗ),разработанный совместно с кафедрой биотехнологии и биоэкологии БГТУ. При применении пламенно-ионизационного детектора (ПИД) использовали капиллярную колонку НР длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, с нанесенной неподвижной фазой из полиэтиленгликоля толщиной 0,5 мкм. При работе с детектором по электронному захвату (ДЭЗ) использовали капиллярную колонку НР-5 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, с нанесенной неподвижной фазой из 5 бифенила и 95 диметилполисилоксана толщиной 0,25 мкм. Анализ образцов проводили в режиме программирования температуры от 100 до 200 С с целью определения как более летучих интермедиатов биотрансформации, так и высококипящих соединений. Исследования проводили в следующих условиях температура испарителя - 275 С температура детектора - 300 С начальная температура в термостате в течение 5 мин - 100 С нагрев до 200 С осуществляли со скоростью 10 С в мин изотермического режима достигали в течение 20 мин расход газа-носителя при 100 С - 0,78 мл/мин, а коэффициент деления потока - 110 объем вводимой пробы - 0,8 мкл. Ускорение разрушения 2,3- и 3,4-дихлорфенолов в почве осуществляли интродукцией в нее культурыБИМ В-299 (таблица). На 28 сутки культура родококка, интродуцированная в почву, загрязненную 2,3- и 3,4-дихлорфенолами в концентрации 0,3(312,5 мг/100 г почвы), способствует ускорению их разрушения на 22,95 и 35,8 соответственно по сравнению с контролем. Использование этой же культуры, иммобилизованной на носителе из торфа, обеспечивает ускорение деградации 2,3-и 3,4 дихлорфенолов за аналогичный промежуток на 91,05 и 95,65 соответственно. На 50-е сутки дихлорфенолы в почве не обнаруживаются. Таким образом, использование иммобилизованной на торфе культуры микроорганизма-деструктораБИМ В-299 позволяет осуществлять эффективную очистку почв, загрязненных высокими концентрациями монохлорфенолов. 11836 1 2009.04.30 Разрушение дихлорфенолов в почве культуройБИМ В-299 Д, иммобилизованной на торфе Содержание хлорфенола в почве,7 сут. 14 сут. 21 сут. 28 сут. 50 сут. 2,3-дихлорфенол Почва 98,4 98,4 98,4 93,75 92,05 ПочваБИМ 92,4 87,0 84,1 70,8 64,2 В-299 ПочваБИМ 64,5 33,9 10 2,7 0 В-299, иммобилизованный на торфе 3,4-дихлорфенол Почва 98,3 97,5 95,6 95,2 94,9 ПочваБИМ 96,2 81,9 66,2 60,0 54,3 В-299 ПочваБИМ 40,6 17,5 4,8 0,55 0 В-299, иммобилизованный на торфе Источники информации 1.90/10079 1. 2.... - 1986. - . 25. -1. - . 68-75. 3.2008252 1, 1991. 4. Бельков В.М. Методы, технологии и концепции утилизации углеродсодержащих промышленных и твердых бытовых отходов ////38 5. Каталог культур микроорганизмов. - Мн., 2006. - С. 30-31. 6.90/01465 А 1. 7.2041943 С 1, 1995. 8.3418 С 1, 2000. 9. Томсон А.Э. и др. Физика и химия торфа в решении проблем экологии. Тез. докл. Мн., 2002. - С. 158-160. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4